细胞培养方法

2007-10-03|软琼脂集落形成率实验（软琼脂克隆）将1.2%低熔点琼脂糖与2X细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6%的底层琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml,将0.6%低熔点琼脂糖与2X细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂，每孔加1ml上层琼脂和100ul单细胞悬液（约1000cell/well），混匀，室温凝固。置于37C,5%CO2的细胞培养箱中培养2-3周，计数含50个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，Spotll采集图像。2007-10-03|MTT检测细胞增殖及见解细胞以每孔3000个接种至96孔板，分成不同组，每组3孔，利用含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养24h之后，向培养液中加入一定工作浓度的药物（单体或混合物），继续培养24h或48h。培养结束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT10口1,孵育2—4小时（应常在显微镜下观察）。去除培养液，每孔加入DMSO10Q1，充分振荡3分钟，立即在酶标仪上测定490nm的吸光度值。由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性，因而加入MTT之后应该在显微镜下观察，药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。若是改变则不可以使用此种方法。另有根据细胞ATP含量测定细胞增殖的方法，但是都要考虑药物对细胞ATP是否有影响。所以测定细胞增殖，最简单，最原始，最麻烦的方法，进行细胞计数我们感觉还是最好的方法。细胞培养方法哺乳动物细胞培养规则：1，严格按照细胞培养室规则进行哺乳动物细胞，由于细胞为整合生物中心共用，使用紧张，在使用时尽可能提高速度，保证操作规范。2，使用细胞间之后，主动将安全柜台面和桌面等清理整齐干净。3，在自己培养细胞岀现污染之时，及时通报同一培养箱培养细胞者，并将培养相关细胞的培养液/PBS/胰酶等全部清岀细胞培养室，以减轻对细胞培养的影响。4，实验所用细胞培养原则要求：A，细胞复苏之后两代开始使用；B，保证细胞每次传代前密度不超过90%;C,细胞使用最多12代（约2个月）。5，最好每天观察细胞生长状态，若有异常及时处理。6，具体参照HYPERLINK"http://www.atcc.org"www.atcc.org中细胞培养要求。细胞传代方法1，将长至80-90%细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。2，加入0.5—1ml0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中3，瓶口用瓶盖盖好，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,观察消化也可以用肉眼，当见到瓶1—3分钟。根据不同细胞而异在还未漂起时将胰酶弃去，加入适当体积的培养液终止消化底发白并岀现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为4，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，尽可能的避免气泡产生，分到另外两到三瓶中，置37C下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。5，细胞培养液参照HYPERLINK"http://www.atcc.org"www.atcc.org，一般含有10%胎牛或小牛血清。96/24孔板传代:,前同于普通细胞传代方法。,细胞吹打均匀后，对细胞进行计数，根据需要调至适当浓度。例如：每孔传代10000个细胞，可以将细胞调至浓度十万，之后利用排枪，吸取100UI，至96孔板中。3，24孔板，米用1ml移液器进行传代。细胞冻存方法1，预先配制冻存液：含90%FBS，10%DMSO的冻存液，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；2，取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1X10'5X106细胞/ml）;3，加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称/冷冻日期/操作者。4，放于程序降温盒，之后在-80C冰箱过夜。5，将程序降温盒中细胞放于液氮保存。6，要保证冻存细胞数量。细胞复苏方法1，从液氮中取岀冷冻管，迅速投入37〜38C水浴中，不断摇动使其融化（1分钟左右）；2，尽快用培养液稀释至原体积的10倍以上；3，低速离心10分钟，1000转；4，去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。5，尽快对复苏细胞进行换液。6，扩大培养后，再冻存至少复苏数量的细胞，以保证细胞库的完整。5细胞计数1、将血球计数板及盖片用双蒸水擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml=4大格细胞总数/4X10000实验前准备下列物品：双蒸水瓶子（500ml、250ml），离心管，tip头，Eppendof管，滤纸，餐巾纸，微量加样器20-50卩l。具体实验步骤如下：细胞总蛋白的提取利用RIPA细胞裂解液，提取经处理细胞的总蛋白，根据RIPA试剂盒提取步骤如下：1，收集细胞，加入300卩IRIPA和3讪PMSF（不可以预先加入PMSF），利用枪头吹打，放置于冰上30min2，将样品于4C、30min、20000g离心3，小心将上清液转移到新的离心管中，分装成每管25讪，于一70C保存4，两份5讪的细胞裂解液，稀释10倍之后，利用BCA法测定蛋白质浓度。利用BCA-100蛋白质定量测定试剂盒（购自上海申能博采生物科技有限公司）测定蛋白质浓度，步骤如下1，SolutionAandSolutionB混合液（根据需要确定混和量，A:B=50:1）A，绘制 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线和加样，如下表3—4:1457BSA(卩l01.252.55A+B(g)10098.7597.595OD5700.0050.0630.1230.243OD5700.0030.0670.1280.245OD5700.0060.0650.1200.248OD570（平均值）0.00460.0650.12330.24浓度（gg/ml）0100250500将上述加好的样品放于酶标板将酶标板放于37C摇床放置30minD，取岀酶标板，利用酶标仪测定其OD570E，绘制标准曲线，如图：3-1E，根据标准曲线测定样品的浓度。F，稀释之后样品浓度测定值如下表3—5:NaF浓度04mM6mM8mM样品量（gl5555A+B（gl95959595OD5700.0950.0900.0990.080OD5700.0900.0860.0960.086OD5700.0980.0890.0980.085OD570（平均值）0.0940.0880.0980.084浓度（gg/ml）179.7167.0188.2158.6配制SDS—PAGE胶将垂直电泳用玻璃，先用自来水冲洗多次，之后利用蒸馏水冲洗干净，放置于烘箱中烤干，将玻璃放置在制胶架上，根据上述PAGE胶的配置方法配制分离胶，之后将配制胶灌于两个玻璃之间至距梳齿0.5cm或距玻板1.5cm处标记（胶会收缩）。加入一层异丁醇厚约1cm，置30-45min,两者之间会岀现一条明显的界线，量分离胶的宽度，倒岀，冲洗（1XTris/SDS，PH8.8）未聚合的丙烯酰胺，滤纸（普通）吸干（带手套，Whatman3mm滤纸）。加入积层胶，插梳子，置30-45min，拔梳子，冲洗（蒸馏水）未聚合的丙烯酰胺，把凝胶固定于电泳装置，加入1X电泳缓冲液，排岀凝胶底部两玻板间的气泡（注射器弯90C），不要预电泳，以免破坏缓冲系统的不连续性。加样（冰上）加样缓冲液用前加50卩l&巯基乙醇至950卩lsamplebuffer（5讣95讪,10卩1-190卩l,15讪-285山,20讪-380山），samplebuffer稀释样品（100叨总蛋白，至少30^g）至少1:2，总体积＜25卩丨（30-45M），约20讪（可用水试验一下），100°C5min,冲洗加样孔，加样，注意加样均匀，水冲洗枪头于餐巾纸。最外侧加等量样品缓冲液，避免边缘效应，或MARK（预染蛋白质marker）加样孔。电泳和取胶正负极正确连接，80v，90-120min（1h），电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止；关闭电源，带手套（防止油脂阻碍蛋白转膜）将胶取岀放于一吸水纸上，备盒子，转移液多一点，撬玻璃，浸湿一下，刮下最左边的两个加样齿做标记，玻璃作尺子，切积层胶，垫片挑下，转移缓冲液，摇30min。电转（带手套，油脂阻碍蛋白转膜）利用电转缓冲液浸泡滤纸15min，并利用甲醛浸泡PVDF膜5min，再用电转缓冲液浸泡PVDF膜10min，之后按照大滤纸-膜-胶-纸（试管赶气泡）放置于电转设置，于冰中电转，350mA，120min，看电流，取膜，切硝酸纤维膜的右上角标记（参考分子克隆红皮P366）此步之后可以利用丽春红染液检测转膜效果，并记录蛋白Marker的位置，确定电转效果。然后再利用蒸馏水洗涤多次，可以将丽春红染液洗掉，继续进行下面实验。圭封闭将膜浸于封闭液（含有色摇床上，室温2.5h5%脱脂奶粉，0.1%（v/v）的PBS—T或者TBS—T）中，在水平脱之后快速利用washbuffer洗涤一次15min,再洗两次各5min。加入一抗首先按要求将一抗利用PBS—T或TBS—T稀释，将PVDF膜放于杂交袋中，按0.1ml/cm比例加入一抗稀释液，放于4C冰箱过夜；之后浸于Washbuffer，按照>4ml/cm2室温洗涤一次15min，之后利用新鲜的Washbuffer2x5min洗涤。将二抗按照要求进行稀释于之后和步骤8一样洗涤。加入二抗PBS—T或TBS—T中，室温将膜浸于二抗，放于脱色摇床2.5h，染色将kit中的solution1和solution2等体积混和，之后按照0.125/cm2等体积覆盖于膜上（蛋白面向上，膜放于平面上），室温放置1min，将膜利用镊子赶走多余的detectonreagent显影将膜蛋白面向上，放于X—rayFilmcassette,在暗室中将film放于膜上，盖上cassette,5分钟。快速冲洗，之后放于第二个film，放置10min.将冲洗的胶片放于室温凉干。2007-09-29|定量PCR技术思考定量PCR现在已经是一种常规的生物学实验技术手段，俺也有相当一段时间采用这种技术来分析基因的表达。现将此技术与大家分享。其实我认为定量PCR最常用的是相对定量，其实和我们以前的半定量PCR一样，只是此技术的升级版本。定量PCR最大的麻烦是特异性和污染问题。特异性主要当然是引物的设计，所以我主张：首先采用别人发表的引物为佳。当然采用的paper的级别要高点为好，例如PNAS以上等，这样的可信度高。其次就是自己设计，设计的原则在takara的定量PCR宣传册已经非常的详细，但是一般来说很难能够达到完全符合要求。这样最好设计两对以上的引物，进行定量PCR。定量PCR是要看溶解曲线的，而且要关心溶解曲线峰的宽度，但是这个不是很准确，从严格的角度来说，还要在定量PCR之后，将产物进行电泳检测，看是否特异。若是特异才可以采用这种方法。再次，内参我认为至少应该采用两个，因为现在发现很多的药物等可以改变beta—actin的表达。最后，做此实验时，一定要独立重复，而不是复孔进行实验。此实验一定要严格带手套进行，以防污染，一旦污染整个实验便没有意义，即使只是一点点污染。软琼脂克隆法与裸鼠体内接种法检测细胞致瘤性的比较