生物制药技术试验

生物制药技术实验 实验一 多粘菌素 E 发酵及管碟法测定生物效价 一、目的要求 了解抗生素发酵的基本过程。 了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。 学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。 二、基本原理 多粘菌素 E 是由多粘芽孢杆菌产生的一种碱性多肽类抗生素，由 10 个氨基酸和 1 个脂肪酸衍生物 构成。结构如图 5-1。 多粘菌素 E 主要对绿脓杆菌、百日咳杆菌、大肠杆菌等革兰氏阴性细菌有显著的杀菌作用(是作用 于细胞膜的抗生素)。是治疗烫伤、肠道疾病、呼吸道疾病、尿路感染、眼部感染及外科手术感染时较 好的药物。 抗生素液体发酵共分三大工序：菌种、发酵、提炼。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。 (一) 菌种 图 5-1 多粘菌素 E 的结构式 生物制药技术实验 种子质量指标：无杂菌，全部形成芽孢，摇瓶发酵效价达 35 000 u/mL 以上（30℃，48 h 培养， 方可用于生产。 （二） 发酵 抗生素发酵过程除需经常镜检排除杂菌污染外，接种 12 h 后，每 2 h 进行一次 pH、生物量、总糖、 还原糖、氨基氮测定。多粘菌素 E 发酵一级种子同时需检测 2，3-丁二醇，发酵需检测糊精和抗生素效 价。 一级种子质量指标：无杂菌，全部杆菌，粗壮整齐，无噬菌体；pH 5.5~6.0；刚刚出现 2,3-丁二醇。 二级发酵质量指标：菌体粗壮整齐，无噬菌体和杂菌感染；pH 6.0；糊精刚刚消失；多粘菌素 E 效价 10000~35000 u／mL。 (三) 提炼 衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。 生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。管碟法是扩散法的一种。本实验采用管碟法测定抗 生素的效价。 管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管，叫牛津杯，将抗生素溶液装满小杯，并在含有敏 感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透作用，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明 的抑菌圈。抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生 素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u／mL)等因素有关。 抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。 将已知效价的多粘菌素 E 硫酸盐标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶 液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。 三、实验材料 (一) 菌种 多粘芽孢杆菌 19、大肠杆菌 A1.543、检测多粘菌素 E 敏感指示菌。 (二)培养基(见附录) 1．麸皮培养基(保存和活化菌种用) 配制麸皮培养基 100 mL，分装 30 支试管、每管约 3mL 培养基，100Pa 灭菌 20 min．冷凉 摆斜面，供全班同学使用。 2．种子培养基 砂子孢子 （4℃±1℃冰箱保存） 第一代孢子（试管斜面） （28℃麸皮培养基，培养 5 d） 第二代孢子（茄瓶或克氏瓶） （28℃麸皮培养基，培养 5 d） 种子罐发酵（一级，种子培养基） （30℃±2℃，培养 12～16 h） 发酵罐发酵（二级，发酵培养基） （28～30℃，培养 48 h） 放罐 发酵液 滤液 中和滤液 饱和树脂 解吸液 白色粉末（成品）多粘菌素 E 硫酸盐 多粘菌素游离碱 中和氧化滤液 草酸酸化 板框压滤 加 NaOH 中和 板框压滤 中和、氧化、过滤 加氨水沉淀 离心甩干，洗去氨 加 6 mol/L H2SO4,调 pH 6.0~6.5, 溶解 加 NaOH 及 KMnO4 解吸 喷雾干燥 1 mol/L H2SO4 吸附 上离子交换柱 生物制药技术实验 配制 200 mL(实际 160 mL)种子培养基，分装于 250mL 锥形瓶，每瓶装 30mL。100 Pa 灭菌 20 min， 供 4 人使用。 3．发酵培养基 配制 300 ml(实际 240 mL)发酵培养基，分装于 500mL 锥形瓶，每瓶装 30 mL。100Pa 灭菌 20min， 供 4 人使用。 4．效价捡测用的底层培养基(含 2％琼脂) 配制 200mL 底层培养基，分装于 250 mL 锥形瓶，每瓶装 50 mL。100Pa 灭菌 20min，供 4 人使用。 5．效价检测用的上层培养基 配制 300 mL 上层培养基，分装于 250 mL 锥形瓶，每瓶装 50 mL。100 Pa 灭菌 20 min,供 4 人使用。 6．大肠杆菌 A1.543 保存和活化培养基 配制 100 mL 培养基，分装 30 支试管，每管约 3 mL 培养基，100 Pa 灭菌 20 min，灭菌后摆成斜 面，供全班同学使用。 7．无菌生理盐水 每管 5 mL，每人 2 管。 (三) 试剂 1. 2，3-丁二醇测定试剂(V．P．试剂) 见附录。 2. 糊精测定试剂(碘液) 见附录。 3. 多粘菌素 E测定试剂 见附录。 (1)1/15mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液 见附录。分别配制 500 mL 1／15 mol/L pH 6.0 KH2PO4 溶液； l00mL 1/15mol/L pH 6.0 Na2HPO4·2H2O 溶液。将上述二种溶液按 KH2PO4:Na2HPO4＝9:1 比例混合，然 后分装于 250 mL 锥形瓶中，每瓶装 100 mL，100 Pa 灭菌 20 min，供全班同学使用。 (2) 多粘菌素 E 标准液 见附录。先用 1/15mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液配制 1mL 含 10 000 单位多粘 菌素 E 母液，贮于冰箱中。临用前再稀释至每 mL 含 1000 单位。 (四) 仪器 恒温箱、摇床、水浴锅、台式离心机、台秤等 (五) 其他物品 1. 每组两人，洗涤、包扎、灭菌物品 移液管(1mL)8 只、滴管(长管细口)8 支、镊子 4 把、培养皿 10 套、陶瓷盖 10 个，洗涤挑选规格相 同的牛津杯(8 个/每皿) 4 套。 2. 每组两人，洗涤备用玻璃器皿 大试管 4 支，小试管 8 支，离心管 4 支，玻璃小漏斗 4 个，5 mL 移液管 4 支，1 mL 移液管 4 支， 10 mL 移液管 8 支，250 mL 锥形瓶 4 个，载玻片 8 张等。 四、实验内容 (一) 发酵 1. 种子培养 将多粘芽孢杆菌 E 由斜面接入盛有种子培养基的锥形瓶内，于转速为 220~240 r/min 旋转式摇床 上振荡培养 12~16 h，进行镜检、pH 和 2,3-丁二醇测定。以 2,3-丁二醇出现时间为转移种子的最适时间。 本实验只选用培养 16 h 的种子接入发酵瓶。同时进行镜检、pH 和丁二醇测定。 2. 发酵 本实验发酵在锥形瓶内进行。 分别吸取培养好的种子液 3.5 mL，接入盛有发酵培养基的多个发酵瓶内(500 mL 锥形瓶盛发酵培 养基 30 mL，30℃振荡培养 36~48 h，一般培养至 40 h 取出 1 瓶发酵液，镜检并测定 pH 和糊精，其余 发酵瓶继续振荡培养，以后每隔 1 h 检测一次，直至无糊精时发酵结束。本实验采用培养 48 h 的发酵 液进行镜检、pH、糊精和多粘菌素 E 效价测定。 生物制药技术实验 (二) 提取(发酵液中多粘菌素 E 粗品提取) 抗生素可分泌胞内或胞外，分泌于细胞内的抗生素通常采用加热酸化处理，使细胞壁破裂，抗生 素释放。本实验采用此法。 取发酵液 25mL，加入 0.5 g 草酸，放在沸水浴中煮沸 0.5 h，使菌体内的多粘菌素 E 迅速释放，然 后用冷水迅速冷却，经滤纸过滤，此滤液即含多粘菌素 E 的样品。 (三) 测定 1. 镜捡 在油镜下观察简单染色涂片后的各生长期多粘芽孢杆菌个体形态，辨别有无杂菌和噬菌体污染， 菌体被噬菌体感染后，往往染色不匀，菌体变形。包括麸皮斜面、种子液和发酵液。 2. pH 测定 用精密 pH 试纸测定种子液转移和发酵终止时发酵液的 pH。 3. 2,3-丁二醇测定 种子瓶从 12 h 开始就检测 2,3-丁二醇，以后每 2 h 测定一次。取发酵液 2 mL，用蒸馏水稀释 5 倍， 3000 r/min 离心 10 min，取上清液约 0.5 mL，加 40%KOH 溶液约 1mL，再加 5% α-奈酚 3 滴，加 5% 碳酸胍 3 滴，摇动几分钟，或水浴加热 5 min，出现粉红色即可移种。 4. 糊精测定 发酵瓶 36~40 h 后，就开始测定糊精。取发酵液 1mL，用蒸馏水稀释至 25 mL，加 3 滴碘液，蓝 紫色消失就可终止发酵。 5. 多粘菌素 E 效价测定 本实验用不同浓度的多粘菌素 E 溶液作标准曲线，以抑菌圈直径的平方值为横坐标，多粘菌素 E 标准品效价的对数值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。具体作法如下： (1) 大肠杆菌菌悬液制备 取活化的大肠杆菌 A1.543 菌种接种于大肠杆菌活化培养基斜面，37℃ 培养 24 h，然后每支斜面加无菌生理盐水 10 mL，刮下菌苔，搓匀。 (2) 倒底层平板 将灭菌的 2%琼脂水底层培养基加热融化后，冷凉至 45~50℃左右，倾倒入培养 皿制成底层平板，每人 2～3 个，凝固后于皿底贴上标签。 (3) 制备混菌上层平板 将检测用上层培养基加热融化后，冷凉至 50℃左右，50 mL 上层培养基 加入大肠杆菌菌悬液 0.5mL，轻轻摇匀。在每一培养皿底层平板上加入 10 mL 混菌上层培养基(动作迅 速，以免培养甚中琼脂凝固；倾倒上层培养基时不要有气泡。若有气泡应赶到平板边缘)，凝固后成上 层平板即为双碟备用。制备双碟时必须在水平的桌面上，并选择平底的培养皿。贴好标签的培养皿， 放于白瓷盘上。 (4) 滴加多粘菌素 E 标准品和样品 先将 10 000 u／mL 的标准多粘菌素 E，用 1/15mol／L pH 6.0 磷酸缓冲液稀释成 800、1000、1200 u／mL。根据酸化后滤液颜色粗略估计发酵样品效价，用 1/15 mol/L pH 6.0 的磷酸缓冲液稀释至 1000 u／mL。 每人取制备好的 2～3 个双碟，打开皿盖，用无菌镊子夹取已灭菌的钢管(牛津杯)，每个双碟中放 置钢管 6 个(如图 5－1～2 所示)。其中相间隔的 3 个钢管滴加多粘菌素 E 标准液。另外 3 个钢管滴加 发酵液样品。A 管中用无菌滴管滴加多粘菌素 E 800 u／mL 的标准液，B 管滴加多粘菌素 E 1000 u/mL 的标准液，C 管滴加多粘菌素 E 1200 u／mL 的标准液，D 管滴加发酵样品稀释液。滴加时必须仔细小 心，勿在小钢管中形成气泡，勿使溶液流出管外，加的量各管要一致，恰好滴满。滴加完毕后，加上 灭菌陶瓷盖。将放双碟的白瓷盘小心平端于 37℃恒温箱内，培养 6～8 h 后取出。 (5) 抑菌圈直径的测量及校正 将双碟中的钢管倒入白瓷缸中，加洗涤灵和水，然后煮沸 0.5 h， 清水冲洗晾干。用玻璃皿盖换下白陶瓷盖，然后用卡尺测量双碟中每管抑菌圈的直径。 生物制药技术实验 按 2～3 个双碟中 1000 u/mL 抑菌圈直径的平均值校正抑菌圈直径。例如：标准状态下 l 000 u／ mL 多粘菌素 E 抑菌圈直径为 18.00 mm，若我们所测 B 管(1 000 u/mL)抑菌圈直径总平均值为 17.8mm， 校正值为 18.00 mm-17.80 mm＝+0.20mm。则双碟中所有钢管浓度的抑菌圈直径也应加上 0.20 mm，即 得校正后的数值。若我们所测B管(1 000 u/mL)抑菌直径总平均值为18.20 mm，校正值为18.00 mm-18.20 mm＝-0.20 mm，此组某浓度的抑菌圈直径也应加上-0.20 mm，即得校正后的数值。 (6) 标准曲线的绘制 以各浓度的抑菌圈直径的校正值平方为横坐标，以标准品浓度(u/mL)的对数 值为纵坐标，纸上绘制标准曲线。 (7) 发酵样品效价汁算 以样品稀释液抑菌圈直径的校正值查标准曲线，得出相应的效价单位，再 乘以稀释倍数，即得发酵液的效价单位。 五、实验 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 内容 (一) 将所测量各浓度多粘菌素 E 标准品和发酵液样品抑菌圈直径记录于 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 5-2。求出各浓度多粘菌 图 5－2 效价测定示意图 A 800 u/mL；B．1000 u/mL；C.1200u/mL；D. 样品稀释液 生物制药技术实验 素 E抑菌圈直径总平均值和校正值。 表 5-2 标准品和发酸液样品抑菌圈记录 管 直径/mm 效价/u/mL 平均值/mm 校正值/mm A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 ┆ ┆ D9 (二) 绘制多粘菌素 E标准曲线。计算出发酵液的效价。 （三）记录或绘图表示发酵过程不同阶段镜检、pH、2,3-丁二醇、糊精及生物效价。 （四）结合思考 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 讨论多粘茵素 E测定的影响因素和发酵结果。 六、思考题 (一)制备双碟时为什么必须在水平桌面上、并选择平底的培养皿? (二)敏感指示菌的生长时间和菌液浓度对抑菌圈直径有何影响? (三)为什么各钢管滴加量要一致 7为什么培养时加陶瓷盖而不加破璃皿盖? (四)麸皮斜面菌种的指标是什么?种子和发酵控制的指标是什么?为什么要特殊控制? 图 5-3 效价对数与抑菌圈直径平方的线性回归图 生物制药技术实验 附录: 多粘菌素 E发酵及管碟法效价测定用培养基 1 麸皮培养基(保存和活化菌种用) 麸皮 3.5 g 琼脂 2.0 g 自来水 100 mL 自然 pH 煮沸 0.5 h，用棉花或纱布过滤,分装试管。 100 Pa 灭菌 20 min。 2 种子培养基 玉米淀粉 1.5 g 花生饼粉 2.0 g (NH4)2SO4 0.8 g NaCl 0.2 g CaCO3 0.5 g 麦芽糖 2.5 g 玉米浆 1.0 g KH2PO4 0.03 g MgSO4·7H2O 0.01 g 荼乙酸 0.0008 g 自来水 80 mL 自然 pH 100 Pa 灭菌 20 min。 配制时玉米淀粉用少量冷水调成糊状，加热溶解；其他药品另一起加热溶解，然后两者混合，再煮沸 片刻立即分装。在每个 250 mL 锥形瓶中分装 30 mL 培养液。 3. 发酵培养基 玉米淀粉 5.0 g 玉米粉 3.5 g (NH4)2SO4 1.8 g CaCO3 0.95 g 自来水 80 mL 自然 pH 100 Pa 灭菌 20 min。 配制时先用少量冷水将玉米淀粉调成糊状,加热溶解；其他药品另一起加热溶解，然后两者混合，在煮 沸片刻立即分装，每 500 mL 锥形瓶中分装 30 mL 培养液。 4.效价测定用的下层培养基 琼脂 2.0 g 蒸馏水 100 mL 100 Pa 灭菌 20 min。 5. 效价测定用的上层培养基 蛋白胨 1 g 葡萄糖 0.25 g 牛肉膏 0.3 g NaCl 2 g 生物制药技术实验 K2HPO4 0.25 g 琼脂 1.6~1.8 g 蒸馏水 100 mL pH 7.0~7.2 100 Pa 灭菌 20 min。 6 大肠杆菌 A.1.542 保藏和活化培养基 蛋白胨 0.6 g 酵母膏 0.3 g 牛肉膏 0.15 g 琼脂 1.5~2 g 蒸馏水 100 mL pH 7.2~7.4 100 Pa 灭菌 20min。 试剂 （一） 2,3—丁二醇试剂(测多粘菌素 E发酵种子液用) l. 5% 碳酸胍水溶液 2. 5% 荼酚无水乙醇溶液 3. 40% 氢氧化钾 乙酰甲基甲醇还原时生成 2,3-丁二醇。 (二) 碘液(淀粉水解试验和测定多粘菌素 E 发酵液糊精时使用，与革兰氏碘液相同。） 碘 1 g 碘化钾 2 g 蒸馏水 300 mL 配制时，先将碘化钾溶于 5~10 mL 水中，再加入碘 1 g，使其溶解后，加水至 300 mL。 (三) 标准多粘菌素 E 溶液 标准多粘菌素 E 制品为 1 mg 约有 18 000 单位。精确称取多粘菌素 E 标准品 55.56 mg，用无菌 1/15 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液溶解定容至 l00 ml，即配制成 10 000 u/mL 的多粘菌素 E 标准母液,在 4℃ 下 保存备用。 将 10 000 u/mL 多粘菌素 E 母液用无菌 1/15 mol/L pH 6.0 的磷酸缓冲液稀释成 600、800、1000、 1200、1400 等 u/mL。用滤膜滤器过滤除菌，贮存于无菌试管或无菌锥形瓶中，最好临用前配制。 (四) 1/15mol/L 磷酸缓冲液 (pH 6.0) 1/15 mol/L Na2HPO4:l/15 mol/L KH2PO4＝1mL：9mL 先配制 1/15mol/L Na2HPO4： Na2HPO4·2H2O 的相对分子质量为 178.05；配制 1/15 mol/L 溶液应称取 11.876 g Na2HPO4·2H2O， 用蒸馏水定容至 l 000 mL。 再配制 1/15 mol/L KH2PO4： KH2PO4相对分子质量为 136.09；l/15 mol/L 溶液应称取 9.0788 g KH2PO4，用蒸馏水定容至 1 000 mL。 然后按比例配制即可。 （五）0.85%生理盐水 称取 NaCl 0.85 g，溶解于 100 mL 蒸馏水中，100 Pa 灭菌 20 min。 生物制药技术实验 实验二 蛋清溶菌酶的分离 一 目的要求 掌握柱层析的基本操作； 了解药用酶类分离提纯的一些技术手段。 一 原理 溶菌酶具有消炎、镇痛、止血的作用。溶菌酶 E.C.3.2.1.7 是糖苷水解酶，相对分子质量 14 307， 由 129 个氨基酸残基构成。其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达 11 左右。几乎所有的细 菌都有坚韧的细胞壁。革兰氏阳性细菌细胞壁的主要化学成分是肽聚糖。肽聚糖是由 N-乙酰葡萄糖胺 (NAG)与 N-乙酰胞壁酸(NAM)靠β-1，4-糖苷键形成骨架，并通过 NAM 部分的乳酰基与寡肽交联而成。 溶菌酶能水解 N-乙酰葡萄糖胺与 N-乙酰胞壁酸之间的β-l，4-糖苷键。甲壳质是 N-乙酰葡萄糖胺以β -l，4-糖苷键连接起来的聚合物，也能被溶菌酶水解。 从鸡蛋清中分离溶菌酶可以选用多种不同的方法和步骤。本实验采用下列分离纯化步骤，即热变 性与等电点选择性沉淀；聚丙烯酸处理；葡聚糖凝胶柱层折；聚乙二醇浓缩。溶菌酶具有耐热性，它 在酸性条件下能经受较长时间的高温处理而不丧失酶活性，并且溶菌酶又有特别高的等电点。据此， 用热变性与等电点沉淀相结合的方法可除去大部分杂蛋白。聚丙烯酸是一种多聚电解质，在特定的 pH 和离子强度条件下，它能和某些蛋白质一起凝聚沉淀，而对多糖、核酸等物质则没有这种作用。溶菌 酶在酸性条件下能与聚丙烯酸结合形成凝聚物，当有钙离子存在时溶菌酶又能从这种凝聚物中分离出 来，并生成聚丙烯酸钙沉淀，后者经过硫酸的酸化可再变为聚丙烯酸。同时，一旦抽提液内的溶菌酶 与聚丙烯酸结合，所形成的凝聚物立即沉降粘附于容器底部，倾倒除去上层液体使溶菌酶既得到纯化， 又得到浓缩。最后，用葡聚糖凝胶柱层析使杂蛋白、溶菌酶和钙离子分开。 二、操作 (一) 蛋清溶菌酶的分离 1. 热变性与等电点选择性沉淀 取新鲜蛋清用 1%NaCl-0.05 mol/L HCl 溶液搅拌稀释， 加 20% HAc 调至 pH4.6，滤液，记录体积，并留样 2 mL，待分析(I)。预先准备好沸水浴，滤液置于沸 水浴迅速升温至 75℃，全过程 3 min 左右。用流动水速冷后，3000 r/min 离心 20 min，其沉淀物为热 变性杂蛋白，而溶菌酶在上清液中。收集上清液，记录体积，并留样 2 mL 待分析(II)。 2．聚丙烯酸处理 在上述上清液内(约 pH6.0 左右)滴加 10% 聚丙烯酸(用量为上清液体积的 25%)， 并慢速搅拌，当凝聚物出现后，溶液应为 pH3 左右。静止 30 min 以后，凝聚物粘附在容器底部。倾去 上层清液，加入约 1 mL 蒸馏水，并滴加少量 0.5 mol/L Na2CO3 使凝聚物溶解。此时为 pH6 左右。然 后边搅拌边滴加 500 g/L CaCl2 溶液(体积为聚丙烯酸量的的 1/ 12.5)。将沉淀物压干后弃去。溶液如果 不清亮，可以离心或简易过滤，并用极少量水洗涤滤纸(注意：由于要求柱层析上样量在 l0 mL 以内， 因此加入的各种液体体积要尽量小)。收集滤液于刻度试管中，记录体积，并留样 0.5mL 待分析（Ⅲ)。 3. Sephadex G-50 柱层析 (1) 装柱：称取 15 g Sephadex G-50，加入 300 mL 蒸馏水溶胀 6 h 以上，并于水浴中加热去气泡， 冷却后装入玻璃层析柱(床体积约 2.5 cm x 25 cm)。用 6 g/L NaCl 溶液 200 mL 流洗平衡。 (2)上样：在上述滤液内加入固体 NaCl 使终浓度为 50 g/L 准备上样。上样时，先吸去层析柱凝胶 面上的溶液，在用滴管沿壁加入样品。样品量不宜超过 l0 mL。加完后打开层析柱出口，让样品均匀地 流入凝胶内。 (3) 洗脱：样品流完后，先分次加入少量 6 g/L NaCl 洗脱液洗下柱壁上样品，最后接通蠕动泵，继 续以 6g/L NaCl 洗脱，调节操作压使流速约为 7~8 mL/10 min，用部分收集器收集后， 10 min/ 管，总 共收集 200 mL 左右。 (4) 分析：记录各管体积，并用紫外光吸收法测定蛋白质浓度。合并含有蛋白质的收集管，并用草 酸检定 Ca2+，待测定酶活性(Ⅳ)。 4 聚乙二醇浓缩 为了提高酶浓度，需将上述层析洗脱液进行浓缩。将洗脱液放入透析袋内，置 生物制药技术实验 容器中，外面覆以聚乙二醇(相对分子质量 2 万左右)，容器加盖，酶液中的水分很快被透析膜外的聚乙 二醇所吸收。当浓缩到 5 mL 左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液，记录体积， 留样 0.5 mL，待分析(V)。 (二) 溶菌酶活性测定 取含有蛋白质的流出液稀释 30~50 倍进行酶活性测定。为了简化稀释步骤，可用微量进样器取样 品 10 L，加 0.5 mL 的 0.5 mol/L 磷酸盐缓冲液(相当于稀释 50 倍)，pH6.5，混合均匀，37℃预热 2 min。 然后加入 37℃预热的底物溶液 0.5 mL，反应 15 min后，加入 2 mL 乳化剂停止反应。反应液经 3000 r/min 离心 10 min。取上清液在 721 型分光光度计上 540 nm 波长处比色。空白管以磷酸盐缓冲液代样品，其 他操作同上。 三、试剂和仪器 （一） 试剂 1. Sephadex G-50； 2. 10 g/L NaCl-0.05 mol/L HCl； 3. 20% HAc； 4. 10% 聚丙烯酸(临用时配制)； 5. 0.5 mol/L Na2CO3； 6. 500 g/L CaCl2； 7. NaCl； 8. 6 g/L NaCl； 9. 饱和草酸溶液(室温条件下)； 10. 酶活力测定所用试剂： (1) 底物溶液 取 1 g 艳红 K-2BP 标记溶性微球菌 M.lysodeikticus 悬于 100 mL 0.5 mol/L pH 6.5 磷酸盐缓冲液置冰箱内保存备用。 (2) 乳化剂 2 g Brij-35(聚氧乙烯脂肪醇醚)加 50 mL 蒸馏水微热使溶解，冷却后定容至 100 mL。 吸取此液 10 mL，用 0.6 mol/L HCl 定容至 200 mL 备用。 (3) 0.5 mol/L pH6.5 磷酸盐缓冲液。 (二) 主要仪器 1. 10L 微量进样器； 2. 层析柱(2.5cm×34cm)； 3．电热恒温水浴锅； 4．部分收集器； 5．离心沉淀机； 6．721 型分光光度计； 7．751G 型分光光度计。