革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较
细胞壁 革兰阳性菌 革兰阴性菌
强度 较坚韧 较疏松
厚度 厚，20－80nm 薄，10－15nm
肽聚糖层数 多，可达50层 少，1－2层
肽聚糖含量 多，占细胞干重50－80％ 少，占细胞干重5－20％
糖类含量 多，约45％ 少，15－20％
脂类含量 少，1－4％ 多，11－22％
磷壁酸 ＋ －
外膜 － ＋
革兰染色液
1. 结晶紫染液 结晶紫酒精饱和液（95％酒精 100ml，结晶紫 10g）20ml，1％草酸铵水溶液 80ml 将以上两液分别配制后，按上量混合，以滤纸过滤备用。
2. 碘液 碘化钾2g，碘1g，蒸馏水300ml。先用2－5ml蒸馏水将2g碘化钾溶解，然后再加入碘，待碘完全溶解后，再加蒸馏水至总容量为300ml即成。
3. 稀释石炭酸复红染液 取碱性复红10g溶于95％酒精100ml中，制成碱性复红酒精饱和液取此饱和液10ml与5％石炭酸水溶液95ml混匀，制成石炭酸复红染液，取石炭酸复红染液10ml加入蒸馏水90ml中混匀，即成稀释石炭酸复红染液。
革兰氏染色
一、实验目的：
在细胞发放之前，利用
标准
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的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
二、实验原理：
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
三、实验用品准备：
灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器
四、操作步骤：
细菌涂片标本制作
1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
2 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层较快来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。
染色
4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
5 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
6 媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
7 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
8 脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。
9 复染：在涂片薄膜上滴加石炭酸复红稀释液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
10 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
11 干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌
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