盆栽非洲菊基因枪介导法转化体系的建立

盆栽非洲菊基因枪介导法转化体系的建立 盆栽非洲菊基因枪介导法转化体系的建立 细胞生物学杂志ChineseJournalofCellBiology2004,26:645648 盆栽非洲菊基因枪介导法转化体系的建立 毛碧增单兰兰范魏巍赵丽涵李德葆 (浙江大学生物技术研究所,杭州I310029) 摘要以非洲菊盆栽品种为材料,研究了BA和NAA不同浓度组合对不定芽诱导增殖的影 响;基因枪介导法转化的不同轰击距离对转化率影响.结果表明:1.5mg/LBA的培养基上增殖 倍数最高,高达8.96倍;9cm的目标轰击距离转化效率最高,达到10.9%建立了非洲菊盆栽品 为非洲菊基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 育种打下基础 种的再生和转基因体系, 关键词盆栽非洲菊;再生体系;基因枪介导转化;转基因体系;转基植株 非洲菊(GerberafamesoniiBolus)是菊科大丁草 属,多年生宿根草本花卉,又名扶郎花,大丁草.自 l9世纪80年代非洲菊在南非洲被发现后,英国和 法国园艺学家们相继选育了一批切花非洲菊品种, 直到20世纪80年代欧洲育成了非洲菊盆栽品种. 20世纪80年代我国才开始引入非洲菊切花品 种,近几年才从荷兰,丹麦引入盆栽HP~It菊品种, 目前国内 盆栽非洲菊已成为盆栽花卉的新型材料. 外对盆栽非洲菊的育种及产业化生产等方面刚起 步,盆栽非洲菊基因工程育种等有关研究未见报 道.本研究通过建立盆栽非洲菊快速繁殖及基因枪 介导的转基因体系,为利用生物技术进行盆栽非洲 菊基因工程育种提供技术平台. 1材料与方法 I.I材料 试验材料为雨燕系列的试管苗,其商品名及花 色为:雨燕霜状橙红色.转化质粒为pCAMBIA2200 (图1). 1.2不同培养基对非洲菊增殖的影响 取2~3cm高的小苗接种到以MS为基本培养基 的不同激素组合的l6种增殖培养基中,每种培养基 5个处理,每个处理约3,5株苗,比较不定芽诱导 增殖能力.各组分培养基均加入30g/L食用糖,8.0 g/L琼脂,pH5.8,(25?1.0)?光照培养,光照 强度为60Bmol/(m2.S),l6h/天. L— B— CaMV35SpolyANPTIICaMV35SpromoterLacZalphaRB 图1转基因载体pCAMBIA2200 1.3基因枪介导的非洲菊的遗传转化 1.3.1非洲菊小苗对Kan的敏感性取2,3cm高 的小苗分别接种到含不同浓度r0,5,l0,l5, 20,25,30mg/L)卡那霉素(Kan)的增殖培养基 (MS+0.5mg/LBA)上,每个浓度重复6次,每瓶 接种5株苗. lI3I2受体的准备切取0.1~0.2cm大小的茎尖 组织接种于高渗培养基中(MS+1.5mg/LBA+47g/L 甘露醇+47g/L山梨醇),每皿80个茎尖,培养4~6 h,待轰击. 1.3.3DNA金粉子弹的制作DNA金粉子弹的 制作及转化参考Chen等…的方法,部分步骤进行了 改良,步骤如下:称取直径1.0ktm金粉6mg, 加lml无水乙醇,震荡l,2次,l0000r/min离心 l0S,弃上清液,加lml的双蒸水,震荡l,2次, l0000r/min离心l0s,弃上清液,双蒸水重复洗涤 一 次后,用l00l双蒸水悬浮金粉.取50l金粉 悬浮液,加5gpCAMBIA2200DNA,低速震荡, 加20l新鲜的0.1mol/L亚精胺,…滴一滴加入 50l2.5mol/L的CaC12,室温下放置10min,10000 r/min离心l0min,弃上清液,加入60LLl的无水 乙醇,低速震荡悬浮,l0ktl金粉一DNA悬浮液涂 布大载膜,至干燥待用. l_3.4基因枪轰击茎尖组织PDS一1000/He(Bio— Rad)基因枪对茎尖进行轰击转化,轰击参数为可裂 膜压力为llO0psi,轰击距离分别为6cm和9cm, 收稿日期:2004—03?08接受日期:2004.09.06 通讯作者.Tel:0571?86971678.E-mail:maobz@zjuedu.cn 646研究论文 每个处理重复4次. 1.3.5转化子的筛选经轰击的茎尖组织接种到 增殖培养基恢复培养一周,再接种于含Kan的筛选 培养基筛选抗性转化子. 1.4转基因植株的PCR检测 1.4.1转基因植株的DNA提取转基因非洲菊植 株DNA的提取方法参照文献[2】,有些步骤进行了 改良,步骤如下:称取1g非洲菊叶片,用液氮研 磨至粉状.加入8m1经预热的提取缓冲液(100mmol/L Tris—HCIpH8.0,20mmol/LEDTA,1.4mol/LNaC1, 2%CTAB)预热1h,每隔10min摇一次,加入等 体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀,10000r/min离 心10min,取上清液加入1/10体积的CTAB/NaCl (10%CTAB,0.7mol/L)混匀,再加等体积的氯仿/ 异戊醇(24:1)混匀,10000r/min离心5min,取 上清液加入213体积的异丙醇,轻轻混匀.事温放 置,钩出DNA絮状沉淀,吸千,溶于TE,经RNA 酶消化后,再经乙醇沉淀纯化.制备的DNA样品 用于PCR分析. 1.4.2转基因植株的PCR扩增以扩增NPTII 基因片段为转基因阳性鉴定.NPTII基因的引物为 P1:5一GCTCGACGTTGTCACTGAAG一3':P2:5一 TCGTCCAGATCATCCTGATC.3,对转基因植株进 行PCR扩增(94?1min,58?1rain,72?20S), 35个循环,72?10rain延伸.反应产物于0.8% 琼脂糖电泳检查. 2结果 2.1不同激素组合培养基对非洲菊不定芽增殖的 影响 为了建立盆栽非洲菊高效的增殖体系,设计了 以不定芽方式快速增殖的实验.取2,3cm长的小 苗接种于16种不同激素组合的增殖培养基中,一个月 后,统计不同组合培养基不定芽增殖能力,见表1. 由表1可见,BA浓度为0mg/L,NAA浓度 为0.1-4).3mg/L时,这些处理对不定芽的增殖能力 与处理1不存在显着差异;在BA浓度为0.51.5mg/ L,NAA浓度为0.1-4)_3mg/L时,各处理对不定芽 的增殖诱导能力与处理1存在显着差异,而各处理 间只有BA浓度为1.5mg/L时,对不定芽的诱导增 殖存在显着差异.这些结果表明NAA对本材料不定 芽的诱导增殖无明显影响,而细胞分裂素在此起主 导作用,这与关于春石斛不定芽诱导的研究报道一 表1不同激素组合的培养基对非洲菊不定芽增殖的影响 川列中不I列小写字母表示差异达着水,(P<0.05). 致【3】.在实验中,还发现长期采用1.5mg/LBA的 增殖培养基,继代5次后,植株容易导致玻璃化, 这表明非洲菊长期生长在高浓度细胞分裂素状态 下,高频率的诱导增殖,可能影响了内源激素及有 机物等营养物质的积累.在产业化生产中,在要追 求高的繁殖系数同时,应该结合试管苗的健壮程 度,因为试管苗的健壮程度与移栽成活率呈相 关.为此,对于非洲菊的增殖培养基应该选用: 1.5mg/LBA的增殖培养基与增殖频率相对低但试管 苗健壮的0.5mg/LBA的增殖培养基交替使用,可 以得到较好效果. 2.2非洲菊小苗对Kan的敏感性 小苗在不同浓度Kan选择压力下培养1个月后 的生长统计状况见表2. 由表2可见,当Kan的浓度达到25mg/L时, 非洲菊小苗培养1个月后全部死亡,因此本实验采 用25mg/LKan选择转基因植株,与Elomaa等[41报 道的一致.在本实验中,也发现当Kan浓度达到15 ing/L时,植株新叶呈黄白色,增殖能力降低. 表2非洲菊小苗对Kan的敏感性 2.3轰击距离对转化频率的影响 *小JI.I_r;j.,l正机采的噌J 非【L【斑虹iJ-|.儿-辅^筛选坫非lrL(25mg/l Kan的垧峨球LitJr?"坼选】十…c『境if荇 址扎柑僻.牲,.扎}_株避fJPCR椅删. 45转化J』]Jl增iI1240bp的NPTl】『I<JI的 毁.JrllpcAMBIA2200埙扎世』5【?刈 柑.2机转弛川吝十I转jL?】,洲墒特 曲It-3 m丧J々化1.6"个欠.执褂 Kanj织…^十.f剑PCR"剐转化 451,.i川燕rl1高6ci11转化坝半lL仃]72cA, 表3轰击距离转化频窜的影啊 fJ^^…蛐,IlP(|】I 圈2转基固非洲菊植榨I)NA的P(R结巢 I^MB1^27-01)II『hi||-.WTIlld.I—II"II ,1Ikh1)Atadd~r 『nI靶-I『岛9C113旧转化一嘶午J土州【【Jq哪 毁】离n勺转化.车行撇 3讨论 帅『',化一ill_栅【纵蚺养址诎 I外J泛川晌h物拽求I.J1l自瑞号壮 箨流fn勺j水譬数.I:1f】]f】'J-l61芈ml甘增 录鼬同时.拦结锻.J【【『的质….为试1的质 冀荇琳代能J和盐竹mH档收成活率,蜮尝 J打L战小!I仃.『_1】II物北长利{如迎 鹾臻峨.能把岭峨IJ,,化 . 此,n:洲饷恍浊吼技术I.』,l 遁?哥询激g,Jf!~lli培斥判慨激采埔J释尘 件陵用时综母啦种i'1}坍l哑 利川墟州杯北水坫Jf'缝冉屯 蚺们状良nJJ新夼种圮他J'f,Ik毖的必然b L二埘非1埔ii埔拖?,I僻i-I,艘蝗 k,oIJT茸辅l:他J_IJ址?川卅宄. 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Tel:86—57l-86971678, E.mail:maobz@ZJueduc" 234567 . =詈甜.em,,mVnh . , 砌."兽l,?.兰.董m.. (耋一"m p.nl三 1e吐n 孙删mn陀0:.nmb\?0n旧9一 1暑0tUc m吣gU 一一一,, 咖 ,一一一一 州,,,一一