细胞凋亡检测

联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 1 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 细 胞 凋 亡 检 测 cell apoptosis detection 流式细胞术·细胞凋亡·快速 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 试剂盒 BMS306FI rh Annexin V FITC KIT 300 test 5000 ANNEXIN V rh Annexin V FITC KIT 200 test 4880 BMS306FI/100T rh Annexin V FITC KIT 100 test 2850 BMS306FI/c rh Annexin V FITC KIT 020 test 1300 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 2 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 细 胞 凋 亡 检 测 技 术 与 方 法 ——凋亡现象的分析（一） 细胞凋亡一词来源于"apoptosis"， 原文是希腊文，apo的意思是从…， ptosis的意思 是落下。apoptosis原意表示树叶从树木上落下，读时第二个 p不发音，又称细胞程序性死 亡（PCD 、Programmed Cell Death），是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程 序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的 过程。细胞凋亡与有丝分裂相对，是生物体中一种普遍存在的现象。胚胎形成；衰老和损伤 细胞细胞的清除；自身反应性T淋巴细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归；干细胞在最 终分化到成熟的血细胞的一系列过程中，并非每个细胞都能够走到终点，相当一部分细胞， 甚至绝大部分细胞都会在中途凋亡；胸腺的 T细胞95％存活不到成熟 T细胞阶段；相当数量 的原始和幼稚红细胞在骨髓中发生“原位溶血”；这些生理或病理过程都与细胞凋亡密切相关。 细胞凋亡在形态和生化上有其明显的特征（见图-1）。在形态上，早期细胞核固缩、染色 体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜 皱折、卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏。最明显的特征是 Ca2+与 Mg2+依赖的骨源性 核酸酶的激活，使细胞核染色体从核小体间断裂，形成由大约为180～280bp或其多聚体组成 的寡核苷酸片断，琼脂糖凝胶电泳上形成特征性的“梯状带”（见图-20）。 图 1 细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间，但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程 中扮演着关键角色，及在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制广泛而深入地研究， 成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 3 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组 方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升 温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已经有商品化的产品出现， 大大加速了研究的进程。具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法。 第一部分 细胞凋亡的形态学分析 在细胞凋亡的发展过程中，最明显的实验证据是在光学显微镜和电子显微镜下观察到的 一些形态学变化。与细胞坏死时细胞肿胀、胞膜破裂和胞质溶酶体释放等引起的炎症反应的 现象相反，凋亡的共同特征是细胞收缩，以细胞核的形态改变尤为突出，但并不引起炎症反 应。光镜下，凋亡细胞体积缩小，染色质密聚集成斑块状。在组织内，细胞凋亡典型特征是 影响并出现于单个细胞，且凋亡的细胞周围有环状带。用相差显微镜（phase contrast light microscopy ， PCLM）可清楚地见到凋亡细胞的发泡（bledding）和凋亡小体（apoptotic body）。电镜下，凋亡细胞的变化更富有特征性。开始时，凋亡细胞体积缩小，失去细胞连接 （cell junctions）和一些特殊膜表面结构，如微绒毛（microvilli）的消失，染色质浓集 并靠近于核膜，列成沿核膜收缩的新月状体，细胞与邻近细胞、组织失去接触，但细胞膜、 线粒体、高尔基体等细胞器保持完整。然后，核体积近一步缩小，并可裂解为一个或数个致 密体，其与一定核糖体及各种细胞器成份形成具有完整膜性结构的凋亡小体。随之，凋亡细 胞或凋亡小体由邻近正常细胞或吞噬细胞识别、吞噬。利用扫描电镜（Scanning electron micrograph，SEM）可更加客观、真实地观察到凋亡细胞表面泡状突起的形成。以电镜结合定 量数字式影像技术可观察到凋亡细胞核浓缩时的细微变化，以碘化丙啶（propidium iodide， PI）对细胞核进行染色，激光共聚焦（confocal laser scan microscopy，CLSM）能十分清 楚地对凋亡细胞固缩的染色质及核碎片进行定位。现在有人利用缩时摄影术（time-lapse photography）对细胞凋亡的整个过程进行动态观察，这被认为是检测细胞凋亡形态学的金标 准，因其可排除其它形态学观察中因人为假象而使形态学指标不能重复。另外，用流式细胞 仪（flow cytometer ，FCM）也可进行形态学分析。 表 1 检测细胞凋亡的形态学方法比较 检查方法 可鉴定凋亡细胞的特征 光学显微镜（LM） 细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈 相差显微镜（PCLM） 细胞鼓泡、凋亡小体 透射电镜（TEM） 微绒毛消失、核染色质沿核膜分布、新月体形成、凋亡小体 激光共聚焦（CLSM） 凋亡细胞固缩染色质及核碎片定位 扫描电镜（SEM） 细胞表面泡状突起 流式细胞术（FCM） 低前向散射光（FSC）、高侧向散射光（SSC） 缩时摄影术（TLP） 凋亡细胞的形成过程 凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大 小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋 亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。 此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光 常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 4 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和 侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此 在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可 靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面 免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用 于活细胞的分类。 【操作方法】 （1）离心收集 1×106个细胞； （2）用 PBS 重悬细胞，200g离心 5分钟，弃上清； （3）缓慢重悬细胞于冷乙醇（-20°C）中（逐滴加入，每分钟不超过 1ml）； （4）在冰中孵育至少 30min（标本可在 4°C保存一周）； （5）200g离心 5分钟，弃上清； （6）重复（2）； （4）重悬细胞于 1ml PBS 中，上机检测。 图 - 2 在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上（见图-2），凋亡细胞与正常细胞相比，前散 射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关。在细胞凋亡形态鉴定的各种方法中， 除流式细胞仪外，其它检测手段均不能很好地对凋亡作定量分析，而且，费时、费力、重复 性欠佳（除缩进摄影术外）。但是，该法检测对象必须是活细胞才有意义，而且此参数无特异 性，因机械性损伤、Ficoll分离、不同固定液及时间均可改变细胞形态造成细胞光折射率的 改变。 第二部分 细胞膜结构改变分析 胞膜完整的活细胞对阳离子染料如台盼蓝（trypan blue）、碘化丙啶（PI）、溴化乙锭 （dthidium bromide，EB）、氨基放线菌素 D（7 amino-actinomycin-D，7-AAD）、叠氮溴化 乙锭（ethidium monoazide，EMA）等有拒染能力，但死细胞（包括凋亡后期的继发性坏死细 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 5 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 胞、机械损伤细胞、本身为坏死的细胞）可被上述染料标记。这些染料通常用于检测细胞活 力，其中PI是FCM分析与区别凋亡与坏死细胞最常用的荧光染料。同时，这些方法可与细胞 免疫标志同时进行，简单易行，但染料浓度、作用时间及温度因细胞而异，同批实验需条件 一致。需指出的是，细胞凋亡的早期由于细胞膜尚完整，但可出现细胞膜转运功能一过性的 损失，这个阶段凋亡细胞与正常活细胞相比，可对上述几种荧光染料的摄取量增加，但又不 如凋亡后期细胞那样明显或深染，如结合其它方法，可较好地区别早期或晚期的凋亡细胞和 正常活细胞。 利用对正常和凋亡细胞跨膜通透性不同（也可能还与凋亡细胞DNA染料结合能力有关） 的两种DNA染料同时染细胞，为鉴别凋亡或坏死细胞提供了较好的方法。吖啶橙（AO，一种 膜通透性较高的染料）和 EB双重染色方法应用较多。对正常细胞，AO将其染为强绿色，EB 染色较弱，对凋亡细胞，AO染色仍为阳性，EB红染轻度增加，对坏死细胞，EB红染色明显 增强，AO染色却变暗（EB诱导AO荧光淬灭）。 双笨并咪唑染料（bisbezinadazole dye）HO与PI两种荧光染料分别与凋亡细胞与坏死 细胞染色，因正常活细胞对两种染料都有拒染性，凋亡细胞有膜通透性改变，主要摄取 Hoechest染料，并与DNA结合在紫外光下呈蓝色荧光，而PI或7-AAD染色阳性的细胞为坏 死或凋亡后期继发性坏死细胞。通过FCM分析后可在细胞直方图中，用蓝色（Hoechst）对红 色（PI）将细胞分为正常，凋亡和坏死细胞。 现有两种Hoechst染料，即HO33258和HO33342，前者不能被正常细胞摄取，仅被凋亡 细胞摄取，因此，在区别凋亡细胞时更好。须注意的是，以带电或不带电荷的荧光染料检测 分析凋亡或坏死细胞膜通透性改变时，由于细胞种类、凋亡了展阶段、凋亡诱导类型的不同， 使凋亡发生的不同细胞之间的最佳条件如凋亡细胞摄取荧光染料的浓度、孵育时间及温度等 可显著不同。 一、PI/FDA方法 荧光素乙酸盐（fluorescein diacetate，FDA），本身不是荧光染料，但可以被活细胞 摄取，并由细胞内的乙酰酶水解，水解后的产物荧光素（fluorescein）贮留于细胞内显很强 的荧光。当细胞同PI和FDA孵育后，活细胞为绿色荧光素标记，死细胞为PI红染色。 二、Hoechst单染 Hoechest 33342和33258等为膜通透性染料，可使凋亡细胞着色浓密，这可能与凋亡细 胞膜通透性增加有关，也有人认为是P糖蛋白泵失活，Hoechest染料从凋亡细胞运出减少所 致。 细胞用Hoechst 33342孵育，由于结合于DNA上的染料增加，激发光移动到长波长区域。 这种现象最易观察，记录蓝色和橙色荧光之间的比率（橙色荧光，用检测PE的滤光片）。在 一个含有正常和凋亡细胞的混合体系中，凋亡细胞表现出更大的光谱移动。这样的区别可能 是由于Hoechest 33342有更大的毒性进入凋亡细胞。BAF3细胞用10μg/ml Hoechest 33342孵 育不同的时间。显示细胞的橙色和蓝色荧光，观察凋亡细胞群体随着孵育时间的增加荧光相 应地长移到橙色区域。凋亡和正常细胞的激发光的变化也可以用蓝/橙比例图活细胞设门来观 察。 实验使用BAF3细胞系，乏IL-3孵育16小时，37℃用10μg/ml Hoechst 33342染色5分钟。 流式细胞仪检测，蓝色与橙色荧光双参数图（见图-3），红色为的正常细胞，蓝色的为凋亡 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 6 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 细胞，绿色为死细胞，粉红的为碎片。 图-3 三、Heochst 33342 / PI双染法 PI和Hoechst 33258双染鉴别凋亡或坏死细胞也被广泛应用。这种方法依赖于活细胞、 死细胞、凋亡细胞对PI和Hoechst 33342两种DNA染料不同细胞膜通透性。死细胞可通透两 种染料，活细胞能够排出两种染料不能染色，凋亡细胞能够排出PI但不能排出Hoechst。 【试剂的准备和配制】 （1）Heochst 33342染液：用PBS配成10μg/ml的储存液，4℃避光保存。 （2）PI染液：用PBS配成5μg/ml浓度，4℃避光保存。 【染色方法】 （1）悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；贴壁生长 的细胞用含有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培 养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml，37℃孵育7～10min。 （2）4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。 （3）加入1.0mlPI染液，4℃避光染色15min。 （4）400目筛网过滤一次。 （5）流式细胞仪分析，Heochst 33342用氪激光激发紫外线荧光，激发光波长为352nm， 发射光波长为400～500nm，产生蓝色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波长为 488nm， 发射光波长大于630nm，产生红色荧光。分析蓝色荧光对红色荧光的散点图或地形图。 【结果分析】 在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，结果如下：正常细胞为低蓝光/低红光（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝光/低红光（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝光/高红光 （Hoechst 33342+/PI++）。 【说明】 （1）在蓝色荧光对红色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹， 可能是细胞凋亡的DNA进一步降解的缘故。 （2）这个方法只能适用某些细胞类型（T细胞很好）。 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 7 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 （3）这个方法是是时间依赖性的，Hoechst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一 般控制在20min之内为宜。如是太长可引起 Hoechst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移， 导致红色荧光与蓝色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。 （4）这个方法在染色后应尽快上机检测，因为这样的区别只是在染色后的较短时间内比 较明显。 【实例一】 如图-4，经地塞米松处理的T细胞，用 1μg/ml Hoechst染色5min，然后加入 PI，上机 检测。 【实例二】 如果用TO-PRO-3代替实验中的PI，那么同时染色两种使用PE FITC的细胞表面标记将 是可能的。尽管TO-PRO-3原来是635nm激发的染料，用高能量（>50mW）的488nm激光激发 它，能够发出荧光。发射波长在660nm处，这个PE的发射光谱有点重叠。用这样的方法，可 以检测特殊定义的某群细胞的凋亡状态（见图-6）。 四、LDS 751 与PI 双染 LDS（Laser Dye Styryl）751是一种红色DNA染料。凋亡细胞和死细胞因与LDS着染能 力的不同而区别，凋亡细胞和死细胞通过它们对死细胞甄别染料的着染能力差别加以区分（见 图-5）。 图 - 5 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 8 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 图 - 6 五、细胞膜表面结构分析 在细胞凋亡的早期，细胞膜的某些结构如伪足（pseudopodia）和微绒毛（microvilli） 消失，使凋亡细胞表面光滑。F-肌动蛋白（F-actin）是伪足的主要成份。毒蕈肽（phallotoxin） 是毒性环形多肽，其可以与F-actin结合，利用FITC-毒蕈肽可作为 F-肌动蛋白的探针。细 胞凋亡时两者的结合力减少或丧失。 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 9 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 第三部分 细胞膜表面标记改变的分析 图 - 7 图 - 8 如图 - 7、图 - 8所示，正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含有带负电的磷 脂（如磷脂酰丝氨酸，PS），而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在细胞凋亡早期，细胞 表面发生化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸可迁移到细胞外层表面，巨噬细胞就是通过识别凋 亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起 的炎症反应。 Annexin V是一种Ca2+依赖的，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细 胞膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。由于坏死细胞也可能在膜表面出现磷脂酰丝氨酸、 又在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其初期阶段细胞膜的完整性就破坏了， 故可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示剂并结合一种染料排除试验 以检测细胞膜的完整性的检测方法。 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 10 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料（如PI）有拒染性，坏死细胞则不能。细胞膜 有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光 产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。在 流式细胞术双参数散点图上（见图-9），左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上 象限是非活细胞，即坏死细胞，为（Annexin V +/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（Annexin V +/PI-）。 图 – 9 （一）有阴性细胞群体 例如在进行射线、药物对细胞作用的研究时，实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 中存在着一群在正常环境中培养 的细胞，这群细胞可以认为没有凋亡发生，其作为阴性对照进行试验。图-10为研究不同的 药品作用下细胞凋亡情况的变化。 图 – 10 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 11 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 （二）无阴性细胞群体 1．说明 直接针对某一标本，要求测定其中凋亡细胞的比率。 PI 检测：COULTER使用第三荧光检测通道检测，BD使用第二荧光通道检测。 2．染色 （1）常规制备单细胞悬液，用冷 PBS 洗两次后（若为全血要先溶血）取约 5×106个细胞， 1500rpm离心，弃上清，用 400μl 1×Binding Buffer 重悬； （2）分成 a，b，c，d，e五管，每管约 1×106个细胞； （3）a管不加任何试剂，作为阴性对照管； （4）b管加 2%的多聚甲醛中固定 30分钟，用 Annexin V 和 PI 双染，作阳性对照； （5）c 管只加 10μl PI液，避光孵育 15分钟； （6）d管只加 5μl Annexin-V液，避光孵育 15分钟； （7）e管加 10μl PI液和 5μl Annexin-V液，室温避光孵育 15min； （8）每管各加 400μl 1×Binding Buffer 上机检测。 3．检测 （1）检测阴性对照管（a），建立 Annexin V vs PI双参数点图，建立十字门 R1确定阴性 范围。调节电压将阴性细胞置于该区域。 （2）上 d管，通过调节补偿将 FITC漏入 FL2（或 3）的荧光去掉 （3）上 c 管，通过调节补偿将 PI 漏入 FL1 的荧光去掉 （4）上阳性对照（b）将十字门位置上调，大致包含双阳性细胞的 90% （5）上检测管（e），并读数。 方法更进一步改进，使用 Annexin V-PE进行凋亡检测，这使得可以同时使用使用 FITC 标记的抗体或绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）进行试验。7AAD或TO-PRO-3 可以检测死细胞。如图-11，用Annexin V-PE检测GFP阳性和GFP阴性细胞的凋亡情况。 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 12 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 图 - 11 第四部分 细胞内组分改变 一、线粒体膜电位的改变 在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制的深入研究， 发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡 诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。 现认为，凋亡细胞MMP的降低可能与细胞内还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH） 的减少有关，当GSH减少可致细胞内活性氧（ROS）增加，包括超氧化阴离子（superoxide anion） 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 13 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 和氧化型谷胱甘肽（oxidise GSH）增加。 有些染料可检测线粒体膜电位（mitochondria membrane potential，MMP）的变化。其 中常用的阳离子绿色荧光染料罗丹明 123（rhodamine 123，Rh123）可作为线粒体探针，其 可在正常活细胞的线粒体内聚集，当细胞 MMP降低，Rh123则减少，因线粒体膜的转运能力 降低可使MMP降低和电负性降低，故细胞线粒体聚集Rh123的能力丧失，使Rh123荧光强度 降低。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。 二、深酶体质子泵的改变 吖啶橙（AO）进行染色，这种染料在浓度较低（1～５μmol/L）时可对活细胞进行染色， 其红色荧光的强度也是反映溶酶体质子泵（proton pump）功能的一重要参数。AO呈弱碱性， 溶酶体内部的pH值较低。AO未带电荷时可以透过细胞膜，进入溶酶体内。一旦AO进入溶酶 体，由于含有较高水平的质子而被质子化。因此，这一染料就能包裹在这种小的细胞器中， AO积聚的程度在很大程度上决定了溶酶体跨膜pH差。而ATP依赖性的质子泵是维持溶酶体 pH梯度的主要因素。 发生早期凋亡的细胞，其溶酶体在结构上基本保持完整，没有发生改变，因而可使 AO 染料进行累积，也就是说细胞凋亡的早期，ATP依赖性的质子泵不会发生明显的改变。但随 着凋亡的发生，细胞溶酶体的结构和功能可受到影响轻度的改变，其对AO的摄取量减少。还 有坏死细胞失去溶酶体完整结构，也失去了积累AO染料的能力，因而其红色荧光很低。 第五部分 细胞 DNA含量分布 细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生一系列特征性改变，包括细胞核的改变、 细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等。1991年许多实验室独立报道了，由 于核的改变造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞的DNA可染性发生改变。 细胞凋亡时，核酸内切酶激活，导致DNA广泛断裂，这是细胞凋亡的特征性表现，也为 FCM鉴别细胞凋亡奠定了物质基础。目前检测凋亡细胞 DNA断裂的方法中，最常用、最简便 的就是DNA含量分析。细胞在染色之前，首先经去污剂处理，使细胞通透性增加，或者用沉 淀固定剂进行固定。由于细胞膜的通透性增加和固定剂的影响，使降解的DNA不能完全封闭 于细胞中，在细胞洗染过程中DNA碎片从细胞内逸出。因此，凋亡细胞DNA含量减少；加之 由于DNA的降解，与荧光染料的结合减少，故细胞DNA荧光强度降低；DNA直方图上显示在 G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体或称亚G0/G1峰，又称凋亡细胞峰（见图 - 12）。 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 14 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 图 – 12 通过FCM测定DNA的含量，亦可同时分析凋亡细胞的周期位置，故FCM测定DNA含量可 同时研究凋亡细胞的周期特异性。Andreff等用 FCM研究细胞凋亡与细胞周期的关系后提出 凋亡分两个阶段：早期凋亡（early apoptosis）即发生于药物作用于特定的周期时相的细胞 凋亡（homo-phase apoptosis）多在作用后3～8小时内。而延迟凋亡（delayed apoptosis） 是指发生于同一周期的细胞凋亡（homocycle apoptosis），或发生在分裂期后即子代细胞或 称为分裂后细胞凋亡（post mitotic apoptosis）。他们指出：化疗药物对细胞作用是药物浓 度和作用时间依赖性的，可分为四个阶段：（1）亚细胞阻滞阶段时DNA迅速修复，细胞存活， 并具克隆性，随后可发生细胞分化，子代细胞的基因突变；（2）DNA损伤，干扰细胞周期阶 段或者DNA损伤后再修复，可导致子代细胞的突变或发生延迟凋亡；（3）药物浓度的进一步 加大则可导致早期凋亡和延迟凋亡；（4）更大剂量则造成细胞坏死。另外，应用FCM方法， 通过对DNA和RNA的联合检测，可以鉴别出G0期细胞。因此，可分析细胞凋亡与G1或G0期细 胞的关系。FCM对DNA含量的测定直观、简便、迅速、实用，是FCM判断细胞凋亡的基本方 法。 DNA降解的程度取决于细胞凋亡的阶段、细胞的类型和凋亡诱发因素的特性。另外，染 色过程中 DNA逸出量的变化也影响 FCM检测结果。据研究，将高浓度的磷酸-枸橼酸缓冲液 （phosphate-citrate buffer，PCB）较Hank平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution， HBSS）更易使凋亡小体析出，即将PCB加入漂洗液中，可增高降解 DNA的逸出量，使亚峰 G0/G1 峰更为清晰，从而提高FCM区别凋亡细胞与正常细胞的能力。 DNA含量测定在检测的细胞凋亡过程中的局限性在于其特异性不很高，因为：（1）亚G0/G1 峰的细胞数目只代表了核碎片的数目，并不代表凋亡细胞的细胞数目；（2）亚G0/G1峰并非凋 亡细胞所特有，非整倍体细胞、机械损伤细胞均可造成亚G0/G1峰。因此，FCM DNA含量检测 方法进行凋亡细胞分析时应注意结合其它形态学、免疫学或生物学方法或死活细胞计数，标 准二倍体、免疫标志等参数进行综合分析，以更为准确地分析凋亡细胞状态。 【实例一】 如图–13：胸腺细胞在加入了100nM DEX的培养液中培养24小时，处理后经PI染色： 乙醇固定、RNase处理、PI染色（线性DNA荧光）和直接PI染色（对数DNA荧光），凋亡检 测结果差别不很明显。 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 15 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 图 - 13 【实例二】 小鼠 T 细胞经 DEX诱导凋亡。在 DNA直方图上，凋亡细胞产生一个宽的亚倍体峰，这 群细胞表现更高的 SSC信号（如图 14）。 图 - 14 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 16 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 【实例三】 细胞在凋亡诱因连续作用进程中，DNA直方图的连续变化（如图15） 图 - 15 （一）方法一 【试剂与仪器】 （1）PBS溶液； 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 17 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 （2）PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100μg/ml，含RNase100μg/ml。 用棕色瓶4℃避光保存； （3）70%乙醇； （4）400目筛网； （5）流式细胞仪。 【实验步骤】 （1）收集细胞，数目约（1～5）×106个/mL，500～1000 r/min离心5min，弃去培 养液。 （2）3ml PBS洗涤1次。 （3）离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1-2小时。 （4）离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。 （5）400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。 （6）用1ml PI染液染色，4℃避光30min。 （7）流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波 长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图。 （8）结果判断：在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以 及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。 如以 G1/G0期所在位置的荧光强度为 1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光 强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为 0.35和0.7， 可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。 【注意事项】 细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低 也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变 所致。在分析结果时应该注意。 （二）方法二 【试剂与仪器】 （1）多聚甲醛固定液：1%多聚甲醛； （2）PBS/FCS：在PBS中加入2%FCS（胎牛血清）； （3）PI染液：10μg/ml PI，5mmol/LEDTA，5μg/mlRNase，4℃避光保存。 【实验步骤】 （1）收集细胞，数目约（1～5）×106个/mL，500～1000 r/min离心5min，弃去培 养液。 （2）1ml PBS/FCS洗1次。 （3）500～1000 r/min离心去PBS/FCS，加入500μlPBS/FCS和500μl的多聚甲醛 固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。 （4）500～1000 r/min离心弃去固定液，室温加入含0.2%Tween的PBS1ml，37℃孵 育15min。 （5）1mlPBS/FCS洗3次，每次5min。 （6）400目筛网过滤1次。 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 18 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 （7）500～1000 r/min离心去PBS/FCS，用1.0mlPI染液，4℃避光至少 30min。染 色后24小时内均可进行流式细胞仪分析。 （8）流式细胞仪检测：同方法一。 （9）结果判断：同方法一，该法主要用于凋亡细胞的表型分析。 第六部分 原位标记技术 ISEL 原位标记（ISEL）是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶[末端脱氧核苷酸转移酶 （TdT）和DNA聚合酶 I或Klenow大片段]的催化下与凋亡细胞的单股或双股断链相结合，并 能过一定的显示系统使之显示出来。通常有两种方法（如图 16），一是末端脱氧核苷酸转移 酶介导的dUTP缺口末端标记，简称TUNEL；二是DNA聚合酶I或Klenow大片段介导的原位 缺口平移，简称 ISNT。在不考虑所使用的催化酶时，统称为原位末端标记（ISEL）。这两种 方法用于检测组织或培养细胞的凋亡，由于是检测细胞的核断裂片断所以可以检测早期的细 胞凋亡，且特异性和敏感性都是较高的，就其敏感性而言，TUNEL鉴定高于ISNT鉴定。 常用的标记物和显示系统有：生物素标记的dUTP，其相应的显示系统为卵白素或链卵白 素标记的辣根过氧化物酶（HRP）和显色底物DAB；地高辛标记的dUTP，显示系统为辣根过氧 化物酶标记的抗地高辛抗体（正常羊 IgG的 Fab片断）和 DAB；荧光素标记的 dUTP（常用 FITC-dUTP），用流式细胞仪分析或在荧光显微镜下观察。 值得注意的是，就 ISEL技术本身而言，是不能区别凋亡、坏死和自溶性死亡，必须结合 凋亡细胞的形态学特征加以判断。TUNEL和ISNT鉴定标记的阳性细胞可结合下列标准加以判 断：单个或少数几个孤立地分布在组织中；具有凋亡细胞的核特征，即核固缩显一个或多个 染色体团块，凋亡小体核片断；周围或局部无炎症反应的征象。 图 - 16 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 19 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 一、原位缺口末端标记法TUNEL TUNEL原位标记法是1992年Gavricli等首先报道，它实际上是分子生物学与形态学相 结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋 亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养细胞和从 组织中分离的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和 生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。该方法首先采用蛋白酶K消 化法或渗透法对标本细胞进行打孔，后将标本与TdT和FITC及Biotin标记的dUTP一起温育， 在温育过程中，TdT将荧光素或生物素标记的dUTP连接到DNA片断的自由3’-末端上，采用 生物素标记时可在荧光显微镜下直接对荧光素标记的DNA片断进行观察；采用生物素标记时， 需以亲合素/生物素辣根过氧化物酶或亲合素/碱性磷酸酶系统显色后分析。亦可采用偶联于 碱性磷酸酶分子的抗荧光素抗体或连接于过氧化物酶分子的抗荧光素抗体作为检测试剂。 1、过氧化酶标记——普通光学显微镜检测 【基本原理】 Dig-11-dUTP 在酶的作用下，可以渗入到凋亡细胞双链或单链 DNA的 3’-OH末端，并 可与酶标的抗地高辛抗体结合。在适当底物存在下，产生颜色反应，特异准确地定位出正在 凋亡的细胞。 洋地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有的动物组织中几乎不存在能与抗地高辛抗体结 合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应 不到 1%， 若此抗体的 Fc 部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞 FC受体非 特异性的吸附作用。 【检测方法】 [仪器] 染色缸、湿盒、恒温水浴箱、恒温箱、光学显微镜。 [试剂及配制] 1）磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4：磷酸钠盐（PBS）50mmol/L，NaCl 200mmol/L。 2）蛋白酶 K（200μg/ml）：蛋白酶 K 0.02g，PBS 100ml，pH7.4。 3）含 2%过氧化氢的磷酸盐缓冲液：过氧化氢（30%）2.0ml，磷酸缓冲液 98.0ml，pH7.4。 4）TdT 酶缓冲液（新鲜配制）：Trizma碱 3.63g，用 0.1N HCl调节 pH至 7.2，加蒸馏水 定容 1000再加入二甲胂酸钠[（CH3）2AsO2Na.3H2O]和氯化钴（CoCCl2.6H2O）。 5）TdT 酶反应液（新鲜配制）：TdT 酶缓冲液 76μl，TdT 酶，Dig-11-dUTP，混匀，置 于冰上备用。 6）洗涤与终止缓冲液：NaCl 17.4g，柠檬酸钠 8.82g，蒸馏水 1000ml。 7）0.05%（W:V）二氧基联苯胺（DAB）溶液（新鲜配制）：DAB 5mg，PBS 5ml，ph7.4， 临用前过滤，加 H2O2至 0.02%（V:V）。 8）0.5%（W:V）甲基绿：甲基绿 0.5g，0.1mmol/L乙酸钠 100ml，pH4.0。 9）100%丁醇，100%，95%，90%，80%，70%乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙醇， 松香水等。 10）过氧化物标记的抗地高辛抗体（ONCOR） 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 20 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 [操作方法] 1）标本预处理 ①石蜡包埋的组织切片预处理 将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次 5分钟。 用无水乙醇洗两次，每次 3分钟。 用 95%和 75%乙醇各洗一次，每次 3分钟。 用 PBS 洗 5分钟 加入蛋白酶 K溶液（20μl/ml），于室温水解 5分钟，去除组织蛋白。 用蒸馏水 4洗次，每次 2分钟，然后按下述步骤 2）进行操作。 ②冰冻组织切片预处理 将冰冻组织切片置 10%中性甲醛中，于室温固定 10分钟后，去除多余液体。 用 PBS 洗两次，每次 5分钟。 置乙醇：乙酸（2:1）的溶液中，于-20℃处理 5分钟，去除多余液体。 用 PBS 洗两次，每次 5分钟，然后按下述步 2）进行操作。 ③培养的或从组织中分离的细胞预处理 将约 5×107个细胞于 4%中性甲醛室温中固定 10分钟。 在载玻片上滴加 50-100μl细胞悬液并使之干燥。 用 PBS 洗两次，每次 5分钟，然后按下述步骤 2）进行操作。 2）在染色缸中加入含 2%过氧化氢的 PBS，于室温反应 5分钟。用 PBS 洗两次，每次 5 分钟。 3）用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加 2滴 TdT 酶缓冲液， 置室温 1～5分钟。 4）用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μlTdT酶反应液，置湿 盒中于 37℃反应 1小时（注意：阴性染色对照，加不含 TdT 酶的反应液）。 5）将切片置于染色缸中，加入到已预热到 37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于 37℃保温 30分钟，每 10分钟将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。 6）组织切片用 PBS 洗 3次，每次 5分钟，直接在切片上滴加过氧化物酶标记的抗地高 辛抗体，于湿盒中室温反应 30分钟。 7）用 PBS 洗次，每次 5分钟。 8）在组织切片上直接滴加新鲜配制的 0.05%DAB溶液，室温显色 3～6分钟。 9）用蒸馏水洗 4次，前 3次每次 1分钟，最后 1次 5钟。 10）于室温用甲基绿进行复染 10分钟。用蒸馏水洗 3次，前两次将载玻片提起放下 10 次，最后一次静置 30秒钟。依同样方法再用 100%正丁醇洗 3次。 11）用二甲苯脱水 3次，每次 2分钟，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验 结果。 【注意事项】 一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用 DNase部分降解的标本，阳性 细胞对照可使用地塞米松（1μmol/L）处理 3～4小时的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细 胞，阴性对照不加 TdT 酶，其余步骤与实验组相同。 2．地高辛标记 dUTP/荧光素标记抗地高辛抗体——荧光显微镜检测 联科生物技术有限公司 细胞凋亡分析 [ - 21 - ] 技术支持：www.gotofcm.com 电子邮件：service@gotofcm.com 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 【基本原理】 Dig-11-dTUP 在 TdT 酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链 DNA的 3’-OH末端， 荧光素标记的抗地高辛抗体可与反应部位结合。当遇到波长为 494nm的激发光时，荧光素产 生波长为 525nm的发射光，从而可在荧光显微镜下观察计数，或使用流式细胞仪进行定量测 定。 本法与细胞化学染色方法比较，具有可以测定早期凋亡细胞的特点，并且可测定在细胞 周期中 DNA发生断裂的具体时相。本实验采用的 DNA末端标记法要比 DNA缺口翻译标记 法灵敏 10倍以上。本法具有很低的非特异染色，凋亡细胞产生的信号强度至少比非凋亡细胞 高 38倍以上，测定凋亡细胞的灵敏度要比测定坏死细胞高 10倍以上。 【检测方法】 [仪器] 离心机、染色缸、湿盒、恒温水浴、恒温箱、荧光显微镜等。 [试剂及配制] 1）磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）：磷酸钠盐，50mmol/L，NaCl 200mmol/L。 2）蛋白酶 K（200μg/ml）：蛋白酶 K0.02g，PBS 100ml，pH7.4。 3）含 1%多聚甲醛的 PBS，pH7.4。 4）100%、95%、90%、80%和 70%乙醇，二甲苯，中性甲醛，乙酸，RNA酶。 5）Trizma酶缓冲液，pH7.2（新鲜配制）：Trizma碱 3.63g，用 0.1N HCl调节 pH至 7.2， 二甲胂酸钠[（CH3）2AsO2Na.3H2O] 29.96g，氯化钴（CoCCl2.6H2O）0.238g，加蒸馏水至 1000ml。 6）TdT 酶反应液（新鲜配制）：酶缓冲液 76μl，TdT酶 32μl，混匀，置于冰上备用。