解脂耶氏酵母表达系统研究进展

解脂耶氏酵母 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达系统研究进展 May2008 ? 10? 生物加工过程 ChineseJournalofBioprocessEngineering 第6卷第3期 2008年5月 解脂耶氏酵母表达系统研究进展 赵鹤云,黄瑛,杨江科,徐莉,闫云君 (华中科技大学生命科学与技术学院,教育部分子生物物理重点实验室,武汉 430074) 摘要:解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是非常规酵母中具代表性的一种,它底物 广泛,尤其能利用有机酸(柠檬 酸,并柠檬酸),蛋白类(蛋白酶,脂肪酸,酯酶,磷酸酶,O/一甘露糖苷酶,RNase).烷烃 类廉价物质作为底物分泌大量 的代谢产物,自上世纪40年代被发现以来,越来越受到研究者的重视,并于上世 纪90年代被开发成为一种新的酵 母表达系统,用于42种异源蛋白的高效表达.综述了解脂耶氏酵母表达系统及其 特点,有利于研究者从转录和翻 译的水平研究并源蛋白在此茵中的表达分泌路径以及寻找到调控型启动子. 关键词:解脂耶氏酵母;表达系统;异源蛋白表达 中图分类号:Q36文献标识码:A文章编号:1672—3678(2008)03—0010—07 ReviewofYarrowialipolyticaexpressionsystem ZHAOHe—yun,HUANGYing,YANGJiang—ke,XULi,YANYun-jun (CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongScienceandTechnologyUniversity,Wuhan430074,China) Abstract:TheascomycetousyeastYa~owialipolyticaisarepresentativeoneofnon—conv entionalyeasts. Anextensivedescriptionofassimilatedsubstrateshasbeendone.Yarrowialipolyticahasmanycharacter- istics,forexample,itsecretslargeamountsofmetaboliteswhenusecheapsubstrates.Astrongindustrial interestarosefromthefactthatstrainsofthisspecieswereabletousenormalparaffinassolecarbon source.Yarrowialipolyticawasdevelopedintoanewyeastexpressionsystemin1990S.Ithasbeenused toexpressabout42heterologousproteinssuccessfully.ThecharacteristicexpressionsystemofYarrowia lipolyticawasreviewed,whichisusefulinstrumentfortheinvestigationofheterologusprot einsecretion andregulationattranscriptionalandtranslationalleve1. Keywords:Yarrrowialipolytica;expressionsystem;heterologousproteinexpression 解脂耶氏酵母于1942年首次被分离得到,先后 被命名为Candidalipolytica,Endomycopsislipolytica, Saccharomycopsislipolytica,最终定名为YarrowiaZ0一 ica(解脂耶氏酵母)J.解脂耶氏酵母是非常规 酵母中的一种.所谓非常规酵母是除了酿酒酵母 和粟酒裂殖酵母之外的所有酵母的总称,包括:毕 赤酵母,乳酸克鲁维酵母,解脂耶氏酵母等J.解 脂耶氏酵母的优点在于:1)解脂耶氏酵母被认为 是安全的(generallyregardedassafe),因此,能用于 食品和药物生产上;2)它能大量分泌多种代谢产 物,自上世纪60年代就开始用于食品,SCP(single— cellprotein)等的工业化生产;3)它能利用很多普通 的碳水化合物和脂肪作为碳源,这也使得它更适合 于不同的工业应用;4)它是非常规酵母中离酿酒酵 收稿日期:2007—12—10 基金项目:国家863计划资助项目(2006AA020203,2007AA05Z417);武汉市攻关资助项目(200720422138) 作者简介:赵鹤云(1979一),女,河南驻马店人,博士研究生,研究方向:脂肪酶分子生物学. 联系人:闫云君,教授,博士生导师,E—marl:yanyunjun@tom.corn 2008年5月赵鹤云等:解脂耶氏酵母表达系统研究进展’11? 母最远的一个种属,这就提供了一个非常独特的视 角来研究半子囊菌纲的进化过程和保守性;5)其全 基因组序列和线粒体序列已测定;6)迄今为止,学 者们对它的代谢过程,蛋白分泌途径,过氧化物酶 体,二态性信号转导途径等生化和分子方面进行了 较透彻的研究;7)在解脂耶氏酵母中共转运占主导 地位,糖基化程度低,这类似于高等真核生物;8)解 脂耶氏酵母以其不同于其它酵母的特性成为研究 酵母形态学,蛋白分泌,线粒体复合体I及过氧化 物酶体的模型.目前,它已被用于多个领域,如 SCP(single.cellprotein)和SCO(single—celloil)的生 产,烷烃和脂肪酸转化,内酯类绿叶调(green—notes) 香料的生产,中间代谢产物苹果酸(citricacid,CA), 异苹果酸(isocitricacid,ICA),2.酮戊二酸(2-ketogl— utaricacid,KG),丙酮酸(pyruvicacid,PY)等的生 产,生物降解,精细化工,农产品和食品加工,酿造 等方面,并且上世纪90年代将其成功地开发为一种 新的优良酵母表达系统.本文就解脂耶氏酵母的 分子生物学及其表达系统进行综述介绍. 1解脂耶氏酵母表达系统的特征及与其他酵 母表达体系的差异 1.1解脂耶氏酵母的分子生物学特性 解脂耶氏酵母在分子生物学方面与其他酵母 相比差异较大J.它的基因组G.C含量较高 (49.6%一51.7%),且rDNA结构较其它酵母特殊, 没有RNA聚合酶I序列,snRNA和7sRNA大小与 高等真核生物的较接近,而与S.cerevisiae,lactis, C.albicans氨基酸同源性只有50%一60%.由于 RNA聚合酶?启动子和转录因子与S.cerevisiae的 差异较大,故解脂耶氏酵母的基因几乎不能在5. cerevisiae中进行表达.有约13%的基因含有内含 子,密码子偏爱性不同于酿酒酵母,而类似于曲霉 菌;其他方面的知识详见1996年Springer出版的 《NonconventionalYeastsinBiotechnology)一 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf . 1.2解脂耶氏酵母表达系统的特性及与其他酵母表 达系统的比较 至今,酵母表达系统包括:常规酵母Saccharo. mycescerevisiae和Schizosaccharomycespombe表达系 统,非常规酵母Hansenulapo~morpha,Klyveromyces lactis,Schwanniomycesoccidentalis,Yarrowialipolytica 和Pichiapastoris表达系统.Buckholz等对上述 酵母表达系统进行综述介绍.DomAnguezAngel 等则对Saccharomycescerevisiae,Kluyveromyceslac— tis.Yarrowialipolytica,Hansenulapolymorpha和 Pichiapastoris表达系统从宿主菌及其生活史,转化 方法,质粒是游离/整合,启动子,mRNA5’和3’UTR 序列,密码子偏爱性,RNA稳定性,分泌信号以及糖 基化情况等方面进行全面细致的分析,并分别单独 介绍了各种表达系统.MfiUerSven等对Saccha— romycescerevisiae,Schizosaccharomycespombe, Kluyveromyceslact~,Hansenulapolymorpha和Yarrow— ialipolytica表达系统进行了比较分析,并分别表达 了6种真核基因,依据转化成功率,质粒稳定性,所 表达有活力蛋白的产量,以及糖基化情况等来判断 这5种表达系统的优劣.综合这些方面,Mtiller Sven等认为Yarrowialipolytica是这5种表达系统 中最好的一种.该表达系统具有以下特点:1)质粒 能进行多位点整合,且遗传稳定,使得异源蛋白产 量较高;2)有强组成型启动子易于调控;3)宿主菌 适合高密度发酵培养;4)常用宿主菌均被剔除胞外 碱性蛋白酶基因(有的胞外酸性蛋白酶基因也被剔 除),使得表达的异源蛋白不易被蛋白酶降解;5)糖 基化与毕赤酵母类似,基本为低度糖基化;使得此 表达系统有应用于医药业的潜力;6)全基因组序列 和线粒体基因序列都已测定. 由于其在分类学上的特殊位置及其在分子生 物学上的特点,有些在毕赤酵母中难以表达的异源 蛋白可以在此表达系统中进行尝试. 2解脂耶氏酵母表达系统 由于解脂耶氏酵母能利用烷烃等多种常见的 廉价物质作为底物,且能分泌大量的有机酸和蛋白 质等代谢产物,所以人们在20世纪90年代将其开 发成为一种新的优良酵母表达系统.表1[2列出了 截止到2003年已成功表达的异源蛋白数量2 种.法国CatherineMadzak教授的实验室(UMRMi— crobiologieetG6n6tiqueMol6culaire,Thiverval Grignon)与台湾益生生技开发股份有限公司(YE. ASTERNBiotechCo.,Ltd)合作将其表达系统商业 化,于网站上 出售. ? 12?生物加工过程第6卷第3期 病毒HepatitisBviruspre-HBsantigen(3.0×10) BacteriophageP1Crerecombinase(4.1×10 E.coliJB-galactosidase(1.16×10) E.coliTn5phleomycinresistancegene E.coliJB.glucuronidase(6.8×10) 真细菌E .c.hygromycinBresistancegene E.coliXylEc~echoldioxygenase E.coliamylolyticenzyme(8.5×10) 单位点整合质粒/分批发酵:(.)” 自主复制型质摇瓶:[胞内表达:+] 单位点整合质粒:[胞内表达:800,4000U] 单位点整合质摇瓶:[胞内表达:+] 单位点整合质粒/摇瓶:[胞内表达:+] 自主复制型质粒和单位点整合质粒/摇瓶 [胞内表达:+] 单位点整合质摇瓶:[胞内表达:+] 单位点整合质摇瓶:[胞内表达:1g/L] 表1中:1)质粒类型为当用启动子缺陷型标记 基因时.整合型质粒可以是单位点整合也可以是多位 点整合.自主复制型质粒(centromericreplicativevec- tots(Rep))在每个细胞中可以稳定含1,3个拷贝; 2008年5月赵鹤云等:解脂耶氏酵母表达系统研究进展?13? 2)转化子用摇瓶或生物反应器(分批或补料发酵)进 行培养,若无特别说明,此表中显示的酶活为发酵上 清液的活力;若外源蛋白没有信号肽而表达到胞内则 特别注明;3)HBs抗原在胞内聚集,组装成为大球形 (Daneparticles);4)转化后的lipolytica生长 颗粒 速率和平均生物量都比较高;5)在S.cerevisiae中, 转化酵素(invertase)主要分泌到周质和细胞壁处 (periplasm和cellwal1),只有18%分泌到胞外;6)在 单克隆整合质粒转化的lipolytica中,cytochrome 1A1的活力与S.cerevisiae的基本相同,但同时产生 的cytochromeP450reductase却是S.cerevisiae的2.4 倍;7)在多克隆整合质粒转化的lipolytica中,cy— tochrome1A1的活力是单克隆整合质粒转化的li— p0c口的24倍,同时产生的cytochromeP450redue— tase比它增加了60,120倍;黑体字在解脂耶氏酵母 表达系统中表达同一种外源蛋白质时,可以选择不同 的启动子和信号肽,得到的表达量也不相同,黑体字 代表此种外源蛋白在选择不同的启动子和信号肽进 行表达时得到的最高表达量. 2.1宿主菌… ,孢 野生型解脂耶氏酵母菌间很难结合,即使结合 子的成活率也很低,所以人们利用同系繁殖(inbreeding programs)的方法开发出了几个不同的菌系(inbred lines),同一个菌系的菌株结合率及孢子成活率大大提 高.主要的蛋白质表达系统常用的菌系如下. Pold系:此菌系的遗传背景使得异源蛋白质能得 到高水平的表达.编码能水解其它蛋白质的AEP基 因被剔除,使得外源蛋白能更好地表达.在此菌中整 合转化酵素后,它能利用蔗糖作为底物,意味着它可 以利用糖蜜这样廉价的物质,这一特性推动了此工程 菌在工业上的广泛应用.人们将Pold系改造,生成 一 系列的派生菌系,如Polg,Polh,Poff.Polg被改造 为适合以pBR322为基础的质粒整合的菌系,Polg和 Polh只有一个营养缺陷型基因,Polh和Polf将穿梭 质粒的细菌部分在整合人酵母前剔除掉,形成酵母框 (yeastcassette);Polg,Polh,Polf系在Pold系的基础 上均被剔除了酸性蛋白酶基因,消除了全部蛋白酶活 性.表2为在解脂耶氏酵母异源表达系统中成功应 用的宿主菌及其表型. 2.2质粒 解脂耶氏酵母无天然质粒,也无除基因组外的 游离DNA.该表达系统中所用质粒分为两种:自主 复制型质粒和整合型质粒.自主复制型质粒由 ARS和CEN组成,是该表达系统最早的质粒,但自 主复制型质粒有很多缺点:质粒拷贝数较低,一般 为l,3个/细胞;能表达的基因有限;表达时需要外 在选择性压力.这些均阻碍了其在工业上的应用. 为此,人们随即又开发出了整合型质粒.按整合位 点的不同,可以分为单位点整合质粒和多位点整合 质粒.整合质粒可进行同源整合和异源整合,且在 表达系统中稳定存在,在无选择性压力条件下,传 100代后仍无质粒丢失.多位点整合能很大地提高 外源基因的表达量.多位点整合有3种整合位点, Zeta位点,rDNA簇位点和单一的XPR2位点. 解脂耶氏酵母对大多数常用的抗生素均有抗 性,所以一般选择营养型标记,如LEU2,URA3,也有 用SUC2的. 启动子是质粒重要组成部分,它的强弱性质在 很大程度上影响了所表达蛋白的表达量.pXPR2 是解脂耶氏酵母中研究最久,最常用的强启动子, pXPR2编码胞外蛋白酶,早期开发出的工程菌一般 都用此启动子,但它的调控很复杂,只有在培养基 pH大于6,最适碳氮源耗尽,且有大量蛋白胨存在 时,它才能被完全激活.Hp4d是由4个pXPR2的 UAS1串联再加上LEU2启动子(精简到只有TATA box)杂交形成的组成型强启动子,它几乎可以在所 有的培养基条件下使用,它介导的异源蛋白基因一 般在稳定期前期表达,能一定程度上避免外源蛋白 对细胞的毒害作用.pICL1,pPOT1,pPOX2均为诱 导型的强启动子.pPOT1,pPOX2能被脂肪酸,烷烃 等诱导,被葡萄糖和甘油所阻遏;pICL1除了能被脂 肪酸,烷烃诱导外,还可被乙醇和醋酸强烈诱导. 它们的缺点是在表达不同的外源蛋白时需要不同 的诱导物,这使得它们较难应用于大规模的工业生 产.此外,还有TEF和RPS7启动子,两者为强组成 型启动子,但它们的作用是从表达水平分离酶基 因,还不能用于异源表达. 分泌到胞外的蛋白质需要分泌信号,在解脂耶氏 酵母中成功应用的分泌信号包括异源和同源分泌信 号.自身分泌信号有:XPR2preproregion,XPR2pro. region,LIP2preproregion,XPR2和UP2preproregion 的杂交.有实验证明同源分泌信号比外源分泌信号 更有效.用XPR2preproregion信号肽表达蛋白时, 表达后分别由diamino.peptidase和Xpr6pendopro. teinase在XA,XP和KR(X为任意氨基酸;A为ala. nine;P为proline;K为lysine;R为arginine)位点将 生物加工过程第6卷第3期 信号肽切除,生成成熟的蛋白质.表3列出了各种应用于解脂耶氏酵母改造的质 粒组成及其特点. 表2在解脂耶氏酵母异源表达系统中成功应用的宿主茵及其表型 Table2lipolyticastrainsusedforheterologousexpression 菌彬基因型表型 StrainsissuedfromPfizer(Groton,USA)inbreedingprogram(unpublished) PC30869(ATCC20774) 1002,bio-6 MatB,leu2-40,xpr2— DL118(ATCC20794) MatB,2eu2-40,r2—1002,bio一6::BIO StrainissuedfromOgrydziaketa1.(UniversityofCalifornia,Davis, USAinbreedingprogram SMs397A MatA,adel,ura3,xpr2 StrainissuedfromBartheta1.(UniversityofTechnology,Dresden,Ger- many)inbreedingprogram 12A/213 B2O4— MatB,leu2—17,ura3—12 StrainsissuedfromGaillardineta1.(INAPG,Grignon,France)inbreed- ingprogram 2】50】_4 MatB,5—12,leu2—35,adel,印r2—34 21101-9 MatA,2—5,leu2—35,lycl一5,adel,r2 AM3 MatA,l1—23,leu2—270,ura3—302 AM4 MatB,hisl,leu2-270,ura3—302 JM23 MatB,5—12,leu2—35,ura3—18,r2:~LYS5 JM23SB MatB,5—12,leu2—35,ura3—18::A3,印r2::m INAG33122 Mate,2—5,leu2—35,adel,xpr2 E129 MatA,lysl1-23,leu2—270,ura3—302,xpr2—322 Pold(CLIB139) MatA,leu2-270,ura3—302,印r2—322 Poll6(CLIB724) MatA,leu2—270,ura3—302,xpr2—322,axpl-2 Polg(CLIB725) MatA,/eu2-270,ura3—302::URA3,印r2—322,axpl一2 Polh.’CLIB882)’ MatA,ura3—302,xpr2—322,axpl一2 DeletedforAEP Leu一,Bio一,AAEP DeletedforAEP,pBRdockingplatform Leu一,AAEP,pBR322 DeletedforAE Ade一,Ura一,AAEP Leu一,Ura DeletedforAEP Lys一,Leu一,Ade一,AAEP DeletedforAEP Lys一,Leu一,Ade一,AAEP t.rowmonsucrose,,.1’J Lys一,Leu一,Ura一,Sue Growthonsucrose His一,Leu一,Ura一,Sue DeletedforAEP .Ura一.?AEP Leu一 DeletedforAEP,pBRdockingplatform Leu一,AAEP,pBR322 DeletedforAEP Lys一,Leu一,Ade一,AAEP DeletedforAEP,growthonsucrose Lys一,Leu一,Ura一,AAEP,Sue DeletedforAEP,growthonsucrose Leu一,Ura一,AAEP,Sue Deletedforbothextracellularproteases,growth Leu一,Ura一,AAEP,AAXP,Sue Deletedforbothextracellularproteases,growthon sucroseb,pBRdockingplatform Leu一,AAEP,AAXP,Sue,pBR322 Deletedforbothextracellularproteases,growth Ura一.AAEP.AAXP.Sue 表2中:1)由PC30869菌改造而成(将pLD56 质粒插入其中),改造后支持pBR-based质粒整合人 基因组;2)等位基因ura3-302对应于ura3:: pXPR2:SUC2,将S.cerev~iae的SUC2基因放到启 动子XPR2下游,并插入URA3基因中使其失去原 有功能,这使得新的lipolytica菌株能利用蔗糖或 糖蜜作为碳源;3)由JM23菌改造而成(将 plNA300’质粒插入其中),改造后支持pBR-based 质粒整合人基因组;4)来源于W29(ATCC20460, MatA);5)CLIB:CollectiondeLevuresd’lnt6r~tBio— 2008年5月赵鹤云等:解脂耶氏酵母表达系统研究进展 technologique(CBAI, Gfgnon,France);6)由 其AXP1基因删除);7) INAPG,78850Thiverval- Pold系菌株改造而成(将 由Polf系菌株改造而成 (将plNA300’质粒插入其中),改造后支持pBR- based质粒整合入基因组;8)由Polf系菌株改造而 成(将其基因leu2-270改为LEU2). 表3应用于解脂耶氏酵母改造的质粒组成及其特点 Table3Componentsavailableforlipolyticaexpression/secretionvectors 组成特点 Markergenes LEU2,URA3,LYS5,ADE1 ura3d4 PhleoR,卸九(Ecoli) SUC2(cerevisiae) Promoters(source) pLEU2 (B—isopropylmalatedehydrogenase) 丝 (alkalineextracellularprotease) 巳卫 (respectively,acyl—CoAoxidase2, 3-oxo—acyl—CoAthiolase) plCL一 1 (isocitratelyase) pPOX1,pPOX5 (acyl—CoAoxidases1and5) pG3P (glycerol一3一phosphatedehydrogenase) 巡 (bidirectional:metallothioneins1and2) hp4d (hybridpromoterderivedfrompXPR2) pTEF,. pRPS7 (respectively,translationelongationfactor一1一, ribosomalproteinS7, Secretionsignals Native XPR2prepro XPR2pre+dipeptide XPR2p— r — e LIP2prepro Terminators XPR2t.HP2t.PHo5t MinimalXPR2t Elementsformaintenanceinyeastcells ARS18,ARS68 Homolo~to~enome Auxotrophycomplementation Item+copynumberamplification(cf.text) Antibioticresistance(respectively,tophleomycinandhygromycinB) Sugarutilization Induciblebyleucineprecursor Induciblebypeptones Induciblebyfattyacidsandderivatives,andalkanes Induciblebyfattyacidsandderivatives,alkanes,ethanolandacetate Weaklyinduciblebyalkanes Induciblebyglycerol Induciblebymetallicsalts Growth--phase--dependent Constitutive Frequentlyefficientinlipolytica 13aapre/10XAorXPdipeptides/122aapro/KRcleavagesite 13aapre/5—10XAorXPdipeptides 13aapre/LAcleavagesite 13aapre/4XAOrXPdipeptides/10aapro/KRcleavagesite Respectively,430,150and320bpfragments PCR—synthesized100bpfragmentwithaddedrestrictionsites Autonomouslyreplicativevectorscanmaintainonly1-3copies/cell Homologousintegration(inLEU2,URA3,XPR2terminator,rDNA,or, whenpresent,inzetaorpBR322dockingplatform) 丝 注:下画线处为较常用元件. Non—homologousintegrationin?t1一devoidstrains ? 16?生物加工过程第6卷第3期 2.3糖基化J 在所有真核生物的?.糖基化中,糖链都含有一 个核心五糖连接到肽链中Asn.X.Thr/Ser的Asn上, 核心五糖上所连接糖链的长短和类型依不同的物 种而变化.哺乳动物的?.糖基化有3种:复杂型, 高甘露糖型,杂合型;而酵母却只有高甘露糖型一 种.S.cerevisiae表达系统表达的外源基因一般都 过糖基化(50,150个甘露糖),使得所表达外源蛋 白的活力下降,且用于医药时极易引起免疫反应. P.pastoris和且polymorpha表达系统表达外源基因 时一般加8,14个甘露糖.虽然对解脂耶氏酵母表 达系统的糖基化情况还缺乏全面的了解,但就目前 所表达的外源蛋白来看,一般加8,10个甘露糖,为 低度糖基化,与哺乳动物较接近;也有蛋白为中度 糖基化,但对其活性没有显着影响,尚没有发现高 度糖基化的事例. 3总结和展望. 虽然迄今为止已有40多种异源蛋白在此表达 系统中进行表达,有些异源蛋白的表达量也极为可 观,但还没有工业化的实例,目前还处于实验室研 究阶段;随着Yarrowialipolytica全基因和线粒体基 因序列的测定,更利于研究者从转录和翻译的水平 研究异源蛋白在此菌中的表达分泌路径,且更利于 . 找到强的调控型启动子 参考文献: [1]BanhGemld,GaillardinClaude.Yarrowialipolytica[C]//Non— conventionalYeastsinBiotechnology:aHandbook.Heidelberg: Springer—Verlag,1996:313—388. [2]MadzakCatherine,GaillardinClaude,BeckerichJean—Marie.Het— erologousproteinexpressionandsecretioninthenon—conventional yeastYarrow/alipolytica:areview[J].JournalofBiotechnology, 2O04,109:63-81. 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