高产谷胱甘肽新菌种的选育及其发酵条件的研究

第 35卷 第 3期 2005年9月 工 业 微 生 物 Industrial Microbiology Vo1．35 NO．3 Sept 2005 高产谷胱甘肽新菌种的选育及其发酵条件的研究 何俊勇， 裘娟萍 ， 黄 敏， 赵丽华 (浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州，310014) 摘 要 通过对谷胱甘肽新产生茵——藤黄八叠球茵进行紫外诱变处理，筛选到一株抗乙硫氨 酸和氯化锌的抗性茵株，该突变株发酵生产谷胱甘肽的产量比出发菌株提高268．9％。通过对碳 源、氮源、温度、初始pH等发酵条件对该茵株生物合成谷胱甘肽的影响研究， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明突变株HY78在 发酵温度37℃、初始pH7、0、摇床转速180r／min条件下，摇瓶发酵26h，该高产茵株在发酵液中合 成谷胱甘肽的产量可达 160．628 mg／L。 关键词：谷胱甘肽； 藤黄八叠球菌； UV诱变； 发酵条件 谷胱甘肽(Glutathione，简称 GSH)是生物体内 一 种重要的活性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸 通过肽键缩合而成。GSH广泛分布于动、植物和微 生物中，有维持细胞正常功能和红细胞膜完整性，参 与氨基酸和铁的吸收与转运等重要生理功能。在临 床上，GSH是治疗重金属中毒、肿瘤、白内障等疾病 的有效药物，最近发现 GSH可能具有抗爱滋病毒⋯ 的功效，GSH也广泛运用于食品加工的各个领域， 如调味食品、乳制品、口服保健品等。在日本，GSH 被认为是 21世纪最有希望的保健食品之一【2 J。 GSH最突出的功能体现在它的抗氧化作用上，被称 为“三倍效能的抗衰老氨基酸”_3 J。GSH的生产方 法主要有：萃取法_4]、化学合成法 J、发酵法 6 和酶 法 】，其中发酵法生产 GSH的工艺及方法不断得到 改进，已成为目前生产 GSH最普遍、最具潜力的方 法。目前能较多地积累谷胱甘肽的菌株主要有酵母 和大多数革兰氏阴性菌，采用的菌种选育方法主要 是传统的化学诱变法(亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基 磺酸乙酯等)和物理诱变法(紫外线和x射线)相结 合，得到的突变株以1，2，4一三唑和叠氮化钠抗性 株 】、乙硫氨酸抗性株‘9】、甲硫氨酸敏感株川、丙酮 醛抗性株 ¨、锌离子抗性株_1 为主。 鉴于目前国内、外还没有关于革兰氏阳性细菌 发酵生产谷胱甘肽的报道，本实验首次采用革兰氏 阳性细菌——藤黄八叠球菌进行发酵生产谷胱甘 肽。通过对其进行紫外诱变处理，筛选到一株乙硫 氨酸和氯化锌抗性菌株，并随后进行发酵条件优化。 细菌比酵母菌的生长周期短，因此如果利用该细菌 进行发酵生产谷胱甘肽，可以缩短生产周期，从而提 高经济效益，促进产业化生产。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 菌种 藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)，由本实验室提 供。 1．1．2 培养基 1．1．2．1 斜面、普通平板培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 ]。 1．1．2．2 种子培养基 葡萄糖30g，蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，氯化钠 5g， 7J(1O00mL，pH7．0。 1．1．2．3 发酵培养基 葡萄糖 30g，蛋白胨 20g，半胱氨酸盐酸盐 1g， MgSO4。7H2O 5g，KH2PO4 3g，H2O lO00mL。 1．1．2．4 乙硫氨酸选择平板培养基 普通平板培养基 十乙硫氨酸。 1．1．2．5 氯化锌选择平板培养基 普通平板培养基 +氯化锌。 1．1．3 培养条件 菌种经斜面活化后，用接种环接一环至种子培 养基中，在培养温度30℃、摇床转速200 r／min条件 作者简介：何俊勇(1977--)，男，硕士生。*通讯作者。 一 31 — 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 3期 工 业 微 生 物 第35卷 下振荡培养 18h，然后按 10％的接种量接人发酵培 养基，在培养温度 30℃、摇床转速 200 r／min条件下 发酵 22h。 1．1．4 试剂 AI LOXAN试剂购 自美国Sigma公司，其余均 为国产分析纯试剂。 1．2 实验方法 1．2．1 诱 变方法 1．2．1．1 茵悬液的制备 用无菌生理盐水洗下出发菌株的斜面，制成单 细胞菌悬液，调整细胞浓度至 10 CFU／mL左右。 1．2．1．2 紫外线诱变 用无菌移液管吸取 4mL菌悬液至装有大头针 的直径为6cm的平皿中，将平皿置于磁力搅拌器 上，调整平皿至功率为 15W 紫外灯的距离为 30cm， 打开紫外灯，照射 1 min后，拿掉皿盖，在磁力搅拌 的同时进行紫外辐照。 1．2．1．3 抗乙硫氨酸菌株的筛选 紫外诱变的菌悬液经适当稀释后涂布在选择培 养基上，30℃培养2d，从平板中挑选生长快、菌落大 的菌株至斜面，30℃培养 24h后接人种子及发酵培 养基 ，待发酵后进行分析。 1．2．1．4 抗氯化锌菌株的筛选 将制备好的菌悬液在紫外灯下照射 45s，吸取 0．5mL菌悬液均匀涂布在普通平板培养基上，然后 用无菌镊子取一颗氯化锌颗粒置于平板中，3O℃培 养2d，从抑菌圈附近用无菌接种铲刮下适量菌落， 经适当稀释后涂布在锌离子选择培养基上，30℃培 养 2d，从平板中挑选生长快、菌落大的菌株至斜面， 30℃培养 24h后接人种子及发酵培养基，待摇瓶发 酵后进行分析。 1．2．2 培养基成份的单因素试验 碳源试验将发酵用基本培养基中的葡萄糖被对 应碳源代替，氮源试验以糖蜜为碳源，以相应的氮源 代替蛋白胨。 1．2．3 分析方法 1．2．3．1 细胞 GSH含量的分析 谷胱甘肽是胞内产物，发酵液经离 心得 信息技术培训心得 下载关于七一讲话心得体会关于国企改革心得体会关于使用希沃白板的心得体会国培计划培训心得体会 菌体。 用40％乙醇溶液抽提菌体 2h，然后利用紫外吸收 法 J进行分析。 1．2．3．2 细胞干重的称量 用移液管吸取 10ml发酵液于 3500r／rain离心 15min，弃上清液，洗涤菌体 3次后得菌体，置于烘箱 中，于 1050(；烘干至衡重，称量。 2 结果与讨论 2．1 出发菌株的自然分离 选用本实验室保藏的藤黄八叠球菌经斜面培养 活化后，在普通平板培养基上划线分离，挑选生长 快、菌落大的菌株 50株进行摇瓶发酵筛选并测出各 菌株发酵后 GSH含量，最终选用发酵液中 GSH含 量为20．609mg／L，干细胞含量为的5．4mg／mL的菌 株 SI 1作为出发菌株。 2．2 谷胱甘肽高产菌株的诱变选育 2．2．1 紫外线剂量的确定 表 1 uV辐照时间与致死率和正变率关系 紫外线辐照时间与致死率变率关系见表(1)。 由表(1)可知，紫外线的照射时间与菌株的致死率、 正变率之间存在明显的剂量效应关系，致死率随着 照射时问的延长逐渐提高，但正变率随着照射时问 的延长先提高后降低，因此选用 45s作为紫外线最 佳诱变剂量。 2．2．2 筛选平板中乙硫氨酸浓度的选择 乙硫氨酸浓度杀菌曲线如图 1。由图可知乙硫 氨酸的浓度越高，细菌的致死率越高，当其浓度达 一 32 — 100 一 80 、 ／ 惜 趣 60 40 20 板中乙硫氩酸浓度 (g／L) 图l 乙硫氨酸杀菌曲线 维普资讯 http://www.cqvip.com 第3期 何俊勇，等：高产谷胱甘肽新菌种的选育及其发酵条件的研究 第35卷 1500mg／L时，细菌的致死率为 100％，本文选用致 死率81．7％时乙硫氨酸浓度(900rag／L)作为筛选浓 度。 2．2．3 抗乙硫氨酸突变株的选育 谷胱甘肽的生物合成是由两个酶共同催化的， 其中7一谷氨酰半胱氨酸合成酶是催化该反应的控 制步骤，该酶受终产物谷胱甘肽的反馈抑制，GSH 在胞内积累到一定量时会抑制其在细胞内继续合 成。乙硫氨酸是 GSH的结构类似物，在低浓度时能 够促进 GSH的合成，但在高浓度时会抑制细菌生长 和GSH的合成，因此筛选抗乙硫氨酸的突变株能有 效解除终产物的反馈抑制，从而提高 GSH的含量。 在乙硫氨酸选择平板培养基上分离到 1 32株抗性菌 株，通过摇瓶发酵试验分别检测其 GSH产量，其中 有 15株明显高于出发菌株，试验结果如表2。 表 2 部分抗乙硫氨酸突变株发酵试验结果 发酵液中G,_q-I产量提高 发酵液中干细 干细胞中GSH 含量提 含量(Inl；／L) 率(％)胞含量(Inl；／n )含量(me／g) 高率(％) GZ9 32．340 56．9 5．4 5．989 56．9 GZ21 35．085 70．2 5．2 6．747 76 8 GZ23 38．829 88．4 6．8 5．711 49．7 GZA2 33．338 61 8 6．2 5．377 40．9 GZA7 27．348 32．7 5．2 5．259 37 8 GZA9 31．841 54．5 6．2 5．136 34．6 GZ53 34．087 65．4 7l8 4．370 14 5 GZ54 36．333 76．3 6．4 5．677 48．8 GZ59 26．350 27．9 5．4 4．879 27．9 G 8 28．596 38．8 5．6 5．106 33．8 GZ93 37．332 81．1 7．8 4．786 25．4 GZ97 33．588 63．0 4．6 7．302 91 4 GZ113 28．845 39．9 8．6 3．354 12．1 GZ114 36．583 77．5 7．6 4．814 26 2 呸 丝： ! ：! ： !：堑 ：：! 由表(2)可知，发酵液中GSH含量最高的是 GZ23，其产量为 38．829mg／L，比出发菌株提高了 88．4％ 。 2．2．4 抗锌离子菌株的筛选 在氯化锌选择平板培养基上分离到 1l3株抗性 菌株，通过摇瓶发酵试验分别检测其GSH产量，其 中有11株明显高于菌株GZ23，试验结果如表3。 由表 (3)可知，发酵液中 GSH含量最高的是 HY78，其产量为 76．018mg／L，比菌株 GZ23提高 95．8％，比出发菌株 SL21提高 268．9％。 表 3 部分抗锌离子突变株的发酵试验结果 发酵液中(剐 产量提高 发酵液中=F细 于细胞中GSH 含 提 含量(me／L) 率(％)胞含量(mg／mL)含量(n g) 商率(％) HY11 44．819 15．4 5 2 8．619 50．9 HY23 73．772 90．0 7．4 9．969 74．6 HY53 46．816 20．6 5．6 8．360 46．4 HY56 59 296 52．7 5．8 10．223 79 0 HY65 56 301 45．0 5．6 1O ()54 76．0 HY71 69．778 79．7 6．4 10．903 90．9 HY78 76．018 95．8 7．6 10．002 75．1 HY82 61．542 58．5 7．6 8．098 41．8 HY85 44．071 13．5 5 4 8．161 42 9 HY9O 56 799 46．3 5．8 9．793 71．4 HY96 55．302 42．4 4．8 11．521 101．7 zn2 是多种脱氢酶、脱羧酶和肽酶的辅因子， 在低浓度时有促进细菌生长的作用，但当胞内zn2 达到一定浓度时，能使GSH还原酶活性中心变构失 活，抑制胞内GSH的继续合成，因此筛选抗锌离子 的突变株既可解除 GSH还原酶受 zn2 的抑制，又 可在培养基中添加适量 zn2 促进细菌的生长，提高 生物量，从而提高谷胱甘肽产量。 2．2．5 突变株遗传稳定性的考察 利用斜面把筛选所得到的突变株经过十次转 接，考察每一次转接斜面合成谷胱甘肽的能力，结果 表明经过第十次转接后，谷胱甘肽的产量比较稳定， 仅仅下降了13．0％，因此利用该突变株发酵合成谷 胱甘肽是合理的，但是经常进行纯种分离也是十分 有必要的。 3 高产菌株发酵条件的研究 选用突变株HY78进行发酵条件的研究。 3．1 碳源的影响 研究葡萄糖、蔗糖、糖蜜三种碳源对菌株产 GSH的影响，其结果如图2。结果表明在这三种碳 源中，糖蜜是该菌株的最佳碳源，其发酵液中GSH 的含量远远大于其它两种碳源，这可能是由于糖蜜 含有丰富的营养成分，从而促进对GSH的合成。 3．2 氮源的影响 研究蛋白胨、牛肉膏、酵母膏三种氮源对菌株产 GSH的影响，其结果如图 3。结果表明牛肉膏为最 好氮源，蛋白胨次之，酵母膏为最差氮源。 一 33 — 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 3期 工 业 微 生 物 第 35卷 ^ 三 卸嘲 丰L S 墨 血 墨 邑 蚓 抽 g 墨 血 蓦 不同碳源的浓度(％) ■ 葡萄糖浓度对GSH产量的影响 口 蔗糖浓度对GSH产量的影响 图 糖蜜浓度对GSH产量的影响 图2 不同碳源对GSH产量的影响 氮源的浓度 (％) ■ 蛋白胨浓度对GSH产量的影响 口 牛肉浸膏浓度对GSH产量的影响 酵母浸膏浓度对GSH) 量的影响 图3 不同氮源对 GSH产量的影响 3．3 发酵条件的影响 研究了培养温度、初始 pH、摇瓶转速、发酵时间 等条件对谷胱甘肽产量的影响。 3．3．1 培养温度的影响 在其他发酵条件不变时，考察了不同温度对谷 胱甘肽产量的影响，结果如表(4)，研究表明在温度 为 37℃时，发酵液 中谷胱甘肽的产量最高，由于 37℃是本文所做的最高温度试验，因此需要进一步 提高温度试验。 3．3．2 发酵液初始 pH的影响 在其他发酵条件不变时，考察了不同初始pH 对谷胱甘肽产量的影响，结果如表 4，研究表明在初 始 pH6．5时，发酵液中谷胱甘肽的产量最高。 3．3．3 摇床转速的影响 在其他发酵条件不变时，考察了不同摇床转速 对谷胱甘肽产量的影响，结果如表 4，研究表明摇床 转速为 180r／min时，发酵液中谷胱甘肽的产量最 高。 3．3．4 发酵时间的影响 在其他发酵条件不变时，考察了不同发酵时间 对谷胱甘肽产量的影响，结果如表 4，研究表明发酵 时间为 26h时，发酵液中谷胱甘肽的产量最高。 由以上研究表明，发酵温度 37℃，初始 pH6．5， 转速 180r／min为该突变株生物合成谷胱甘肽最佳 发酵条件，在此条件下，摇瓶发酵 26h后，发酵液中 谷胱甘肽的含量可以达到 160．628mg／L。 表4 发酵条件对GSH产量的影响 一 件 ， 参 考 文 献 [1] 施碧红，黄建忠，施巧琴等．啤酒酵母(Sacdzaromyces cerevisi一 )M一05变株合成谷胱甘肽的研究 I，菌种的选育．福建师 范大学学报 ，1996，8(1)：59—96 [2] 胡学智．日本的保健食品．工业微生物，2000，30(3)：44—49 [3] 徐汉生，奚农葆．“抗氧化物之王”谷胱甘肽的研究与开发．湖 北化工，2000，5：1—3 [4] Perrara P J，Dalby G．Extracting glutathione from wheat and soybean．U．S．Patent 3396033 ‘ — — 34 ‘—— ∞ 如 ∞ 舳 ∞ ∞ 加 0 加 加 ∞ ∞ ∞ ∞ 加 0 维普资讯 http://www.cqvip.com 第3期 何俊勇，等：高产谷胱甘肽新菌种的选育及其发酵条件的研究 第35卷 [5] [6] [7] [8] [9] Dougles K T．Ch~nical synthesis of glutathione and a*mlogs ． Co— enzyme cofactors．1989，12：243—279 Koji，N．Sanji，S．，Preparation of glutathione by fermentation． JP 60244299，1985，12，4 Murata K，Kato j，Chilbata L．Enzymatic preparation of glum— thione． tation and Industry，1981，39：900—910 Harnada，S．，Tanaka，H．Glutathione，Efy79241，1983 李华钟，林金萍，李寅等．谷胱甘肽的生物合成．中国医药工业 [10] 杂志，2000，31(5)：236—240 Murara，K．，Tani，K．，Kato，J．，et a1．Excretion of glutathio— ne byMethylglyoxal—resistant Escherichia coli．J．Gen．Microbi一 01．，1980，120：545—547 Maike，J-W．Christine，L_H_DR． gh yield fermentative pro— duction of glutathione-using Zinc resistant mutants of&zccharo— myces， specifically the new strain DSM7092． DFA219381． 1993 12．16． Breeding of overproducing glutathione strain and its fermentation conditions HE Jun—yong，QIU Juan—ping，HUANG Min，ZHAO Li—hua (College of Biological and Environmental Engineering Zhejiang University of Technology，HangZhou 310014) Abstract Using Sarcina lutea as origina1 strain，a ethionine and zinc chloride—resistant mutant was screened after treat— ed with UV．The glutathione yield of the mutant was as high as 76．O18mgJL．which was increased by 268．9％ com— pared with that of the original strain．Then the fermentation conditions affecting glutathione synthesis by the mutant was investigated．As a result，the production medium comIxasition was the following：40g／L molasses，25g／L meat yeast，1．0 g／L Cys。HC1，7g／L MgSO4。7H2O，lg／L KHiP0d．The glutathione yield of the mutant reached 160．628 mg／L in pro— duction medium under the conditions Of shaking for 26 hours at 180r／min，37℃，pH 6．5． Key words glutathione；Sardna lutea：UV treatment；fermentation conditions 本刊常用计量单位符号简介 为执行国务院发布的《关于在我国统一实行法定计量单位的命令》的 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 ，根据中华人民 共和国国家标准(GB3100~3102—93)《量和单位》一书所述内容，现将本刊常用的计量单位符 号介绍如下，请广大作者参照执行。 日(天)一d；时一h；分一min；秒一s；吨一t；公斤(千克)一kg；克一g；毫克一mg；微克一 g； 纳克一ng；升--L；毫升一mL；微升--tLL；克分子浓度(M)：废用，改为摩尔每升mol／I ；当量浓 度(N)：废用，换算成相应的mol／L；旋转速度一r／min；蒸汽压力、压强：帕(斯卡)一Pa(许用)； kg／cm2(废用)；磅(废用)；0、55kg／cm2(8磅)≈0．55 X 10 Pa，1．05kg／cm=(15磅)≈1 X 10 Pa； 百分数的使用：36～40％(错误)，36％～40％(正确)；国际单位一IU。 维普资讯 http://www.cqvip.com