设计一个SOD的制备工艺及酶的分离纯化中要注意的问
题
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酶工程(二)
姓名:刘芳颖 班级:生物工程092 学号:2009016315 一、 设计一个SOD的制备工艺。
酵母泥 洗涤 酵母培养基 灭菌 酵母菌复壮 SOD纯化 SOD提取
啤酒酵母的预处理:啤酒废酵母菌和等量无菌冰水混匀进行80-100的目筛再进行离心分离，将无菌冰水注入到下层沉淀中，摇匀静置3-4小时，倾去上层悬浊液，进行冰水漂洗直到所得上层清液无色无味酵母呈纯白色为止，从而得到较纯的酵母菌菌体。 酵母的复壮培养:酵母培养基配方:葡萄糖8%，蛋白胨1%，酵母膏1%，蒸馏水1000ml在121?灭菌20min，按30,接种量接入经过洗涤后的酵母，恒温摇床培养28?140r/min2h，扩大培养，得到含SOD的湿菌体;
酵母SOD的提取:每1 g酵母湿细胞中加入9 mL异丙醇浸泡120mim抽滤除去溶剂，加入三倍体积的50mmol/l磷酸钾缓冲液(PH7.0)，搅拌120min离心除去菌体制成SOD粗提液 SOD纯化:SOD粗提液用2mol/lHCL调节PH至5.0，加入丙酮搅拌摇匀，离心(5000r/min)取上清液调PH至4.0，加入丙酮二次沉淀，离心(5000r/min)SOD纯化产品。
二、酶的分离纯化中要注意什么问题，为什么要进行酶活力及酶比活力的测定,
在酶分离纯化过程中，一个非常重要的问题是保护酶的活性，不使酶在纯化的过程中失活，因此酶提取纯化应注意以下问题:
1) pH值，选择酶最稳定的pH值，确定合适的缓冲容量的缓冲溶液; 2) 温度，一般来说0?时酶比较稳定，一般在0,4?时操作;但有例外，如丙酮酸羧化酶，在0?时不稳定，而在260?时稳定;
3) 防止氧化:多含—SH，可加入β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等进行保护;
4) 避免重金属污染:主要注意溶液的配制，亦可加入EDTA络合去除; 5) 蛋白酶的污染:加入蛋白酶抑制剂如PMSF(苯甲基磺酰氟)、DFP(二异丙基氟磷酸)或胰蛋白酶抑制剂;
6) 介质的极性和离子强度:
要求
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疏水环境可使用蔗糖、甘油等降低溶液的极性;需要提高离子强度的极性介质，可加入KCl、NaCl来调节。
要进行酶活力及酶比活力的测定的原因:
一方面，防止酶变性失活。一旦活力明显下降，就要考虑换一种纯化方法; 另一方面，计算纯化效率。通过总活力和比活，评估纯化效率，寻找最佳方法
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