蛋白质变性的吸附动力学研究（可编辑）

蛋白质变性的吸附动力学研究（可编辑） 蛋白质变性的吸附动力学研究 内蒙古大学 博士学位论文 蛋白质变性的吸附动力学研究 姓名:萨楚尔夫 申请学位级别:博士 专业:理论物理 指导教师:罗辽复 2002.5.20要 摘 体文山两个部分组成 前四章构成论文的第一部分, 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 主要涉及蛋白质变性现象的研究 第二部分为论文的 第五章,讨论内容是血红蛋白分子氧合过程的构象变化特 、 首先,通过对典型单结构域蛋白质尿索变性实验结果的分析,发现在蛋白质变性研究领 域中普遍使用的二态模型假说所描述的过程,与真实单结构域蛋白质变性过程并不相符 在 分析己有的尿素诱导的蛋白质变性实验结果的基础上,给出了能够反映尿素诱导蛋白质变性 过程特征的新表示形式一这一形式表明蛋白质变性是一个构象渐变的过程 利用吸附反应动 力学方法,在分子水平上得到了可描述蛋白质变性过程特征的物理参量 与尿索浓度 之间 关系的表示式 将从模型出发所得理论值与实验值进行比较发现两者符合较好,表明建立的 模型可较好地描述尿素诱导的单结构域蛋白质变性现象,同时又给出了从理论模型所得出的 某些预测和推论 其次,盐酸肌是常用于使蛋白质变性的另一种重要变性剂,酸呱分子与蛋白质分子相 互作用的机理和尿素的情形具有相似性 通过对典型的 形变性曲线与二态模型之间的关系 所作的详细分析,进一步强调变性过程表现为 型曲线,并非说明单结构域蛋白质的变性过 程一定是二态过程 提出了 酸肌分子与蛋白质分子主链上相邻的二肤形成双氢键的作用机 理假设,同样利用吸附反应动力学方法,导出了可描述盐酸弧诱导的单结构域蛋白质变性过 程的关系式,并对典型的由盐酸肌诱导的单结构域蛋白质变性过程进行了分析。分析结果表 明理论模型可以较好地解释实验事实 另外,从理论模型还可以给出了一些 新的预测结果, 第三从构象渐变的观点对蛋白质热变性现象进行了系统分析?拳现以前用二态模型假 说无法解释的实验结果,可以用构象渐变模型做出合理的解释 鉴于蛋白质变性过程的构象 变化特点,通过热变性实验所预测的结果,可一用来进一步验证热变性过程具有构象渐变的特 性了一匕 第四,由蛋白质变性的构象渐变模型分析多结构域蛋白质变性过程的特点冲吸附动力 学方法得到了可描述多个结构域变性的表示式,特别对典型双结构域蛋自质变性过程予以较详细的讨论 在一定参数条件下,用上述理论模型解释了双结构域蛋白质变性过程中出现双 形变性曲线的原因,司时对变性过程中可能出现的一些情况进行了预测和分析‘ 最后,在分析血红蛋白分子与氧结合的相互作用特点的基础上,将氧分子与血红蛋白分 子结合的过程看作为协同可逆吸附过程撇据吸附过程的特点,利用,吸附动力学方法,得到 了反映血红蛋白分子氧合过程的氧饱合分数与氧分压之间的关系式 从上述关系式得到了与 之自洽的推论,在一定的氧分压条件下,血红蛋白分子处于确定的部分氧合 构象态当氧分压 的值从小到大变化时,血红蛋白分子将从脱氧构象态经历一系列中间构象态到达完全氧合构 象态?这表明形的氧合曲线实际显示了单个血红蛋白分子的别构效卿 关键词 蛋白质变性,二态模型,构象渐变,吸附动力学内蒙古人学博学位论义 第一章尿素诱导的蛋白质变性现象的研究引言 蛋白质分子较易受外界因素影响而发生构象变化,导致活性丧失、物理、化 学性质发生异常变化,这一过程称为蛋白质变性 众所周知,蛋白质分子在行 使生物功能时,必须具有特定的三维空间结构,蛋白质变性时蛋白质肤链伸展 而失去特定的空间结构 若除去变性因素后,很多变性蛋白质可以自发地恢复 原有的空间结构和生物活性,这一过程称为变性蛋白质的复性或重折叠过程 研 究蛋白质变性和重折叠过程的变化规律,可以深入了解维持蛋白质高级结构的 作用力所起的作用,对理解蛋白质天然结构的形成过程,即具有一定氨基酸序 列的多肤链是如何逐步卷曲折叠形成蛋白质特有的空间结构,具有重大的理论 研究意义 使蛋白质变性的方法有许多种,常用的方法有添加变性剂和对蛋白质溶液 加温促使蛋白质变性 可以用作变性剂的化学物质有多种,不同的变性剂对蛋 白质变性所产生的变性效果及作用机理一般不同,常用的变性剂主要有两种尿素 盐酸肌 以往对由变性剂产生的蛋白质变性问题, 从理论方面对蛋白质与变性剂分子相互作用机理的讨论很少涉及,绝大多数方 法是采用由实验结果出发的半经验公式进行分析‘,实际中常用的有以下三种 方法 第一种是由 提出的使用这种方法主要考虑到蛋白质完全解折叠 时,组成蛋白质肤链的各个残基的所有基团将从水中移至变性剂溶液中,这时 其自由能将发生改变,利用实验中所得结果并结合热力学方法可估计蛋白质的 稳定性,即估算 的值这种方法在具体运用‘存在的缺点是,由不同的 变性剂使同一种蛋白质变性时,所得到的?值不一致 另外,这种方法 不能直接用于分析反映蛋白质变性过程特征的 型变性曲线,第二种方法是有 关变性剂分子结合模型的方法,这种模型在用于分析变性剂分子与蛋白质分子 相互作用时,假设蛋白质分子处在变性态时较天然态更易结合变性剂分子,各 结合位点相同且各位点之间无相互作用,山此可得出热力学关系式内蒙古大学博一学位论文 一? 十 式中? 表示天然态蛋白质和完全变性态蛋自 质结合位点数的差值, 表示变性剂分子与蛋白质分子的结合常数,参数 不‘ 值拟合实验山线的方法寻找 世纪 年代以来在许多 研究工作中,用这种方法分析山变性剂引起的蛋白质变性的实验结果 这一模 型存在的主要问题有未明确定义蛋白质分子土与变性剂分子有相互作用 的结合位点与第一种方法类似,它同样不能解释实验观测值与变性剂浓 度之间的 型变性曲线 第三种方法是实际中最常用的方法,即线性外推法 在 这种方法中假定蛋白质变性过程中的自由能变化? 与变性剂浓度之间满足线 性关系,即? 一 ,此式中 为待定常数, 为变性剂浓度,线性外推至变性剂浓度为零,即可得到某种蛋白质的? 值,它表示在水溶液中蛋白质解折叠时的自山能变化值 由这种方法所得到的 值要比前两种方法所得值低 由于用三种方法得到的值互不 相同,其中的哪一个值更合理,更可靠至今尚无定论,由此可见在蛋白质变性 的研究领域中存在着许多尚待解决的问题 尽管可以采用上面介绍的方法对实 验资料进行一些初步分析,但对于在分子水平上蛋白质分子如何与变性剂分子 相互作用而产生变性的机理,迄今为止仍然未搞清楚 从实验结果可以推测 不 同的变性剂由于分子结构不同,变性机理也不同 长期以来,一般认为蛋白质 的变性是经历二态过程,即认为蛋白质分子直接由天然态转变为完全伸展的变 性态,而避免有中间状态,这一过程也被称为蛋白质变性的全或无过程 在本 章中我们将对尿素引起的蛋白质变性实验结果进行分析,特别是对尿素浓度梯 度电泳实验中蛋白质分子的分布呈现为 型带的原因进行较深入的考察,并进 一步讨论二态模型假说与真实蛋白质变性过程之间的关系 在以上工作的基础 上,从蛋白质变性为浙变过程的观点出发,利用吸附反应动力学方法,在分子 水平上对重要的变性利尿素诱导的蛋白质变性现象的机理进行讨论 在一定假 设下提出蛋白质分子与尿素分子相互作用模型,利用所得到的理论模型对单结 构域蛋白质变性过程进行分析,并将所得理论结果与实验值作比较并对所得结 果进行讨论内蒙古人学博‘学位论文 . 尿素诱导的蛋白质变性过程是分子构象逐步变化的过程 .蛋白质变性过程的二态模型 长期以来,人们~般认为单结构域蛋白质的变性是~个全或无的变化,即 分子宜接由天然态转变为完全伸展的变性念,这个变化过程被二态模型所描述” “.提出这一模型的根据是,在变性因素变性剂浓度、温度等逐渐增加的情 况下,用不同的物理化学方法测定某些单结构域蛋白质的伸展程度,所得的实 验数据落在同一条型变性曲线上.由于不同的物理化学方法反映不同的分子 构象变化,这一结果似乎说明在变性过程中单结构域蛋白质分子构象变化只有 天然和完全变性两种状态.在使用二态模型描述变性过程时,认为变性过程仅 有两个状态,即天然蛋白质状态和完全变性蛋白质状态.在某些变 性条件一如一定变性剂浓度范围内或~定温度范围内,蛋白质的构象可以由 天然态直接变到完全变性态,而在另一种有利于天然态的条件下由完全变性态 又可以直接回到天然态,即两态之间相互转换过程可表示为: 苎 、? ?【????。~ 在一定变性剂浓度或一定温度下,反应平衡常数可表示为 :盥 ? 【?】 实际中一般通过测定某一物理参量来跟踪蛋白质变性过程,通常由来表示此 物理参量,而用。和。分别表示蛋白质处于天然态和完全变性态时的物理参 量值.假定和厶分别为天然蛋白和变性蛋白质的组份,因此有 ,,, 、 并且满足归一化条件 ,、 出式和式可以得到 厶:盟 厶:业 ,一 ?/,内蒙古人学博学位论义 反应平衡常数可表示为 ::上边 . ? 由二态模型假设及以上关系可知,在变性因索变性剂浓度或温度改变 过程中,溶液中所发生的物理参量的改变,是山于天然蛋白质与变性蛋白质 所 占的组份发生改变而产生的.如图?所示, 勺 ? 已 窟 :口 柑 图卜 在尿素作用下核糖核酸酶变性曲线 一 . 实验曲线反映了在变性剂尿素作用下,核糖核酸酶已完全变性的分予所占 的百分数随尿素浓度变化的情况?.可以用不同的实验方法测定变性分数,对 于单结构域蛋白质用不同的物理参量测定,都能给出相同的变性曲线.以往均 用二态模型解释上述实验曲线为二态现象:即认为仅仅存在天然态和充 分伸展态,而不存在部分伸展态.例如,在%伸展数据上表示的足,% 的分子是,%的分子是,而不是具有半折叠构象的全部分子.由二念模型 得出关于蛋白质变性机理的结论为:伸展是协同的,即折叠构象中任一部分的 破坏,都会引发连锁反应,导致其余所有部分的伸展.这也就是文献中常提到 的流行观点:蛋白质变性过程中肽链伸展的动力学行为是一个全或无的过程.在 国内外教材和专业文献中四”,对表现为型曲线的单结构域蛋白质变性过堕茎直盔兰堕:兰丝堡苎?? 程都以全或无机理来描述.这种二态模型被研究蛋白质折叠/解折叠过程性质的 大多数学者所接受‘】,研究蛋白质变性现象所获得的许多成果均是以二态 模型 为其研究基础. .蛋白质变性解折叠过程是分子构象逐步变化的过程 以往对单结构域蛋白质变性过程的研究得出其遵循二态模型的结论,其出 发点是考虑到单结构域蛋白质的变性曲线呈现为型,认为变性过程无明显稳 定的中间态,而所有各步均为瞬态,这一结论的导出是从分析实验曲线得到的 间接结论.以下结合具体实验事实来说明,实际中广泛应用的二态模型并不能 反映真实单结构域蛋白质变性过程特征,特别以尿素诱导的几种单结构域蛋白 质变性过程为例进一步加以阐述.首先对一乳球蛋白的变性过程进行分析.一 .一乳球蛋白的变 乳球蛋白在不同浓度尿素溶液中的变性过程如图。所示? 性曲线在室温下表现为典型的型曲线.此蛋白质变性过程显示:在浓度较低 的尿素溶液中时,一乳球蛋白的旋光率.【】基本没有改变;当尿素浓 度达到时,旋光率.【】不始 图卜?一乳球蛋白的尿素变性曲线 ? 卜 ? 发生较显著的变化;当尿素浓度在一之问时,旋光率一】经历非常大的改 变;尿素浓度高于时,旋光率一【】达到最大值并保持不变.若对一乳球蛋 白的变性过程采用二态模型进行分析,则可以得到以下结论:在尿素溶液浓度 较低时,乳球蛋白的构象没有发生改变,即它处于天然蛋白质状态;当尿素 溶液浓度处于.之削时,蛋白质分子只能处于天然态或完全变性态,即内蒙古,学博。学戗论史 有部分蛋白质分子处于天然态而其余部分蛋白质分子则处于完全变性态,并且 随着尿素浓度的增大,完全变性的蛋白质分子所占的组份逐渐增加,天然蛋白 质所占的组份逐渐减少;尿素溶液浓度较大时,所有蛋白质分子均处于 完全变性态.以上为从二态模型出发所得到蛋白质变性过程中蛋白质分子构象 变化应具有的特征.若我们采用某种实验方法跟踪蛋白质分子在变性过程中所 发生的构象变化,就能够从实验上检验二态模型的描述是否与真实蛋白质变性 过程相符.在生物实验技术中电泳技术可用来进行这种检验,具体来说可用尿 素浓度梯度电泳的方法进行验证?】.若二态模型的描述与蛋白质变性过程相 符,则在尿素浓度梯度电泳实验中,在不同时刻可观察到如图一所示的蛋白 质分子的分布带.按照二念模型分析在一尿索浓度范围内,仅存在一乳 球蛋白的天然态和完全变性态这两种构象态.在尿素浓度梯度电泳实验中经 过 适当时间后可观察到两个带,即天然蛋白质聚集的带和完全变性蛋白质聚集 的 带,并且随着电泳时间的延长两个带之间的间隔将增大. ? 饵 立 山 ??????????? 图卜二态模型描述的尿素浓度梯度电泳中一乳球蛋白的变性过程 ? . 事实上从尿素浓度梯度电泳实验中得到的蛋白质分子聚集的带由图 所示.图显示随着尿素浓度的增大,在一定时州后得到的电泳实内蒙古人学 博‘学位论艾 验结果为:在不同的尿素浓度溶液中蛋白质分予的分斫呈现出型分析带.显 然图与图.不相同,说明图。表示的二态模型描述的过程并不与 真实蛋白质变性过程相符.图,同时表明随着尿素浓度的增加,一乳球 蛋白的空问结构发生了渐变式松散,当尿素溶液浓度达到时,.乳球蛋白 的空脚结构变为完全松散的构象,即达到完全变性状念.实验结果同时表明 在 一定浓度的尿素溶液中,.乳球蛋白分子处于相同构象态.在不同浓度的尿素 溶液中,.乳球蛋白分子处于不同的部分变性的稳定构象态.出图.所 示的实验还可说明在尿素浓度增加的过程中,.乳球蛋白的构象经历了一个 逐 渐变化的过程,即日一乳球蛋白由紧密的球形构象逐渐变为完全伸展的变性 态构 象.图和图分别表示核糖核酸酶 和细胞色素 这两种蛋白质变性过程的尿素梯度电泳实验结果?】. 分子 从图和图中均可观察到型的蛋白质分子聚集带.这些实验 结果均表明蛋白质变性时将经历一系列结构 一 ? ’ 一一.一一/一‰ ?五?? 塑鐾直叁堂堕:兰丝墨一?? ?赛 罟 三 手 鲁 三 阉 图?尿素浓度梯度电泳实验中三种蛋白质分子的变性过程. 一乳球蛋白,核糖核酸酶,细胞色素分子. ?, . ; ;堕鐾直厶堂堕:兰垡堡兰 一?? 逐步松散的构象态.有关蛋白质电泳实验资料已积累不少.通过对有关实验 结果 的分析,有理由认为单结构域蛋白质分子在变性因素变性剂浓皮,温度逐 渐增大时,蛋白质变性过程并不与二态模型相符,它是一个构象渐变的出现 一 系列中间态的过程,我们把这个过程表示为:?或? ??, .式中表示天然蛋白质所处的状态,.、:、,、??、。为部分变性蛋 白质构象态,为蛋白质的完全变性态,此过程反映出单结构域蛋白质变性时, 构象变化特征为渐变形式.整个过程具有不同于二态模型所描述的过程特 征. .描述尿素分子诱导蛋白质变性的吸附动力学理论 蛋白质变性实验表明,蛋白质分子在浓度较高的尿素溶液中产生 完全伸展的构象【.由于尿素分子为极性分子,从尿素分子的结构反映出,它和 其它分子形成氢键时,既可以作为质子供体,又可以作为质子受体.具体来说 尿素分子的五个基团中,四个氢原子可作为质子供体,一个氧原子可作为质子 受体,有关实验结果表明四,蛋白质与尿素分子之间的相互作用主要表现为氢 键作用形式,通过分析可以得出这种结合应是多氢键结合形式.具体从结合位 点与蛋白质结构参数相关联角度分析,可以认为一个尿素分子与蛋白质分子主 链上的两个相邻肽键的羰基氧原子形成双氢键.本文中我们将从这一实验事实 出发,讨论尿素分子与蛋白质分子之问的相互作用机理.我们认为正是这种相互 作用使得蛋白质分子的构象念从天然态逐步伸展为完全变性态.为了便于分析, 下面对蛋白质变性现象的讨论仅限于单结构域蛋白质分子的尿素变性.尿素诱 导单结构域蛋白质变性时,变性过程呈现为典型的型变性曲线”.这表明尿 素诱导的单结构域蛋白质变性过程为一个协同过程.按照上述实验结果可以将 蛋白质分子和尿素分子的这种相互作用看作为尿素分子吸附到蛋白质分子上的 可逆吸附过程.在蛋白质分子内存在着不同类型的二级结构,如螺旋和折 叠结构等.这些结构是由蛋白质多肽链中链间氢键所维持得,它们是使蛋白质 分子保持为球形结构的最重要的因素当尿素分子与肽链上的紧邻两肽段之问 形成双氢键时,表明尿素分子将与肽链上的原子竞争结合位点,这将破坏原有内蒙古人学博学位论文 逐步松散的构象态有关蛋白质电泳实验资料己积累不少 通过对有关实验结果 的分析,有理由认为单结构域蛋白质分子在变性因素变性剂浓度,温度 逐 渐增大时,蛋白质变性过程并不与二态模型相符,它是一个构象渐变的出现一 系列中间态的过程,我们把这个过程表示为?功几,二 式中 表示天然蛋白质所处的状态,??、 。为部分变性蛋 白质构象态, 为蛋白质的完全变性态,此过程反映出单结构域蛋白质变性时, 构象变化特征为渐变形式 整个过程具有不同于二态模型所描述的过程特征 描述尿素分子诱导蛋白质变性的吸附动力学理论 蛋白质变性实验表明,蛋白质分子在浓度较高 的尿素溶液中产生 完全伸展的构象 由于尿素分子为极性分子,从尿素分子的结构反映出,它和 其它分子形成氢键时,既可以作为质子供体,又可以作为质子受体 具体来说 尿素分子的五个基团中,四个氢原子可作为质子供体,一个氧原子可作为质子 受体,有关实验结果表明‘,蛋白质与尿素分子之间的相互作用主要表现为氢 键作用形式,通过分析可以得出这种结合应是多氢键结合形式,具体从结合位 点与蛋白质结构参数相关联角度分析,可以认为一个尿素分子与蛋白质分子主 链上的两个相邻肤键的拨基氧原子形成双氢键 本文中我们将从这一实验事实 出发,讨论尿素分子与蛋白质分子之间的相互作用机理我们认为正是这种相互 作用使得蛋白质分子的构象态从天然态逐步伸展为完全变性态 为了便于分析, 下面对蛋白质变性现象的讨论仅限于单结构域蛋白质分子的尿素变性 尿素诱 导单结构域蛋白质变性时,变性过程呈现为典型的 型变性曲线 这表明尿 素诱导的单结构域蛋白质变性过程为一个协同过程 按照上述实验结果可以将 蛋白质分子和尿素分子的这种相互作用看作为尿素分子吸附到蛋白质分子上的 可逆吸附过程 在蛋白质分子内存在着不同类型的二级结构,如 螺旋和日折 叠结构等 这些结构是由蛋白质多肤链中链间氢键所维持得,它们是使蛋白质 分子保持为球形结构的最重要的因素 当尿素分子与肤链上的紧邻两肤段之间 形成双氢键时,表明尿素分子将与肤链上的原子竞争结合位点,这将破坏原有内蒙古人学博上学位论文 的链内氢键 一个尿素分子吸附在肤链上将会改变其它尿素分子吸附到肤链上 结合位点的吸附能力, 型变性曲线表明蛋白质变性是一种协同作用过程,根 据蛋白质分子与尿素分子相互作用的特点,可将这种相互作用看作为协同二位 定位吸附 为了描述这种协同过程,我们假设上述解折叠过程可表示为十 尸 令丁, 式中 表示蛋白质分子, 表示尿素分子 参数 为 协同系数瓦为 尿素分子吸附到蛋白质分子上结合位点的吸附速率, 为尿素分子脱离开蛋白 质分子上结合位点的脱附速率 式对应的稳态速率方程可表示为 儿 式中 表示尿素溶液的浓度 是肤链上两个相邻的结合位点米被 占据的几率,儿是肤链上两个相邻的结合位点被占据的几率 为肤链上结 合位点被占据的分数,也被称为肤链上结合位点的复盖度 曾经讨论过 一个分子被吸附在平面上占据两个相邻位点时的问题,得到了吸附为定点吸 附时的 和 的表示式为 一一一一 一 一 儿一 参数 是配位数,表示一个结合位点附近的最邻近的位点数 对于蛋白质多肤 链而言,一个结合位点附近最邻近的结合位点数为 ,即赵学庄曾对表示 式 和川做过详细讨论、记 二玉, 表示尿素分子的表观吸 附常数,关系式又可表示为一人儿 在上述一式中 的值还未给出定义 由尿素分子和蛋白质分子内蒙古人学阵 学位论文 相互作用的假设可得出如下结论 蛋白质分子上结合的尿素分子越多,蛋白 质 分子多肤链伸展程度越大尿素分子占据多肤链上的结合位点的分数应与蛋 白 质多肤链的伸展程度成正比 当时对应多肤链上的所有结合位点己被占满 则 可以被定义为四 一一,一 将式 和代入式可得 卜 一? 人 一 由式和可得 一二 。一、兰一号 一 式和 式给出了参量 和 与尿素浓度 之间的对应关系 当 式中 时, 式将化为文献中的 式 从本文提出的构象渐 变观点来看,由于存在一系列中间稳态构象,确定的中间构象态仅仅存在于确 定浓度的尿素溶液中,物理参量 的不同观测值对应不同的中间稳态构象,而 且参量 表示任一可跟踪蛋白质变性过程的物理量参量 反映在变性过程中蛋 白质分子构象的变化程度,而并非二态模型所描述的情形,即处于完全变性态 的蛋白质分子所占的分数 从构象渐变模型所得结果与二态模型所描述的过程 是有本质区别的 在过去几十年的研究中,己积累了许多蛋白质变性现象的实验资料,其中单 结构域蛋白质的变性曲线呈现为典型的 型曲线 对从蛋白质变性实验所获得 的数据均用二态模型的方法进行分析处理 经过以上的分析和讨论可知,二态 模型描述的过程并不与真实的尿素诱导的蛋白质变性过程相符 我们在分析实 验事实的基础上提出了对尿素诱导的单结构域蛋白质变性现象的新解释,下面内蒙古人学博‘学位论义 将利用式和式对尿素诱导的几种蛋白质变性过程进行理论分 析,并将所得理论结果与实验数据相比较 由于蛋白质在变性过程中表征其结构 的物理化学参量也随之发生变化,跟踪这些参量的变化可以了解蛋白质变性过 程的变化规律 监测旋光色散的变化是用来跟踪蛋白质变性过程的一种重 要手段 蛋白质变性时构象发生变化,必然导致值的变化 通过了解旋光 色散率与尿素浓度的关系,可以研究和检测蛋白质分子的构象变化 我们首先 将对尿素诱导的 一乳球蛋白的变性过程进行讨论 此时式中的 表 示不同浓度的尿素溶液中蛋白质的旋光色散率,当 时,如图 所示理论预测曲线与实验值符合较好其次对尿素诱导的核糖核酸酶 的变性过程,可用同样方法进行分析,当 时,如图 所 示理论预测曲线与实验值也符合得很好 ‘ 仑叮 图 一乳球蛋白的尿素变性曲线 实线表示理论曲线 实验值引自文献【,人学 日 位论交 夕柳 咖 汹 〔 乙 」 。 的一一月 一 言一一一 ’。 。娜 图尿素变性曲线 实线表示理论曲线 ,二,, 实验值引自文献〔 讨论 以上以实验事实为础详细分析了二态模型‘真实单结构域蛋白质变性过 程之间的关系,并提出了分子水平 蛋白质分子与尿索分子之间的相互作川 机 理假设 以下我们将对所得结果做进一步讨论 通过分析实验结果,我们发现二态模型的描述与真实蛋白质变性过程并 不相符尿素浓度梯度电泳实验结果显小,在一定浓度的尿索溶液中被 测蛋白质分子处于某一确定的构象态而仁一作二态模型所描述的处于天 然态和完全变性态的蛋白质分子的混合 尿索浓度梯度电泳实验中显示 出的 型蛋白质分子分布带,直观反映出处于不同浓度的尿素溶液中的 蛋白质分子,从大然态到完全变性态的变性过程中所经历的所有中构 象态 以往的蛋白质变性研究中,一些研究者也提出过蛋白质变性足序 变过程的观点,但我们强调处」七一定浓度的尿索溶液中的全部蛋自内蒙古 大学叻卜学位论文 质分子是处在同一构象态上,这说明典型 型变性曲线实际上表示了在 尿素作用下单个蛋白质分子经历的协同变性过程 提出了蛋白质多肤链上的相邻两肤段和一个尿素分子形成双氢键的假 设,由此假设得到了反映蛋白质分子构象变化和某一物理化学参量与尿 素浓度关系的表示式和从上述蛋白质分子与尿素分子 相互作用机理可知 尿素分子吸附到蛋白质分子上将导致蛋白质多肚链 具有一定的刚性‘这种效应曾被等人提及,它与蛋白质分子的 完全变性态是无规卷曲线团这一传统观点是不同的 图 和图 表明旋光色散率可用来跟踪蛋白质变性过程,值 的变化反映蛋白质分子内二级结构含量的变化 若从序变的观点解释蛋 白质变性过程,结果表明蛋白质分子二级结构的逐步消失将导致蛋白质 分子协同解折叠行为的出现 比较图 和图 及图 中出现 型变性曲线的浓度范围,可发现对应的两个 型曲线位于相同 的尿素浓度范围内 当尿素浓度逐渐增大时,图 显示出在不同的尿 素浓度溶液中蛋白质分子所取的一系列中间稳定构象态,这些中间态对 尿素浓度的变化敏感依赖,并且每个中间态仅存在于非常窄的尿素浓度 范围中 如图 所示,蛋白质分子的分布呈现 型分布带表明不同的 中间态对应不同的分子体积 对于单结构域蛋白质分子变性时,用不同 的物理化学方法测定蛋白质的伸展程度,所得到的实验数据都落在同一 条 型变性曲线上 若用本征粘度值跟踪蛋白质变性过程的分子构象 变化,则式和可表示本征粘度随尿素浓度变化的关系 另 外,蛋白质分子内二级结构含量的变化将导致蛋白质分子的体积发生改 变,这表明处在不同中间构象态的蛋白质分子具有不同的分子体积,所 以式 和 也可描述蛋白质分子体积随尿素浓度变化的关 系 这一关系的直观反映就是观察到的尿素浓度梯度电泳实验中的蛋白 质分子分布呈现为 型分布带 显然从提出的理论模型得到的上述两个 推论还需要实验上做出进一步的定量验证 尿素分子与蛋白质分子相互作用机理表明,若某一极性分子具有与尿素 分子相似的分子结构,则可以推断这种分子可能会产生相似的蛋白质变内蒙古人学博卜学位论文 性效应 实验显示甲酞胺、二甲基甲酞胺、二乙基甲 等化合物都可 使蛋白质产生变性效应,这些实验结果也进一步证实了上述推测 然 而由于这些化合物的分子结构还存在着差异,所以不同化合物产生的变 性效应的强弱也有所不同 尿素分子可使分子变性,尿素分子和 分子也是通过形成氢键而结合,在这一点上是与使蛋白质分子变 性的作用机理相似的 第一章参考文献 汇 李庆国, 汪和睦, 李安之分子生物物理学 内蒙古大学博卜学位论文, , , 陶慰孙, 李惟, 姜涌明蛋白质分子基 邹承鲁 生物化学杂志, 增刊二 绮梅 代尘物学, 仁内蒙古大学博卜学位论文 工赵学庄 化学反应动力学原理 册 李前忠, 罗辽复 ,部金荣,叶林柏 分子生物学 武汉 武汉大学出版社, 内蒙古大学博卜学位论文 盐酸肛诱导的蛋白质变性现象的研究 第二章引言 能够引起蛋白质变性的因素有很多,主要分为两种类型 一类是化学因素 引起的变化,这包括酸、碱、有机溶剂、尿素、盐酸肌和表面活性剂 另一类 是物理因素引起的,包括热、紫外线、 射线和超声波等在上述任何一种或几 种因素综合作用下,蛋白质均可能发生变性在使蛋自质变性的程度方面,各种 因素所产生的变性效果也不同 从分子构象上看,变性蛋白与天然蛋白之间的 差别有大小之分,最少者可以只差一个次级键,差别最大者,除一级结构相同 之外,几乎所有原子的空间位置都与天然蛋白质的不同 由于变性所涉及的蛋 白质构象变化范围很大,对很小的构象变化用目前的实验手段还无法测出,而 对较大的构象变化,可以用一般的物理化学方法测定‘一习 使用变性剂使蛋白质 变性是研究蛋白质变性过程特征的一种主要方法,盐酸肌是一种重要的变性剂, 它可以产生较强的变性效应尽管长期以来在实验上盐酸肌被用于蛋白质的变性 研究中,但有关盐酸肌分子与蛋白质分子相互作用机理,迄今为止一直未搞清 楚 在研究由盐酸肌诱导的蛋白质变性问题时,所做的绝大多数分析是采用从 实验结果出发的半经验公式进行的 由于用不同的半经验公式得到的结果不 同,对这些方法的合理性和可靠性还存在很大争议在第一章中通过分析尿素 诱导的单结构域蛋白质变性过程的实验结果,发现真实单结构域蛋白质变性并 不与二态模型假说描述的过程相符,在结合分析其它有关实验结果的基础 上, 提出了蛋白质变性的构象渐变的观点本章将从构象渐变的观点出发,在分析 已有的盐酸肌变性实验事实的基础上提出合理假设,即在变性过程中蛋白质分 子的相邻二肤段与盐酸肌分子结合形成双氢键,同样利用吸附反应动力学方法, 讨论盐酸肌分子导致单结构域蛋白质变性的相互作用机理 蛋白质变性的分子构象变化特征 对单结构域蛋白质变性过程的研究得出其遵循二态模型假说的结论,其出内蒙古人学博 学位论文 发点是考虑到单结构域蛋白质变性过程呈现为典型 型曲线,认为变性过 程无明显稳定的中间态,而所有各步均为瞬态,这一结论的导出是从分析实验 曲线得到的间接结果能够直接检验二态模型假说正确与否的关键是寻找二态 之间存在稳定中间态的证据,中间态存在的证据对于理解蛋白质分子解折叠的 机理具有重要意义在理论上主要是从平衡的观点出发,采用化学反应平衡方法 对上述转换过程进行讨论一般假定总的反应可表示为 一戈一凡’‘’一 式 中每一龙均为稳定的中间态若用某一物理量 来跟踪构象变化过程, 当构象变化时 将随变性剂或温度变化而发生改变在一定变性剂浓度或温度 条 件下,各种成份处于平衡态,观测的物理量少山下式给出 一 艺 上式中和分别为天然蛋白质和完全变性蛋白质所占的组份,为第 个中 间态所占的组份, 少、分别表示蛋白质处在天然态、完全变性态和第 个 中间态时,物理参量 所取的值由归一化条件可得到 几 卜九一艺 并将其代入 式中,经整理后可以得到表观变性组份瑞的表示式二 几。一 式 中 一‘‘一 一般情况下参数,在 和 之间取值,即表示第 个中间体的物理特征值是在 天然态和完全变性态的值之间变化?从式 及 可知的数值一般 是与物理性质参数有关?当无中间体时厂 ,则有扬 九, 一,这表明转换过程为二态过程,此时扬与无关,扬与用 于实际测量的物理参数无关,即对于不同的物理参量, 与变性因素变 全些 一一 ? ? 一一一一 性剂、温度等 之间满足相同的函数关系在这 结论基础上通常 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 实验去检 验有无中间态存在?若有中间态存在时,得到的 值一定随选取不同物理参数 而发生变化,因为任一 值不可能对于所有测量的不同的物理性质是一样的 ‘川 实际上除了二态过程外,当式 中几 时, 二 对选取的不同物理参量,与变性因素之间也可满足同样的函数关系?这表示 在转换过程中所有蛋白质分子均处于某一中间态,在此中间态测量到的物理参 数值为 对应于这种情况的变性过程可表示为 上式表明在一定变性因素条件下,不是各种组份同时存在并处于平衡态,而是 仅出现某一确定的中间态 所以通常在用不同物理参数测定某些蛋白质的转换 过程时,若得到瑞与变性因素之间满足同样的函数关系时,这并不能说明蛋 白质的转换过程就一定是二态过程如图 所示,实验曲线反映了在盐酸肌作 用下,磷酸甘油酸激酶已完全变性的分子所占的分数随盐酸呱浓度变化的情况 图中 口 。 『 。 巴 山 。 一 召 口 口 一一图 盐酸孤诱导的磷酸甘油酸激酶变性曲线内蒙古人学博 学位论文 的不同标号代表用不同的实验方法测定变性分数,从图 看到用不同的物理 参量测定变性分数与盐酸肌的浓度之间的关系,可得到相同的函数关系 以往均 用二态模型解释上述实验曲线为二态现象,而从以上分析可知 形曲线并非一 定对应二态过程 第一章中通过实验上对尿素诱导的蛋白质变性过程的分析表 明,蛋白质变性是一个构象渐变的过程尿素诱导蛋白质变性实验结果也进一步 证实了表示式 的正确性,所以可以认为图 显示的盐酸叽诱导的蛋白 质变性过程为一个构象渐变的过程 盐酸肌分子诱导蛋白质变性的吸附动力学模型 蛋白质变性实验表明,蛋白质分子在高浓度 的酸呱溶液中将处于 完全伸展的构象态酸孤分子的结构反映出,当它和其它分子以氢键形式结合 时,可以作为质子供体,具体分析可知有四个基团可作为质子供体实验结果表 明蛋白质分子与盐酸肌分子之间以形成氢键方式相结合,并且是多氢键形式结 合模型化合物实验表明〔川,盐酸呱分子与肤链上的两个相邻肤段间可形成一 个环状结构,这种双氢键结合形式较单氢键结合在水中更稳定 等人 对结合位点与蛋白质结构参数之间的关联进行分析,发现可以认为一个盐酸肌 分子与蛋白质分子主链上的两个相邻肤段的拨基氧原子形成双氢键以下我 们将从这一实验结果出发,讨论盐酸肌分子与蛋白质分子之间的相互作用机理 为了便于分析,讨论将仅限于单结构域蛋白质分子的变性与尿素诱导的蛋白质 变性过程相似,盐酸肌诱导单结构域蛋白质变性时,变性过程也呈现为典型的 型变性曲线,这表明盐酸肌诱导的单结构域蛋白质变性为一个协同过程〔’〕考 虑到盐酸肌与蛋白质分子间的相互作用特点,为了描述这种协同吸附作用过程, 假设盐酸肌诱导的蛋白质分子的解折叠过程可表示为 止曰十 尸 峨万丁一 式中 表示蛋白质分子,‘表示盐酸孤分子,参数 为 协同系数弋 为盐酸肌分子吸附到蛋白质分子上结合位点的吸附速率, 为盐酸肌分子脱离 蛋白质分子上结合位点的脱附速率对应的稳态速率方程可表示为 九几内蒙古人学哗卜学位论义 式中表示欲酸皿溶液的浓度,九毋是肤链两个相邻的结合位点未被 占据的几率,儿是肤链上两个相邻的结合位点被占据的儿率 为肤链上结 也被称为肤链上结合位点的复盖度 和儿的表 合位点被占据的分数, 达式可表示为〔‘创“一““卜,’ 参数 是配位数,表示一个结合位点附近的最邻近的结合位点数对于蛋白质 多‘, 、 二。,,,,、,、, 、,尸、 、二,,七 肤链而言,配位数 记 兮 表示表观吸附常数,关系式 又可表 ,一一, 一 示为〔’〕二儿 引入 的定义‘了 二 一 一 一 代入 式可得 将式 、,冬,冬 吸一 一人 一 丈 ? 八 一和 可得 由式 号为 二 。一、 和 式分别给出了参量与盐酸肌浓度 之间的对应关系 当式中 时, 式将 化为文献中的 式盐酸肌浓度 确定时,由 式可知 也取确定的值 而 值与蛋白质分子上所吸附的 酸肌分子数有关,被吸附的结合位点数又决定着蛋白质分子的构象 所以参内蒙古大学博卜学位论文 量 反映了变性过程中蛋白质分子构象变化的程度,而不是二态模型假说所描 述的处于完全变性态的蛋白质分子所占的分数另外, 式显示物理参 量 的不同值对应不同的中间态,这表明测量参量 的变化情况可以跟踪蛋白 质变性过程,所以从上述分析所得结果是与二态模型假说所描述的过程有着本质 区别的 有关酸肌诱导的蛋白质变性的实验资料己积累很多,实验上观察到盐酸 呱诱导的单结构域蛋白质的变性曲线呈现为典型的 型曲线从上述分析可知盐 酸肌诱导的真实蛋白质的变性为一个构象渐变过程下面将利用 式和式对一盐酸呱诱导的几种蛋白质变胜过程进行理论分析,并将所得理论 结果与实验数据相比较蛋白质变性时,表征蛋白质分子结构的物理参数将随之 发生改变,跟踪这些参量的变化可以掌握蛋自质变性过程的变化规律监测圆二 色性 和荧光光谱值的变化可用来跟踪蛋白质变性过程,蛋白质变性时构 象发生变化,必然导致跟踪物理参数的值发生变化,若找到物理参数 与盐酸 肌浓度 的关系,就可以定量研究在盐酸肌作用下蛋白质分子的构象变化规律 下面首先对盐酸呱诱导的溶菌酶 的变性过程进行讨论 ? 理论 。 一 ) 日 加匕一 一 图 溶菌酶的盐酸孤变性曲线 实线表示理论曲线,实验值引自文献【一 内袂古大学博学位论义 图 反映了溶菌酶变性时,圆二色性的摩尔椭圆度值随酸肌溶液浓度的变 化关系这种变化呈现出典型的 型变化趋势,反映了溶菌酶在变性过程中其空 间结构中的二级结构含量的变化,即溶菌酶处在完全变性态时分子的空间结构 中。一螺旋结构和 一折叠结构将消失,当式 中选取参量值为 拟 时一, 式对应的理论曲线与实验值符合较好 图 为糜蛋白酶抑制剂因 子 的变性过程〔”,随着盐酸肌浓度的增加,糜 蛋白酶抑制剂因子 的荧光光谱值将发生改变它反映出糜蛋白酶抑制剂因子 变性时所经历的构象变化过程,当 式中参数值取 时理论 曲线与实验值相符合 八 月 〕 ‘ , 卜 八 八 二丁 山月 目 』 山巴 砂 工比 内 月 生 合 奋 间 图 糜蛋白酶抑制剂因子 的盐酸脉变性曲线 实线表示理论曲线,实验值引自文献 一 讨论 上文中在通过分析以往实验事实的基础上,提出了蛋白质分子与一个酸 肌分子之间形成双氢键的相互作用假设从这一假设出发导出了跟踪变性过 程的一一一坠丝 一一? ? 可观测物理参量 与 酸肌溶液浓度乙之间的关系式,下面将对以上所得结果 做 较深入的讨论并从理论上给出某些新的预测结果在以往的蛋白质变性研究 中,研究者通常认为无论是变性剂诱导的 或温度诱导的蛋白质变性,变性后的蛋白质分子的构象均是无规卷 曲线团但从本文所提出的蛋白质分子与盐酸皿分子相互作用 机理可知,盐酸呱分子被吸附到蛋白质分子上将导致蛋白质多肤链 具有一定的刚性 ,而热变性时处于完全变性态的蛋白质分子则由 于所有弱键被破坏而其构象为无规卷曲线团,这种效应必将反映为 同一种蛋白质在热变性和在盐酸肌变性情况下,所得到的本征粘度 值不同,其中由于盐酸肌诱导的蛋白质变性时,己完全变性的蛋白 质分子具有一定的刚性因而具有较大的本征粘度值,这一预测结果 与己知的实验测量结果是一致的图 表明圆二色性 可用来跟踪蛋白质变性 过程, 值的变 化反映蛋白质分子内二级结构含量的变化从图 可知只有达到 一定的盐酸肌浓度值时,某种蛋白质分子内二级结构的含量刁‘会产 生显著的变化 当酸肌浓度逐渐增加时,蛋白质分子二级结构的 含量将逐步减少直至消失从渐变观点对盐酸肌诱导的蛋白质变性 可解释为,在不同浓度的盐酸肌溶液中蛋白质分子处于不同的稳定 中间态,这些中间态对盐酸呱浓度敏感依赖蛋白质变性时由于分 子内的二级结构含量发生显著变化,必然导致蛋白质分子的体积发 生改变,这表明处在不同的中间态时,蛋白质分子对应不同的分子 体积,实验上本征粘度值〔 可以从表观上反映蛋白质分子的构象 变化,通过测定蛋白质变性过程中本征粘度〔几〕的变化,可确定本 征粘度值与盐酸肌浓度之间的关系 当单结构域蛋白质分子变性 时,用不同的物理化学方法测定蛋白质的伸展程度,所得到的实验 数据都落到同一条 型变性曲线上〔这说明若跟踪变性过程 的物理参量 取为本征粘度值,则式 和 可表示本 征粘度厂 」随盐酸肌浓度乙变化的关系 由于本征粘度〔 」与分子 体积之间的关系,我们认为式 和 也可以描述蛋白内蒙古人学博一学位论 文 质分子体积随盐酸孤浓度变化的关系 在尿素诱导的蛋白质变性过 程中,尿素浓度梯度电泳实验中 形蛋白质分子分布带直观上反映 了这一关系图 表明通过测定荧光光谱值的变化也同样可以跟踪蛋白质变性 过程在蛋白质分子中,能发射荧光的氨基酸残基,只有 以及当蛋白质变性时,蛋白质分子的空间结构发生改变,导致 上述残基所处的微环境发生变化,从而使测得的荧光光谱值将随盐 酸肌浓度的改变而发生变化 山糜蛋白酶抑制剂因子 的天然 态结构可知,它仅含有一个埋入其疏水核内的 残基按照构象 渐变的观点解释图 所显示的变性过程为 色氨酸残基的微观环 境随盐酸肌浓度的增加而以渐变形式发生变化,反映了变性时芳香 族基团由分子内部非极性环境逐步暴露于溶剂中这一过程也必然 伴随着蛋白质分子内二级结构含量和分子体积的同步变化,用不同 物理参量监测同一单结构域蛋白质的变性过程,所得实验点均落在 同一条 型曲线就是这种同步变化的具体反映盐酸肌和尿素是实验上最常用 的两种变性剂这两种变性剂在使蛋 白质变性的机理方面具有相似之处,但由于盐酸呱分子与尿素分子 在分子构成上也还存在着一些差异,这使得盐酸肌在使蛋白质变性 时能够产生更强的变性效应在实验中可观察到在较低的盐酸肌 浓度溶液中蛋白质即开始发生变性,而若用尿素则同种蛋白质需较 高的浓度才能使其变性这种现象可用本文提出的模型解释为 当 盐酸呱分子吸附到蛋白质分子上时,其吸附能力较强,对应于吸附 平衡常数 的值较大,吸附平衡常数 变大时,变性曲线将向左移 动产生这种效应是由于吸附在蛋白质分子上的盐酸孤分子之间还 存在着静电排斥作用,这表现为盐酸肌较尿素可以产生更强的变 性作用从分析可知蛋白质变性是一个构象渐变的过程,以往常用的二态模 型假说所描述的过程并不与真实的变性过程相符 由于在同一浓度 的盐酸肌溶液中,所有蛋白质分子处于相同的构象态,这表明可通内蒙古大 学博卜学位论文 过单个蛋白质分子的变性过程表征和分析整个变性过程的特征盐 酸肌诱导的单结构域蛋白质变性所呈现出的 型变性曲线,并非是 通常所说的“全或无”过程,它仅表示第一个盐酸分子吸附到蛋 白质分子的结合位点上时,这将极易使其它盐酸肌分子被吸附到蛋 白质分子上,从而形成蛋白质分子的协同变性过程这里所获得的 对 型变性曲线的新认识,有助于正确理解和解释生物化学和分子 生物物理学中其它的 型曲线的真实含义从盐酸肌分子与蛋白质分子相互作 用机理可推测,对于具有相似分 子结构的化合物也可能产生类似的蛋白质变性效应 硫氰酸肌具有与盐酸肌 类似的分子结构,实验显示 它同样可使蛋白质变性,而且能产生更强的变性效应 本章通过分析有关实验结果,提出了蛋白质分子与盐酸肌分子相互作用机理的 假设在这一假设的基础上,得到了描述盐酸肌诱导蛋白质变性的理论模型将 所得的理论结果与实验值相比较,发现两者符合较好,表明理论模型可以较好 地解释盐酸肌诱导的蛋白质变性现象同时,理论模型还给出了一些新的预测结 果,这些推论有待于实验上做出进一步的验证 第二章参考文献 邹承鲁 蛋白质的变性是一个分子逐步伸展的过程生物化 学学报, 增刊 内蒙古大学 学位论文萨楚尔夫,罗辽复 蛋白质变性的渐变模型〔内蒙古师范大学 学报 自然科学版,, 川 , 周绮梅蛋白质折叠与去折叠见 邹承鲁当代生物学 北京 中国致公出版社, 李庆国,汪和睦,李安之分子生物物理学〔 北京 高等教育出版社, 内蒙古大学博 学位论文 赵学庄化学反应动力学原理上册 北京 高等教育出 版社, 李前忠热滞蛋白活性的化学动力学的进一步研究内蒙 古大学学报 自然科学版,内蒙古大学博十学位论文 第三章 蛋白质热变性现象的研究引言 由于蛋白质的生物活性是由其天然构象所决定的,长期以来人们对蛋白 质分子结构特性的研究,主要集中在精确测定蛋白质天然态构象方面 随着实 验技术的进步和研究领域的扩大,通过研究发现蛋白质的非天然态构象在某些 过程中起着非常重要的作用 主要表现在 蛋白质折叠问题和蛋白质的稳 定性 蛋白质折叠问题就是研究蛋白质天然结构是如何形成的,即具有一定氨 基酸序列的多肤链如何形成蛋白质所特有的空间构象 蛋白质分子较易受外界 因素温度、变性剂 影响而发生构象变化,而丧失活性、物理化学性质产生 异常变化,这一过程称为蛋白质变性 由于使不同蛋白质变性所对应的外界条 件存在着很大的差异,这表明不同蛋白质具有不同的稳定性蛋白质分子 穿越生物膜的转运机制,为了能够穿越脂双层膜,某些蛋白质必须首先由天然 态构象转变为部分变性态的构象,实验上观察发现这一过程既可以是在一定的 条件下自发进行的也可以是在解折叠酶的协助下完成的蛋白酶水解 研 究工作显示蛋白质变性后处于非天然构象态时,它将成为蛋白酶水解的目标 主 要表现为蛋白质的水解速度加快,蛋白质的水解部位有较多增加 鉴于以上原 因有必要深入研究蛋白质处于非天然态的构象时,这些非天然构象态所具有的 结构特性 为了研究这些特性必须使蛋白质分子处于非天然的构象态,即促使 蛋白质变性 在实验上可以采用不同的方法使蛋白质变性,最常用的方法有两 种用化学变性剂使蛋白质变性通过对蛋白质溶液加热使蛋白质变 性 对于由尿素和盐酸肌诱导的蛋白质变性现象,在第一章和第二章里己做了 较详细的讨论 在这一章中将对蛋白质的热变性现象进行深入的讨论 因为蛋白 质的热变性是蛋白质变性研究中非常重要的内容,以往的实验结果均用二态模 型假说来加以解释 由于蛋白质变性过程是一个构象渐变的过程,这里将从构 象渐变的观点,对以往积累的蛋白质热变性的实验资料作再分析,并对由二态 模型假说所得分析结果进行重新讨论和