双波长分光光度法测定肝素钠效价

V 0 1 . 4 N 0 . 1 《天然产物研究与开发》 一九九二年三月 双波长分光光度法测定肝素钠效价 罗福成 魏永成 谢吉光 罗 敏 . (中国科学院成都有机化学研究所 成都 6 100 1 5) 摘 要 本文介绍了在室温条件下 , 以天青作显色剂 , 用双波长分光光度法测定肝 素钠的效价 。 本法快速准确 , 测定浓度。一 Z o u / m l, 相对误差在士4呱 以内 , 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 偏差。. 1 9 , 变异系数 2 . 5 汤 , 与羊血浆法测定结果相差士4 u / m l八内 。 关健词 肝素钠 , 天青A , 分光光度法 , 效价 。 肝素钠是一种从猪肠粘膜 , 牛肺等组织中提取的酸性粘多糖类药物 , 为动物体内的 天然抗凝血物质 , 具有增进脂防酶的释放和抑制 补 体 系 统—如 , 免 疫 溶 血 抑制活性 [ ‘l 。 肝素钠效价的测定 , 目前主要采用兔全血 、 兔血浆、 猪 血浆 「“】和羊血浆 「“ 1 法 。 但 由于新鲜兔全血 、 兔血浆 、 猪血浆和羊血浆的采集及制备多有不便 , 且构缘酸钠 , 草酸 钠等物质也具抗凝血作用 , 对测定结果影响较大 。 故 国内外都在积极探讨肝素钠的测定 新方法。 南京药学院曾介绍用 国产 72 型分光光度计 , 以天青A 比色测定肝素 钠 效价 “ 1 , 并 已用于肝素生产中的控制和工艺研究中的检测 , 但因未能消除天青A 对测定的干扰。 故 测定结果极不稳定 , 误差大 , 难以推广 。 为此 , 我们在其研究基础之上 , 对天青 A 比色 测定的方法和条件进行了改进 , 采用双波长法 [ 5 】消除了天青 A 对络合物测定 的 干扰 , 建立了一个操作简便 , 测定快速 、 准确的分光光度法。 本法测定浓 度。一 Zo u / m l, 相对 误差在 士 4 % 以 内 , 标准偏差。。 1 9 , 变异系数2 。 5编 , 与羊 血浆法测定结果相差 士4u / m l 以内。 实 验 部 份 1 . 仪器和试荆 仪器 : 72 1 A 型分光光度计 (四川省 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 仪器厂) 试剂 : 巴比妥 (分析纯 ) ; 西黄者胶 (L P C进 口分 装 ) ; 天青 A (瑞士F lu k a ) , 肝素钠标准品 (每毫克相当于 1 70 擎位U S A标准品 ) 。 2 。 试剂配制 ( 1 ) 巴比妥缓冲液 : 称取 巴比妥 5 . 52 克 , 溶于煮沸的50 m l0 . 5M 氢 氧 化 钠 溶液 . 中国科学院成都分院职 工大学一九八九级学生 收稿 日期 : 1 9 9 1年 1 0 月 2 日 3 3 V o l . 4 N o . 1 中 , 待完全溶解后 , 冷却 。 用蒸馏水稀释至 5 00 m l , 经精密试 纸校正P H 为 8 . 5 。 ( 2 ) 0 . 1 %西黄省胶溶液 : 称取西黄省胶粉。. 5克 , 用少量蒸馏水 使其 膨胀 溶解 后 , 稀释至 5 00 m l, 摇匀 , 用滤纸过滤 (以无悬浊物为标准) 滤液备用 。 ( 3 ) 天青A 溶液 : 称取天青 A 0 . 5克 , 用蒸馏水溶解稀释至 5 00 m l, 滤纸过滤 , 滤 液置冰箱保存。 用时配成。。 6 m g / m l的应用液。 ( 4 ) 肝素钠标准溶液 : 精密称取肝素钠标准品30 m g , 用 30 m l蒸馏 水 溶解 , 置冰 箱保存 。 用时准确吸取一定量配成每毫升含肝素钠 8 . o u (单位 ) 的溶液 。 3 。 实验方法 准确称取一定量的肝素钠 , 按 估计效价用蒸馏水配制成 s u / m l的肝素 钠 溶 派 , 取 此溶液 2 m l置 10 m l比色管中 , 依次加入 lm l巴比妥缓冲液 , lm l西黄者胶溶 液 , l m l天青 A 应用液 , 3 m l蒸馏水 。 充分摇匀后 , 以水为空白于波长入。 。 。 。 , 和入7 。 。。 。处测 定 吸光度 差 (△A ) , 并按下列公式计算出肝素钠效价。 肝素钠效价 (u / m g) 二 k . u / Zw 式中 , k—肝素钠样品液的总稀释倍数 (稀释m l数 ) ;u—将所测吸光度△A (A 入。 。 。。 二一A 入, 。 。。 , ) 从标准工作曲线上查 _ 出 对 应 的肝素钠效价 (u) ; W—固体肝素钠样品的称取重量 (m g) 。 结 果 与 讨 论 洲定波长的选择 () . 8 (JO 0 . 6 00 o · 4 0 0 r Z (J . 2 0 0 7 0 0 认n m 图 l 天青A 和络合物吸收光谱 1 . 天青A ; 2 . 天青A 和天青A—肝素钠络合物 , 混 合物 的天青 A溶液 lm l为合适 。 为了保证显色反应完全 , 要求天青 A 过量 。 而剩余天青 A 对肝素—天青 A 络合物的测定有较大影响 (络合物与天青 A 的吸收重叠 ) 。 为此 , 我们采用双波长分 光光度法消除天青 A 的干扰 。 根据双波长 原理确定入。。 。。 。和入7 。 。, , 为 测 定 波长 。 (见图 1 ) 2 。天青A用 , 的选择 当体系中天青 A 的用量不足时 , 工作 曲线发生弯曲 (如 图 2 所示 ) 。 但天青 A 过多时 , 空白值太大也不利于测定 (如图 3所示 ) 。这说明肝素与天青反应有一定比 例实验证明在本体系内 , 加入 o . 6 m g / m l V o l . 4 N o . 1 3 9 拼.一一。· 2叮 / ’ 10 ZC 3 0 4 (〕 5 0 效 价 (u ) 书‘~气六一下 0 . 8 1 . 0 1了耳 图 2 天青不足时测定曲线 浏定条件 : 天青量 一定 (o 6 m g ) , 盯素加 入 不 同量 图3 天青A 与吸光度关系曲线 浏定条件 : 肝素量 一定 (16 u ) , 天青A加 入不同责 3 . 黄省胶用t 的选择 当测定体系末加入一定量的胶液时 , 体系极不稳定 , 因肝素—天青络合物易产生沉淀 , 导致曲线弯曲。 但胶液用量也不宜太多 , 因胶液透明度差 , 会增加吸收值 (如图 4 所示) 。 根据实验结果以加入 0 . 1%黄 者 胶溶液lm l合适 。 4 。 巴比妥级冲液用t 的选择 巴比妥缓冲液加入量太多或太少 , 都会使测定的吸光度降低 (见图 5 ) 。 根据实验 结果加入巴比妥缓冲液 lm l合适 。 翻以400200 勺0.0. 0 , 4 0 0 1 . 5 2 . 0 2 . 1 . 5 2 . 0 m l 图4 黄省胶用量曲线 剥 定条件 : 扦素量 一定 (16 u ) , 天青量 一定 (。 、 6 m g ) , 黄 首胶加入不 同量 图 5 巴比妥用量曲线 沮lJ定条件 ‘ 肝素量 (le u ) , 天青蚤 (0 . 6 m g ) 巴比妥加 入不 同童 5 . 络合物稳定性考查 根据实验结果 (见图 6 ) , 在显色30 分钟后 , 肝素—天青A 络合物趋于稳定 , 在显色30 分钟至60 分钟内 , 络合物的吸光度A A 变化率不超过 2 % , 故 , 测定工 作 应在显 色半小时至 1 小时内完成 。 V o l . 遵 N o 一 6 . 抓化钠对测定的影响 取四 份肝索钠标准溶液 各 16 u , 分别 加入不 同是的氯 化钠溶液 , 显色后测定吸 光度△A , 结果见表 1。 人川刃泊,△。41, 000 1 0 20 3 0 4 0 5 0 6 0 。(分 ) 图 6 络合物稳定曲线 剥定条件 : 肝素量 (16 u ) , 天青量 (o . 6 m g ) , 巴比妥缓冲液 (lm l) 表 1 魏化钠对吸光度的影响 编 号 氯化钠量 (m g) 吸光度▲A ⋯一 . 兰一 - 一卜~一三一一- 一⋯一岁一 一一卜一 一里一-卜一三一一一 ~卜一二三一 ~ 一 {‘二二一}月一 一 旦{互一-⋯ “· ““ } o · “0 8 】 。· 6 “ } 。· “‘5 由表 l可知 , 样品中的氯化钠 (每毫升小于 o . lm l) 对本法测定无影响。 7 。 标准曲线 准确吸取肝素钠标准溶液0 . 5 、 1 . 。、 1 . 5 、 2 . 0 、 2 . 5 m l于五支比色管中 , 按 试验方 法显色后 , 测定其吸光 度△A (结果 见表 2 ) 。 由所测得的数据进行回归分析得相关系数r = 。. 9 9 95 , 回归方程 : △A 二 0 . 0 0 74 十 。. 3 86 p , 根据回归方’程校正吸光度 后 绘制工作 曲线 (见 图 7 ) 。 凸 A I表 2 肝素钠效价与吸光度△A 的关系 (). 80 。 一亡一龙产下万二二了丁万万万、 ~遭翌二{理竺竺竺里丝 、}一i竺兰翌匕一 。. 。《;(。{一二一⋯一兰生一卜一一卫里竺一- }一二一⋯一 ~里二一一卜一里些一一 ‘’“。。}一二一 {一- 竺坦一一 卜- 坚竺一 ‘卜 2叶 - - 二 一⋯一 竺二一 一 !一卫二11 一 (, L“ }. 2 。· 。 : 匕_ 0. 了6 ‘ 12 16 2 0 效价 、u )图 7 工作曲线 8 。 方法的准确度 准确吸取 l m l样品溶液 (3 . 6 u )五份 , 各加入 0 . 0 、 4 . 0 . 8 . 0 、 1 2 . 0 、 1 6 . o u 的标准溶 液 , 按试验方法显色后 , 测定其肝素钠效价 , 并计算相对误差 [ “ ] 。 (结 果 见畏 3 ) 相 y o 二. 4 N o . l 表3 方法的准确度实验结果 样样品量量 标准品 量量 测定值值 相对误差差 (((u ))) (u ))) (u ))) (肠))) 333 。 666 0 。 000 3 。 777 333 333 。 666 4 。 000 7 。 888 333 333 。 666 8 。 000 1 1 。 666 000 333 。 666 1 2 。 000 1 5 。 333 一 222 333 。 666 16 。 000 1 8 . 999 一 444 对误差在 士 4 写以内。 9 . 方法的精密度 对同一肝素钠样品平行取七份 , 按试 验方法测定其肝素钠效价 , 并计算 出标准 偏差 , 变异系数 1. 〕。 (结果 见 表 4 ) 标 准偏差O。 1 9 , 变异系数 2 。 5编 。 表 4 方法的精密度实验结果 平平均值 XXX 标准偏差SSS 望望竺一- 泛匕~ 一一- - 一一一一--- 7 6 。 444 7 6 . 555 0 。 1 999 lllllllllll 22222 7 6 _ 3333333 甲甲- ~ - 吮一~ r - - - ~ ~ ~ ~ 加加 7 倪 nnnnnnn 住住住住住住一一 一一一一一 一一 ;井一一一一一44444 了幻 一 OOOOOOO --- . . . . . . . . . . ‘. . . . . . . . . . . ,,,,, 55555 7 6 。 3333333 777 6 。 6666666 1 0 . 本法测定结果及与羊血桨法的对照 对每一份样品在同一稀释浓度下 , 用二种方法测定并进行对照 (结果见表 5 ) , 两 法相差在 士 4 u / m g 之内。 V o l . 4 N o . l 表 5 本法与羊血桨法浏定结果比较 ~~~决几几 本 法法 羊血浆法法 两法相差差 本法/ 羊血浆法法(((((u / m g ))) (u / m g ))) (u / m g ))) X 1 0 0 肠肠 lllll 1 2 222 1 2 333 + lll 9 9 . 2 %%% 22222 8 666 9 000 + 444 9 6肠肠 33333 1 1 222 1 1 000 一 222 1 0 2 肠肠 44444 7 000 7 111 + lll 9 9 肠肠 55555 7 999 7 999 000 1 0 0肠肠 66666 1 2 000 1 2 333 + 333 9 7 . 6肠肠 77777 8 222 7 999 一 333 1 0 4肠肠 99999999999999999999999999999999999 7肠肠88888 8 777 9 000 + 33333 99999 7 000 7 111 + 111 9 9 呱呱 111 000 6 8 }}} 6 999 + 111 9 9 务务 参 考 文 献 〔1 〕商业部脏器生化制药情报中心站 , 动物生化制药学 , 人 民卫生出版社 , 1 9 81 年 : 2 3 2 〔2 〕中华人民共和国药典 , 19 8 5年版 , 二部 , 附录 : 98 一 99 人 民卫生出版社 〔3 〕 U S p , 1 9 8 0 ; X X I , 3 6 5 〔4 〕 南京药学院 , 脏器生化制药 , 1 9 7 7 : (2 )4 0 〔5 〕 武汉大学 , 分析化学 , 高等教育出版社 , 1 9 8 2 : 5 00 一 5 02 〔6 〕潘秀荣 , 分析化学准确度的保证和 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 , 中国计量出版社 , 1 9 8 5 : 43 一48 y o l . 4 N o . l 4 3 PO T E N CY D E T E R M IN A T IO N O F SO D IU M H E PA R IN BY T W O 一 W A V E L E N G T H SPE C T R O PH O T O M E T R Y L u o F u c h e n g , W e i Y o n g c h e n g , X ie J ie g u a n g , L u o M i n 辛 (C h e n g d o I n s才‘tu t e o f O r g a n ‘e C h e m ￡s t r 夕, A c a d e 川 f a S fn fe a C h e 路g d u 6 1 0 0 1 5 ) A b s t r a e t p o te n e y D e t e r m in a t io n o f S o d iu m H e p a r i n b y tw o哪a v e le n g th w ith d ev e l叨 e r , A z u r e A , u n d e r r o o m t e m p e r a t u r e w a s s tu d ie d in th is p a Pe r 。 T h is m e th o d 15 r a p id a n d a c c u r a t e 。 D e te r m in a b le c o n c e n tr a t io n 1 5 b e t- w e e n 0 a n d 2 0 u / m l ; r e la t iv e e r 。 r o r 15 w i th in 土 4 % ; s t a n d a r d d e v i- a t io n 15 0 . 2 9 ; v a r ia t io n c o e ffic i e n t 15 2 . 5编 , T o c o m p a r e w ith a m e th o d o f s h e e p p la s m a , t h e d iffe r e n e e b e tw e e n tw o r e s u lt s is w 习th i n 士 4 % u / m l 。 K e 丫 W o r d s S o d in m H e p a r in , A z u r e A , S p e e t r o p h o to m e t r y , P o t e n c y 一 S t u d e n t , T h e S t a ff a n d W o r k e r s U n iv e r s it y o f C h e n g d u B r . n e h A e a d e m ia S i n ie a