3pcr引物 ppt课件

（3）PCR引物设计中山大学药学院PCR引物的设计原则1PCR的引物设计PCR引物的使用引物的在线设计工具及免费软件简介中山大学药学院PCR引物的设计原则选择合适的引物是PCR实验设计的重要步骤，合适引物最基本的引物的长度 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 就是与靶序列的高特异性杂交。为达到此目的，引物设计应注意下列几点：理想的引物长度应该在18-30个碱基之间，常见的是20-27个碱基PCR引物的设计原则引物的GC含量引物序列中的GC含量应在35%-65%之间，最好在45%-55%范围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有过高的GC碱基，那么就在其5’端设计一串A或T；同样，如果引物中的AT含量过高，就在其5’端设计一串G或C，以便将整条引物的GC含量控制在合适的范围内。PCR引物的设计原则退火温度（Ta）引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低5℃左右，在很多情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到4-6℃，尚不至于影响RCR扩增反应的产量，但它们的退火温度应在55-75℃范围引物碱基≤20，Ta=4X（G+C）+2X（A+T）-5（℃）内。如果两条引物的退火温度差别过大，可以适当延长较低Ta值的引物的3’端（这样可以保持扩增产物的长度不变）或5’端。引物的Ta值估算有多种公式，最好根据RCR试剂盒建议的计算方法，例如AlkamiQuickGuide™试剂盒建议的计算方法如下：引物碱基≥20，Ta=62.5+0.41X（GC%）-500/长度-5（℃）PCR引物的设计原则杜绝互补区域的存在引物序列和靶序列各自内部应杜绝互补区域的存在。为扩增后操作提供便利条件在不影响扩增反应特异性的前提下，可在引物的5’端引入诸如限限制性内切酶识别位点、启动子序列等有用的非模板序列，以便于扩增后操作。PCR引物的设计原则引物与模板的互补程度在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到100%互补，但检查靶序列上其它可能存在的引物同源区域为了减少PCR扩增产物的污染本底，在设计引物序列时应检查模板DNA上是否存在潜在的引物同源区域。尽可能高的互补程度是必要的。PCR引物的设计原则选择内含子序列作为引物序列在真核生物中，即便是在重复基因的不同家族成员之间，其内含引物的末端序列在引物的两端设置1-2个嘌呤碱基，最好在引物的3’端避免G或C这样可以在聚合反应开始时增加引物后面碱基掺入的机会。引物3’端子序列也是随机多样性的。至少应有1-2个碱基必须是特异性的。中山大学药学院引物实际设计人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，Tm值要相近，每条10-50pmol/100l（1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同3‘下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同正链5'—————3'——上游Primer——下游Primer负链3'—————5'5'3'＋－上游Primer下游Primer例如：IL-3正链5'GCTCCATGACCCAG-----------CGATCTTTTGAGTCCAA3'负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT5'上游~：与其相同下游~：先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'所以负链Primer：5'-TTggACTCAAAAgATCgC-3'中山大学药学院（2）Primer本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构如：GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意减少Primer间互补序列导致2个Primer形成dimer一般不要超过3个互补bp如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC中山大学药学院中山大学药学院（4）Primer5’未端可修饰、突变修饰如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果突变：AGCTCCATGACCCAG5'CGCTCCATGACCCAG3'5‘Dig-GCTCCATGACCCAG3'5‘Biotin-GCTCCATGACCCAG3'注意：绝不可以在3'端进行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸（5）primer5’端增加碱基(1)内切酶识别点：5’-GAATTCGCTCCATGACCCAG-3’(2)保护bp：5’-GGGAATTCGCTCCATGACCCAG-3’对PCR产物cloning有很大好处便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同EcoRI1BglII2-3XbaI2-3HindⅢ>3BamHI2-3PstI>4XhoI>4NotI>10中山大学药学院(3)ATG起始密码5’-GGGAATTCATGGCTCCATGACCCAG-3’(4)TAA、TAG、TGA终止密码中山大学药学院如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆∵未切开，连接不上5'-TTATTggACTCAAAAgATCgC-3'PCR引物的使用PCR引物的标准使用范围：0.1-1.0mM，最好0.2-0.5mM特异性的改进：降低引物和dNTP的浓度可以在很大程度上改有效性的改进：增加引物与模板的分子比；如果引物中有不配善PCR扩增反应的特异性，高浓度的引物往往会导致非特异性的退火及副产物形成，同时也会促进引物二聚体的产生。在模板量一定的情况下，降低引物浓度实际上也是降低引物与模板的分子之比。对的碱基，则适当降低引物的浓度。RT时，引物设计3种方法a：Random9mers；b：OligodT-AdaptorPrimer；c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用c方法，要去查它的序列http://www.ncbi.nlm.nih.gov中山大学药学院AAAAAAA5’3’TTTTTTTT5’3’mRNA总cDNAOligodT-AdaptorPrimerRandom9mers特异的下游引物mRNAmRNAcDNA片段特异cDNA中山大学药学院5’5’2PCR的引物设计软件应用Oligo（引物评价）*PrimerPremier（自动搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在线服务）*中山大学药学院PrimerPremier5.0的使用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析中山大学药学院简并引物设计根据氨基酸序列来设计引物DNA引物PremierPrimer5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核（CiliateMacronuclear）2、无脊椎动物线粒体（InvertebrateMitochondrion）3、支原体（Mycoplasma）4、植物线粒体（PlantMitochondrion）5、原生动物线粒体（ProtozoanMitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（VertebrateMitochondrion）8、酵母线粒体（YeastMitochondrion）中山大学药学院PrimerPremier5.0使用介绍(1)PreimerPremier启动界面Loadsequence基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But…中山大学药学院引物编辑引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindowEnzymeOligo6.44使用说明主要功能：专门的引物设计软件OpensequencefileFinalPCRinformation中山大学药学院