脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯一、目的：1、掌握在乳液中进行脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯的
方法
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和技术2、考察反应体系的油水比例以及不同表面活性剂对酯合成反应转化率的影响.3初步掌握用GC对产物进行定性定量分析的方法，学会仪器的使用二、原理1、酶催化反应特点在有机溶剂中，酶的催化活性与系统的含水量密切相关。系统含水量包括酶粉水合的结合水，溶于有机溶剂中的自由水以及固定化载体和其它杂质的结合水。只有在最适水量时蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间达到最佳平衡点，酶表现出最大活力。2、反胶束及其在酶催化反应中的应用反胶束体系是表面活性剂分散于有机介质中白组装形成的纳米尺寸的油包水胶体分散体系，它为表面活性剂分子所稳定•反胶束微粒的大小取决于增溶水量的多少和表面活性剂的浓度，当二者之比一定时，反胶束微粒的大小也保持一定。反胶束体系的性质常用W进行表征,w0为水与表面活性剂的摩尔比.其大小决定反胶束微粒(“水池”)的大小。3、表面活性剂在微乳液中的应用及原理按亲水部分的特点不同，表面活性剂可分为阴离子型、阳离子型、非离子型和两性表面活性剂.阳离子型表面活性剂的代表为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。阴离子型表面活性剂，尤其是磺酸酷和磷酸醋型表面活性剂，由于其极性头部极性较大，所形成的反胶束“水池”也较大，在构建反胶束体系方面应用广泛.反胶束体系中的核心水团不同于溶液水，包括自由水和结合水.在w。较小时，核心水团主要是结合水，随W。增大，自由水逐渐增加，核心水团的微环境逐渐接近于水溶液。酶分子与表面活性剂分子间的作用取决于酶分子与反胶束的性质。酶分了可一定程度地附着于反胶束膜上，有时甚至部分地伸出膜外。在胶束中酶分子的构象受到反胶束微粒的限制.结构运动的白由度相对较小.酶在反胶束体系中的活性由以下三方面因素决定:核心水团的大小，表面活性剂的种类与反胶束微粒的浓度。W。是影响反胶束体系中酶活性的最重要参数。4、反胶束作为有机相酶催化体系的优点与水相相比，反胶束作为有机相酶催化的研究体系具有许多独特的优点：稳定的微环境。。。。微水相中酶的稳定性大大提咼。。。。增加了非极性底物的溶解度，有利于高浓度底物的连续生物转化，产物很容易从低沸点溶剂中得到分离。。。4•良好的物理化学性质。。。。iDB占A/异辛烷微乳腋中悔催化酯合成反应示意图三、仪器与试剂1、仪器恒温水浴锅、气相色谱仪、离心机、超声波清洗器、烘箱、精密便携式酸度计2、试剂异丁酸、异戊醇、异辛烷、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基苯磺酸钠、脂肪酶CR、磷酸钾磷酸二氢钾缓冲溶液四、实验步骤1、配置缓冲溶液1）称量K2HPO4.3H2O2.2822g,KH2PO41.1360g,用去离子水各配置O.1mol/L的溶液，分别记为A,B液；2）取A液61.5ml,B液38.5ml,混合，蒸馏水定容至1000ml；3）搅拌，PH计测量并且调整PH为7.2、微乳液B组：以十六烷基三甲基溴化铵CTAB（如下图）为表面活性剂制备（W0=5的反胶束反应体系），其中异辛烷作为微乳液体系中的油相，CTAB作为表面活性剂。CH$BrHaC(H2C)1s-N*"CH3CH31）称量XgCTAB,以及Yml异辛烷溶剂，配制浓度为C的CTAB溶液，将配制好的溶液放入40°C的水浴中，并利用磁力搅拌将其溶解，约5min后于超声清洗器中超声，使之粉碎，约30s；2）待体系温度稳定稳定后，向超声均匀的锥形瓶中加入pH=7.0的缓冲溶171微升；3）重新40C的水浴中，并利用磁力搅拌使反应体系稳定，得到反相微乳液，得到反相微乳液，加入CCL酶6mg。3、酯化反应1）经过30min磁力搅拌后，此时反应体系趋于稳定，将异丁酸100微升，异戊醇171微升加入锥形瓶中；2）继续将溶液放入40C的水浴中，并利用磁力搅拌使反应充分进行；3）反应开始计时后，每1小时抽样1.5ml，于离心机中离心，最大转速16000三分钟后取上层清夜（约2mL）。4、产物分析1）用气相色谱进行定性分析，所用色谱柱为SE50mX0.25mmX0.25“m的毛细管柱，样品在60C保留2min后以10C/min程序升温到200C，保留10min，再以30C/min程序升温，到250C保留10min；2）以乙酸丁酯为内标，用内标法走气象色谱，根据不同的保留时间确定产物。五、结果与讨论（1）通过两组比较，相同W0条件下，发现表面活性剂十二烷基苯磺酸钠较之十六烷基三甲基溴化铵能更快的形成反胶束溶液，而十六烷基三甲基溴化铵容易形成挂壁现象，对反应的进行不利。（2）脂肪酶CR的效果不是很好，可能的原因为：1）40C可能会造成脂肪酶CR的构型出现问题，而影响转化率；2）由于表面活性剂并没有完全溶解，并没有形成良好的微环境；（3）色谱分析表明，W0从4变化到8,所得谱图变化不大，可能的原因为，在较短的反应时间内，W0对反应影响不是很大，但跟其他组相比之下，W0=5时，所得反胶束微溶液更为透明，因此推断此值为更适合的W0。
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