巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达系统研究进展 生物.畜牧2009年第l2期绦色大世界?绿色{斗技 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 方园园 (辽宁医学院畜牧兽医学院,辽宁锦州121000) 摘要:经过近2O年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)已经成为目 前最成功的真核表达系统之一,被 广泛用于医药生产,饲料添加剂开发和科学研究.介绍了毕赤酵母的生物学特性, 常用菌株和表达载体的特点及其研究 进展.并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势. 关键词:毕赤酵母;表达载体.夕源蛋白 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005—569X(2009)12—0037—03 l引言 巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄 糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母 菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基 中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0,8.0),有较 好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体 密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一 般为28430?,是常用的外源蛋白表达系统. 2巴斯德毕赤酵母宿主菌株 根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三 种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整 的AOX和AOX基因,在含甲醇的培养基中生长速 率与野生型类似,称为甲醇利用正表型.绝大多数毕 赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二 型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOx基因部分敲 除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOx:虽然与 AOX,有97的同源性,但在含甲醇的培养基内该型 毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KMT1 (himarg4aoxl::ARG4);第三型,即MUt一型,此型 毕赤酵母AOX及AOX.基因均被敲除,细胞不能进 行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型, 如MC100—3(his4arg4aoxl::ARG4aox2::Phis4). 后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少, 有时其表达量甚至高于Mut+型.三型菌株在AoXt 启动子调控下均可诱导异源蛋白的表达.对这三种菌 株的进一步改造,还可得到其它衍生宿主菌,现已获得 十几种不同基因型的衍生宿主菌.目前,使用最,泛 的巴斯德毕赤酵母宿主菌是Cregg在l985年建立的 GS1l5,它具有组氨酸脱氢酶缺陷型基因HiM,可接 受His4的载体而具有His表型. 3毕赤酵母表达载体 毕赤酵母菌体内无天然质粒,所以表达载体需与 宿主菌染色体发生同源重组,将外源基因表达框架整 合于染色体中以实现外源基因的表达[1].表达载体主 要元件包括:启动子,多克隆位点,终止序列,选择标志 以及可以诱导基因发生重组的同源序列. 表达载体都是穿梭质粒,先在大肠杆菌中复制扩 增,然后被导入宿主酵母细胞.因此,表达载体还含有 大肠杆菌质粒的复制 单元 初级会计实务单元训练题天津单元检测卷六年级下册数学单元教学设计框架单元教学设计的基本步骤主题单元教学设计 (ColE1)以及筛选大肠杆菌 转化子的标记(如Amp,Kana).若要表达产物分泌 到细胞外,表达载体还需携带信号肽序列. 3.1启动子 目前最常用的启动子是来源于巴斯德毕赤酵母醇 氧化酶基因的启动子P.,.它是一个很强的启动子, 能非常有效地控制外源基因的表达.虽然利用P 已成功表达了多种外源蛋白,但以P.,为启动子的表 达系统还有一定缺陷,例如不适用于食品生产,添加甲 醇诱导时存在火灾隐患.3一磷酸甘油醛脱氢酶基因 的启动子Pc是Waterham等近年来克隆成功的一个 构成性表达的启动子,它突出的特点是发酵过程操作 简便,可以连续表达,无需诱导.利用PG表达外源 基因主要的限制是目的蛋白不能对宿主菌有毒性,否 则在长期的发酵过程中将限制其生长. Shen等又克隆出FLD1(谷胱甘肽依赖性甲醛脱 氢酶基因)启动子,它具有与AOX启动子相同或更 高的强度,能在甲胺(葡萄糖,甘油等)或甲醇为唯一碳 源的情况下表达,甲胺不易挥发,更适于摇瓶研究.这 三种启动子都是导致外源基因过高表达的启动子,但 有研究发现,某些外源基因可因被启动的表达水平过 高,而导致目的蛋白折叠失准,加工无能或定位错误. 因此,近年来人们又研制了启动基因柔和表达的启动 收稿日期:2009—1119 作者简介:方园同(1980),女,广西钦州人,讲师,主要从事动物营养与饲料方向的研 究. 37 方园因:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展2009年第12期生物?畜牧 子如PEX8和YPT1启动子,但它们的表达水平要低 于上述三种强启动子.这些启动子各有优缺点,在实 验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 中应根据自己的需要选择合适的启动子. 3.2选择标志 常用的选择标记可以分为两种:?营养缺陷型选 择标记,如来源于巴斯德毕赤酵母的HIS4基因和来 源于酿酒酵母的ARG4基因和SUC2基因;?抗性选 择标记,如来源于大肠杆菌Tn903能够使真核细胞对 卡那霉素家族成员G418产生抗性的kanr基因,又如 来源于印度斯坦链异壁菌(streptoa1loteichushin- dustanus)能够使细菌和真核细胞对博莱霉素家族成 员Zeocin产生抗性的Shbler基因,但Zeocin是一种 强诱变剂,可能导致转化子产生不可预料的突变.近 来,还成功获得一系列新的营养筛选标记,如巴斯德毕 赤酵母氨基咪唑琥珀酸草酰二胺合成酶基因(ADE1) 和乳清酸核苷一5&一磷酸脱羧酶基因(URA3). 3.3信号肽 分泌性的外源蛋白可以采用自身的信号肽来实现 分泌,但是大多数外源信号肽不能在毕赤酵母中有效 表达,可以考虑采用酵母自身的信号肽.由于毕赤酵 母表达的分泌性蛋白很少,不易找到合适的信号肽,从 酿酒酵母分离到的a一交配因子前导肽,它不仅可以 介导蛋白质沿分泌通路分泌到细胞外,而且在分泌过 程中可以被自身的膜蛋白酶Kex自动切割去除. 如果表达胞内蛋白的话就不需要信号肽了,可以 在目的蛋白前加一个定向肽(peroxisometargeting— signal,PTS),可以把目的蛋白聚集到微体中,既避免 了胞内过量积累外源蛋白对细胞正常生理功能的影 响,又可以保护外源蛋白免受胞内蛋白酶的降解. A0X是甲醇诱导型的可以通过控制甘油和甲醇的比 例来控制外源蛋白的表达. (3)分泌效率高.采用酿酒酵母a成熟因子(0t— MF)信号序列可以实现大多数蛋白的分泌表达,也有 采用外源蛋白自身信号肽来分泌并获得成功的例子, HAS[,转化酶[4,52,牛的溶菌酶[. 如 (4)自身分泌的蛋白较少.细胞外大部分是目的 蛋白,而且营养要求简单,培养基中其他的蛋白成分 少,背景比较干净清楚,这就为下游分离纯化蛋白提供 了便利. (5)糖基化更接近蛋白的天然状态[7],糖基侧链较 酿酒酵母短约为它的2O[8],作为药物治疗时不会引 发免疫反应. 此外,毕赤酵母偏好有氧的生长环境,菌体可以达 到很高的密度(细胞干重可达lOOg/L以上),适应较 宽的pH(3.0,8.O),这些特点使得毕赤酵母适于大 规模的工业发酵来产生大量的外源蛋白. 但是毕赤酵母表达系统也有一些不尽如人意的地 方需要改进: (1)甲醇做诱导物存在安全隐患.甲醇有毒过量 能够导致失明,表达一些口服药物以及食品蛋白时往 往不能被人们接受,而且甲醇易挥发,为大规模的工业 化生长带来了火灾的遗患. (2)毕赤酵母的遗传背景还没有酿酒酵母那么清 楚,为开展实验带来了诸多不便. (3)目前有越来越多的低表达或不表达的报导出 现,比如多瘤病毒大T抗原,还有的甚至不能表达(如 HIV表面糖蛋白)L9j.影响蛋白表达量的因素很多, 需要不断摸索寻找最佳表达条件,实际操作很繁琐. 4利用毕赤酵母表达外源蛋白的优缺点5结语 毕赤酵母作为一个真核表达系统既具有原核表达 系统生长力旺盛,对营养物质的要求低,生活周期短, 易培养的优点,也具备其作为近几年来广泛应用的表 达系统的独特优势,可以对表达的外源蛋白进行加工 修饰使蛋白更接近天然的状态,形成有活性的蛋白. 与第一代真核表达系统酿酒酵母相比,毕赤酵母表达 系统具有以下优势: (1)稳定性高.由于毕赤酵母没有游离的质粒,外 源基因进入细胞后通过交换整合进入酵母的基因组中 成为毕赤酵母基因组的一部分,外源基因不会丢失,遗 传稳定性好. (2)表达量高.在毕赤酵母中采用了AOX启动 子作为外源基因的启动子,AOX启动子是一个强启 动子,在甲醇诱导下可以实现外源基因的高效表达,比 100倍].而且由于 以往的表达系统提高了lO, 38 巴斯德毕赤酵母是一种嗜毕赤酵母,起初是菲利 普石油公司为了生产家畜饲料单细胞蛋白而开发的, 它可以在以甲醇为唯一碳源的培养基中生长.自1987 年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗 原(HBsAg)以来,国内外已有数百种外源蛋白获得表 达. 巴斯德毕赤酵母表达系统的诸多优势使之越来越 受到关注,其研究和商业价值亦不断体现.近年来,随 着对该甲醇营养酵母分子遗传学研究和认识的进一步 深人和实践经验的不断积累,巴斯德毕赤酵母基因表 达系统的应用范围大大加宽,表达产物除了人畜药用 制品外,还包括来自植物,动物和细菌的各种酶,膜受 体蛋白,含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的 蛋白质等,它还可以同时表达酶组分比例适当的一个 酶系而以全细胞作为生物催化剂,对整个生命科学和 人类健康产生重要影响.同时我们也相信,该表达系 生物.畜牧2009年第12期熊色大世界?绦色幸斗技 统必将在我国21世纪基因工程真核表达产品产业化, 商品化进程中,发挥越来越大的作用. 参考文献: 『1]欧阳立明,刘志敏等.巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展 [刀.生物化学与生物物理进展.2000,27(2):151,154. [2]ClareJJ,RomanosMA,RaymentFB,eta1.ProductionofT~2ouse epidermalgrowthctorinyeast:high—levelsecretionusing Pichiapastorisstrainscontainingmultiplegenecopies.Gene, 1991,vo1.105(2):205,212. 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[93KellerG.Invitrodifferentiationofembryonicstemcells.Curr OpinCel1Bio1.1995,vo1.7(6):862,869. 生态立省以林富民 —— 湖北省造林绿化现场会在成宁召开 2009年12月16日下午,湖北省人民政府在咸宁市召开全省造林绿化现场会,副省长赵斌, 省政府副秘书长梅祖恩,省林业局局长王海涛,成宁市委书记黄楚平,省财政厅副厅长王华新,省 林业局副局长董祚华,咸宁市委常委统战部长胡建华等领导以及全省各市县分管林业工作的政 府领导,林业局长出席会议,会议由省政府副秘书长梅祖恩主持. 副省长赵斌在会上作了重要讲话.他指出,植树造林,绿化祖国,功在当代,利在千秋.各地,各 部门要以科学发展观为统领,认真贯彻落实中央和省委林业工作会议精神,进一步解放思想,开拓创 新,强化措施,扎实工作,努力开创造林绿化工作新局面.他强调,当前和今后一个时期,湖北省造林绿 化工作的指导思想和总体目标是:以科学发展观为指导,深入贯彻落实中央和省委林业工作会议精神, 紧紧围绕"生态立省"战略,坚持全社会办林业,全民搞绿化,以兴林富民为宗旨,大力开展植树造林,高 质量实施国家和省级重点生态工程,高标准抓好"原生态,多色彩,宽林带"的大林带建设,让荆楚大地 有更多的绿色,农民收入进一步提高,人居环境更生态,经济发展更低碳.赵斌还就进一步加大力度开 创造林绿化工作新局面提出了四点要求:一是加强组织领导,全面落实造林绿化目标责任考核.政府 主要领导是第一责任人,分管领导是直接责任人.各级各部门领导都要树立"为官一任,造绿一方"的 执政理念,强化"造好一片林,树起一座丰碑"的责任意识,切实把造林绿化摆上重要位置,纳入全局工 作中谋划部署.要进一步强化造林目标责任管理,把任务层层分解,落实到各级组织.二是创新投入 机制,全面提高林业聚集社会资源的能力.各级政府和有关部门要按照事权,财权划分和分级负责的 原则,对造林绿化工程的投入做长期安排.要把造林绿化工程与其它重点建设工程结合起来,合理利 用工程建设资金,并向重点区域的造林绿化倾斜.要坚定不移地推进各项林业改革,进一步畅通林业 投融资渠道,创新造林绿化投入机制.三是落实工作责任,形成齐抓共管的工作合力.各有关部门和 单位要按照政府的统一部署,落实绿化分工负责制,主动抓好造林绿化.各级绿化委员会及其办公室 要充分发挥组织协调职能,当好政府的参谋和助手.四是加大宣传力度,营造全社会造林绿化的浓厚 氛围.要利用电视,报刊,网络等新闻媒体,通过举办专题讲座,制作广告牌,印发宣传 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 等多种形 式,广泛宣传,组织发动,逐步使造林绿化成为全社会的自觉行动.要大力营造"青年林","三八林", "学生林",大力培育和树立先进典型,发挥"点亮灯一盏,照亮一大片"的示范带动作用. (下转44页) +-+--~---—卜一—+一?-+--—?卜一+--+-.+一+一+一十一十一+"——卜…-4.-—卜一—+_"—一—卜一—卜一—卜一—?卜一-+--—?卜一—+…—卜—?卜一一一+一—?卜一—?卜"+一+一+一—卜——卜一——卜一——卜"-4-_-4--—-卜一-4-- 39 ? T,?T?..t?,十?tT?T,.t; ? + _+