单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

抗百日咳丝状血凝素单克隆抗体的 制备、鉴定与应用研究 徐颖华 孟淑芳 张庶民侯启明 雷殿良 中国药品生物制品检定所，北京，100050 【摘要】 目的制备抗百日咳丝状血凝素(FnA)的单克隆抗体(McAbs)，并建立特异、准确的FHA定量检 测方法。方法采用杂交瘤技术制备McAb，以间接ELISA法筛选获得稳定分泌抗FHA．McAbs的杂交瘤细胞 株，并进行了系统的鉴定和纯化，建立定量检测FHA的ELISA方法。结果获得六株分泌抗FI-IA．McAbs的杂 交瘤细胞株，抗体类别均为tsGl(K)，效价达1：105—1：10s，并能特异性识别百日咳丝状血凝素，与流感病毒血 凝素及百13咳毒素无交叉反应，建立了检测FHA的ELISA，灵敏度为1．04剧L，批内变异系数5．49％，批间变 异系数9．31％，平均回收率为94．18％，应用该法测定了国内几大生产厂家送检的无细胞百日咳疫苗原液中 F}n含量。结论成功的制备了抗FHA—McAbs，建立了一种特异、准确的定量检测FHA的ELISA方法，并用于 无细胞百日咳疫苗原液中FHA含量的检测，为无细胞百日咳疫苗的质量控制提供了有力的手段。 【关键词】无细胞百日咳疫苗；丝状血凝素；单克隆抗体；ELISA 百日咳丝状血凝素(filamentoushemagglutinin FHA)是由鲍特氏菌属百日咳杆菌产生的一种具有 粘附作用的蛋白质分子，因对红细胞有凝集作用而 得名。与百日咳杆菌粘附和定居在呼吸道器官的上 皮细胞有关，是百日咳杆菌致病的重要毒力因子uJ。 同时FHA还具有较强的免疫原性，能刺激机体免疫 系统产生特异的保护性抗体，至今，已被世界上包括 中国在内的很多国家作为无细胞百日咳疫苗的主要 组分之一。本实验目的是制备特异性强、高亲和力 的抗．FHA单克隆抗体，将其用于建立定量检测FHA 的夹心ELISA法，为无细胞百日咳疫苗的质量控制 研究和百日咳鲍特氏菌致病机制的研究提供基础依 据。 材料和方法 1．主要试剂及实验动物 丝状血凝素和百日咳毒素本室保存；流感病毒 血凝素由本所疫苗三室提供；Sp2／0细胞由本所细胞 室提供；基础培养基(DMEM培养基)为Gibco公司产 品；选择性培养基(HAT和HT培养基)和FHA标准 品为Sigma公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗 鼠tsG为Jakson公司产品；亚类试剂盒为PIERCE公 司产品；A蛋白亲和层析柱(HiTraprPmteinAFF)为 AmershamBiosciences公司产品；96孔可拆酶标板为 Greinerbio．tom公司产品；其余试剂均为国产分析 纯。6。8周的雌性、健康Blab／c小鼠和豚鼠，由本所 实验动物中心提供。 ·232· 2．单克隆抗体的制备及纯化 用FHA加弗氏完全佐剂(Sigma公司)，制成油 包水状混合物进行小鼠皮下注射，30／上g,／只≥间隔3 周后，再以30t培,／只加弗氏不完全佐剂进行小鼠腹 腔注射，7—10天后，眼眶取血，间接ELISA法测其血 清的效价达1：lo'。于融合前3天尾静脉注射FHA 30t唱／只，以加强免疫。常规方法将免疫的小鼠脾细 。胞与Sp2／O细胞融合，融合细胞置于HAT选择培养 基中，用间接ELISA法对杂交瘤细胞培养上清进行 筛选，将阳性孔杂交瘤细胞以有限稀释法进行亚克 隆，直至成为单克隆的细胞株为止。再将筛选出来 的杂交瘤细胞扩大培养，冻存。按常规方法制备出 小鼠杂交瘤细胞腹水。 按文献[2]方法，采用辛酸．硫酸胺法粗提各株 杂交瘤细胞腹水后，再将粗提液过A蛋白亲和层析 柱，进一步纯化腹水。 3．杂交瘤细胞株及其分泌McAbs特性的鉴定 3．1杂交瘤细胞染色体计数：按文献[3]方法， 用秋水仙素刺激杂交瘤细胞处于中期分裂相，固定 后经Giemsa染色，油镜下计数。 3．2McAb类和亚类的鉴定：预包被FHA抗原的 反应板，用ELISA法(按说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 操作)鉴定抗体类和 亚类。 3．3杂交瘤细胞腹水特异性抗体效价的测定： 将各株杂交瘤细胞制备的腹水倍比稀释后用间接 ELISA法测定其效价。 3．4McAb特异性鉴定：按常规方法进行FHA包 被，用流感病毒血凝素和百日咳毒素亦以相同的浓 度包被，同时设PBS阴性对照，应用间接ELISA测 定。 3．5McAb特异性抑制丝状血凝素血凝活性的 鉴定：采用血凝抑制法[4]测定，血球采用新鲜配制 1％豚鼠红细胞悬液，各株纯化的单克隆抗体起始稀 释度为1：2，每株单抗做10个稀释度，同时设单克隆 抗体对照组、无关抗体对照组、丝状血凝素对照和红 细胞对照。 3．6McAb相对亲和力的测定：按文献[5]方法 进行抗FHA的六株单克隆抗体亲和力的测定。 4．夹心ELISA法的建立 4．1最佳工作浓度的确定：将纯化的单抗按常 规方法标记HRP，通过竞争抑制试验筛出2株识别 不同表位的McAb，McAb2C2用于包被，酶标McAb 2G6为二抗，以方阵滴定法确定包被、酶标抗体的最 佳工作浓度。 4．2标准曲线的绘制：将McAb2C2用PH9．6碳 酸盐缓冲液稀释至以上确定的包被浓度，以100p1／ 孔包被ELISA板，4'12过夜。用15％牛血清封闭， 37℃1h，洗涤。加入等体积一系列不同浓度(0— 1000／zg／L)FHA标准抗原，用于确定方法的检测线性 范围，37℃1h后，洗涤。加以上确定的酶标McAb 2G6二抗浓度，lOOt上l／孔，37℃lh后，洗涤。加TMB 底物显色，终止反应后用酶标仪测定Abs450值。以 抗原标准溶液浓度为横坐标，其相应的吸光度值 (Abs)为纵坐标，绘制FHA的标准曲线。 4．3ELISA法的方法学鉴定：①特异性：用建立 的ELISA方法检测FHA(高浓度1000p．g／L和低浓度 50t卫g／L)及同样浓度的百日咳毒素、流感病毒血凝 素，评价方法的特异性。②灵敏度：通过重复10次 测定标准曲线的零浓度标准，以其均值加3个标准 差为检测的灵敏度，代入标准曲线计算灵敏度。③ 回收率在零浓度标准溶液中分别添加已知的FHA 标准品125ttg／L和250t_tg／L，再进行ELISA检测，并计 算FHA含量，根据公式[回收率(％)=测得值／真实 值×100％]最后得出回收率。④重复性试验：选取 高(300pg／L)、中(150tug／L)和低(75t,g／L)浓度共三份 FHA抗原标准溶液，每份标准溶液同批测定8次；每 份标准溶液每天测定2次，连续测定7天，计算批内 变异系数(CV)和批内变异系数(CV)，评价方法的精 密度。 5．初步应用 应用已建立的ELISA方法，对国内几大生产厂 家送检的无细胞百日咳疫苗原液进行FHA含量检 测，超出检测范围的样本，将其稀释再进行检测，最 后根据标准曲线，样本的吸光度值及各自的稀释倍 数，计算出样本中FHA的含量。 结 果 1．杂交瘤细胞株的建立及其分泌McAbs的纯 化 用FHA作免疫原，免疫小鼠并取其脾细胞，与 骨髓瘤细胞融合，在先后两次融合实验中，融合率均 在80％以上，抗体阳性率在40％以上。用间接 ELISA法筛出6株分泌抗丝状血凝素的杂交瘤细胞 株，它们分别被命名为：2C2，2G6，2E11，1E4，1C7， 485。体外连续培养3个月或液氮冻存3个月以上， 建株的杂交瘤细胞分泌抗体水平未见下降。 采用辛酸．硫酸铵法粗提杂交瘤细胞腹水后，再 将粗提液过A蛋白亲和层析柱进行更一步的纯化， 获得的纯化腹水经SDS—PAGE电泳显示清晰的轻、 重链两条谱带。 2．单克隆抗体特性的鉴定 对杂交瘤细胞进行染色体计数，六株细胞染色 体数均在90．120条之间；采用PIERCE公司亚类试 剂盒进行McAb类和亚类的鉴定，结果显示：上述六 株McAb均为IgGl类，轻链类型均为to；六株杂交瘤 细胞腹水特异性抗体效价为l：lo'一1：lo'，效价最 高的细胞株为2C2及2G6，以六株杂交瘤细胞培养 上清仅与纯化的FHA反应，与流感病毒血凝素和百 日咳毒素无反应，表明它们的特异性良好。其中 McAb2C2，2G6，1E4，1C7特异性抑制丝状血凝素血凝 活性，血凝抑制效价分别为1：64，1：128，l：256和 l：64，而McAb对照组、无关抗体对照组、丝状血凝 素对照组、红细胞对照组及McAb2E11和485均未引 起血凝抑制现象。对六株杂交瘤细胞腹水进行相对 亲和力的测定，结果表明六株McAb的相对亲和力 的』|顷序为：1E4(3．21×1Cr8M)>2c2(6．8×10sM)> lC7(7．95×108M)>2G6(1．56×10。7M)>2E11(2．21 x10．7M)>485(6．2×10-7M)。 3．夹心ELISA法的建立 3．1最佳工作浓度的确定：用方阵滴定法确定 了包被McAb2C2、酶标McAb2G6二抗的最佳工作 浓度分别为5叫IIll与l：2000。 3．2标准曲线的绘制：以抗原(FHA)标准溶液浓 度为横坐标，其相应的吸光度值为纵坐标，绘制FHA 的标准曲线，由图1可见，EllA浓度与相应吸光度值 · 233 之间在此范围内有良好的线性关系，作统计相关回 归分析，其回归方程为Y=0．12797+0．00486X，相关 系数R=0．993，表明了本检测方法的可靠性。 O 100 200 300 400 X 图1 ELISA法标准曲线 3．3ELISA法的方法学鉴定：①特异性：用建立 的ELISA方法检测FHA及百日咳毒素、流感病毒血 凝素的结果表明，除了与FHA反应，对其它两种物 质均无交叉反应。②灵敏度：通过重复10次测定标 准曲线的零浓度标准，其结果分别为，0．0945，0．096， 0．09875，0．107，0．0915，0．1135，0．114，0．1105， 0．0955和0．107，以其均值加3个标准差为检测的灵 敏度，代人标准曲线计算为1．04pg／L。③回收率及 重复性试验回收试验的平均回收率为94．18％；批内 变异系数(CV)为2．26％一9．03％，平均5．49％。批 间变异系数(CV)为5．93％一12．38％，平均为 9．31％。 4．初步应用 应用已建立的ELISA方法，对国内几大生产厂 家送检的无细胞百日咳疫苗原液进行FHA含量测 定，结果(见图2)。 o 鼍 3 删 把 兰 山 0 2 4 6 8 10 批次 图2系列1、系列2、系列3和系列4分别为四个单位送 检的原液 显示同一单位送检的每批原液之间FHA含量 不是很一致。 ‘ ·234· 讨 论 百日咳是一种由百日咳杆菌引起的急性呼吸系 统传染病，人群普遍易感，尤以婴幼儿多见，其感染 和发病机理至今尚未十分清楚，因此，预防百日咳最 有效的手段是对婴幼儿实施百日咳疫苗的免疫接 种[6]。目前，百日咳疫苗主要包括全细胞和无细胞 百日咳疫苗，由于前者所引起的接种副反应较为严 重，将逐渐被无细胞百日咳疫苗取代。无细胞百日 咳疫苗是一种以百日咳毒素和丝状血凝素为主要成 分的组分疫苗。经许多国家的临床试验证实，无细 胞疫苗在预防百日咳方面，具有与全细胞疫苗相同 的免疫效果，但其接种后的副反应明显低于全细胞 疫苗[7】。因此，在如今无细胞百13咳疫苗逐渐推广 应用的同时，从无细胞疫苗各组分的制备、应用和质 量控制等方面，都已成为国内外研究的热点。 本实验采用辛酸．硫酸铵法和A蛋白亲和层析 法纯化杂交瘤细胞腹水，获得高度纯化的抗FHA单 抗，为深入探讨FHA结构与功能的关系、生物学活 性及百日咳杆菌毒力因子的致病机理奠定了必要的 物质基础旧J。 在全世界绝大多数发达国家的无细胞百日咳疫 苗生产过程中，都采用了ELISA方法对各组分的分 离纯化进行定量监控，以用于保证纯制工序中各组 分的浓度和收量[9]。而国内在制备无细胞百日咳疫 苗时，采取的工艺是对无细胞疫苗原液进行总的蛋 白定量，缺乏对在纯制工序中各组分有效的定量检 测方法，很难保证各组分的浓度和收量，我们通过运 用本文建立的ELISA方法，对国内几大生产厂家送 检的无细胞百日咳疫苗原液进行FI-IA含量测定，结 果显示同一单位送检的每批原液之间FI-IA含量不 是很一致，因此，运用此ELISA方法到无细胞百日咳 疫苗的生产工序中，对于提高我国疫苗的产品质量 有着重大的实际意义。本试验建立的定量检测FI-IA 的ELISA方法，不仅特异性强、灵敏度高及重复性较 好，而且简便易行、极易推广。本项工作填补了我国 该方面空白，如将其应用于无细胞百日咳疫苗的制 备及质量控制当中，将极大地促进我国疫苗质量的 提高，具有十分重要的意义。 参 考 文 献 [1]DavidA，Relman，MarinD0rⅢi咖rIi，da1．Filamentoushemagglufi— nindBontetellapertusssis：nucleotide∞qmceanderueialroleinad· herence．ProcNatlAcadSei，USA，1989，86：2637-2641． ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ O 如 笛 加 ：2 m ， [2]朱立平，陈学清．免疫学常用实验方法．北京：人民军医出版 社．2000：23-40． [3]徐志凯．实用单克隆抗体技术．西安：陕西科学技术出版社， 1992，77·79． [4]YujiSato，JamesL，Cowell．ela1．Separationandpurfieationofthe hema刚utininsfromBordetellapertmsis．Infectionandinamnity， 1983，41(1)：313．320． [5]BertrandFriguet，AhinF，aI舭．et日1．Measurementsofthetrue affinityconstantinsolutiondantigenebtibodycomplexesbyenzyme- linkedhnmunoeorbentassay．Journal0fimnamologiealraethods，1985， 77：305．319． [6] [7] [8] [9] 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