FISH实验操作步骤 FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成 ...FISH实验操作步骤 FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成 ...
FISH实验操作步骤
FISH试剂(1)1×PBS:由10×PBS溶液稀释而成，储存于4?;(2)20×SSC(pH7.0);(3)2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成;
FISH试剂
(1)1×PBS:由10×PBS溶液稀释而成，储存于4?;
(2)20×SSC(pH7.0);
(3)2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成;
(4)25mg/ml蛋白酶K消化液。
(5)变性液(70,甲酰胺+2×SSC，pH7...
FISH实验操作步骤 FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成 ...
FISH实验操作步骤
FISH试剂(1)1×PBS:由10×PBS溶液稀释而成，储存于4?;(2)20×SSC(pH7.0);(3)2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成;
FISH试剂
(1)1×PBS:由10×PBS溶液稀释而成，储存于4?;
(2)20×SSC(pH7.0);
(3)2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成;
(4)25mg/ml蛋白酶K消化液。
(5)变性液(70,甲酰胺+2×SSC，pH7.0):4ml20×SSC;8ml蒸馏水;28ml甲酰胺。每次新鲜配制。 (6)杂交后洗涤液:20×SSC4ml;蒸馏水16ml;甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。
实验步骤
1、脱蜡:
1)二甲苯脱蜡3次，每次5min;
2)100,酒精两次，每次2min;
3)移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:
1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下:2×SSC40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2)37?水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37?孵育20min。
3)×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4)梯度酒精脱水(-20?预冷)。
3、变性:
1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液;
2)78?水浴槽中平衡预热混合液染色缸;
3)78?孵育8min;
4)即移入-20?预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20?预冷酒精内，每缸2min;
5)空气干燥。
4、杂交:
1)准备探针;
2)取一个较大的湿盒，交叉放置切片;
3)滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片;
4)盖上湿盒盖，37?孵育12h,16h。
杂交后的水洗:
5)镊子小心去除盖玻片;
6)43?预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min;
7)2×SSC(37?)洗两次，每次10min;
8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测:
9)从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。 10)每张切片使用30μl,60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min; 11)去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。
扩增:
12)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出;
13)每张切片滴30μl,60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min; 14)去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min; 15)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出;
16)每张切片滴30μl,60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min; 17)1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色:
1)张切片加10μl,20μlDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2,5ml; 2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20?冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观
察。
PRINS步骤
1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS;
2、用0.2mol/L盐酸处理5min;
3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37?15min;
4、分别用80,，95,和100,酒精脱水，室温干片;
5、加PCR混合液25μL(10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2，各加200μmol/LdATP，
dCTP，dGTP，1.5mmol/Ldig-11-dUTPl.5μl，引物250ng，TaqDNA聚合酶2U)，加盖片; 6、94?变性5min后置入65?湿盒中5min;
7、用0.1×SSC液，65?洗5min;
8、片于65?10s,20s;用4×SSC-0.1,吐温20液42?洗5min，2次; 9、经BufferI液洗后滴加20,羊血清封闭30min;
10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h;
11、Buffer?液洗5min;
12、用BCIP-NBT显色1h,2h，在镜下控制，终止显色;
13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。
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