GE中文-疫苗和载体纯化手册

GE Healthcare 疫苗和载体纯化手册 疫苗 培养 澄清、浓缩 纯化 微载体 微滤 超滤 层析 除菌过滤 细胞培养疫苗生产工艺平台 目 录 3 迎接现代疫苗和载体纯化的新挑战 4 疫苗和载体生产及纯化策略 5 人用重组亚单位疫苗的纯化 6 纯化制备人用病毒疫苗的疫苗 8 人和动物基因治疗用质粒的纯化 10 人用基因治疗病毒的纯化 12 纯化用于制备动物病毒疫苗的病毒 14 对下游纯化工艺的杰出见解和技术支持 迎接现代疫苗和载体纯化的新挑战 正如以蛋白为原料的药物一样，疫苗以及载体也要受到管理 部门的审查， 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 产品符合严格的安全性和有效性的质量标 准。生物制药公司自身也同样要对自己的产品制定一些保证 产品质量的高 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ：这些都使生产厂家面临着既要快速向市 场推出生物药物，又要考虑经费投资的挑战。 通用电气医疗集团在解决这些问题方面有完备的设施保障， 确保产品达到所有要求。在美国食品药品监督管理局 (FDA) 所批准的所有生物药物中 (包括各种新兴疫苗)，有90%的厂 家使用我们通用电气医疗集团的层析设备生产；并且在所有 实验室规模的蛋白质纯化中约有 70%使用我们的产品。 经过验证的上游、下游技术和生产经验 我们通用电气医疗集团的细胞培养微载体、层析系统及膜过 滤产品在全世界实验室、中试及生产规模被广泛应用。例如： 已经证实了在人用和兽用预防性病毒疫苗生产中，使用 CytodexTM微载体的工业规模细胞培养，是一种安全可靠和低 成本的方法。 我们的研发人员，技术支持和维修专家可在生产的任何环节 上为您提供帮助，解决问题。我们工程师熟知疫苗和病毒载 体的下游制备过程中的纯化要求标准。由于疫苗，载体只在 很窄的pH范围内才稳定，因而它们不同的亚型特性，高分子 量，复杂的表面性质和不稳定结构会形成特殊问题。当需要 对传统的基于蛋白质的纯化方法进行改进时，我们有您所需 要的完整解决 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。 为满足大量疫苗和载体生产线的需要，加上全球对新的和更 高质量产品的需求，通用电气医疗集团承诺为生物分子的生 产和纯化提供技术支持。 在这份报告中，重点谈及以下几种纯化技术： ● 人重组亚单位疫苗 ● 人病毒疫苗 ● 人用/兽用基因治疗及用于 DNA疫苗的质粒 DNA ● 人用基因治疗病毒载体 ● 动物病毒疫苗 流感疫苗大规模生产车间 (照片使用经Baxter Biosciences公司允许) 3 疫苗和载体生产及纯化策略 近几十年，用于生产疫苗的免疫和技术策略大幅增加，许多 早期的开发主要集中在增加传统预防性疫苗的安全性，有效 性和供应保障方面，例如肝炎和流感。然而，大多数却倾力 开发针对那些尚无治疗手段的疾病的新型人用疫苗。另外， 对于非感染性疾病，除了治疗用外，例如癌症。研究者的注 意力也由单纯的根治策略向预防策略转变，例如帕金森氏病。 兽用疫苗也发生了相应的大幅增加，特别是对于像口蹄疫， 疯牛病和禽流感这样严重的流行性疾病地区。在基因治疗中 将病毒载体作为运送工具，把遗传物质输送到靶细胞这种现 代手段正在引起人们重新审视疫苗。将产品开发与FDA (美国 食品药品监督管理局) 和 EMEA (欧洲医药机构) 所实施的更 高安全要求以及对更好的产品和纯化工艺的需求相结合已势 在必行。 疫苗生产改进概况 更安全，更有效和成本更低的疫苗的需求, 正在给生产商带 来大量商机。 微载体培养系统是一种有引人注意的培养哺乳动物细胞的手 段，它在疫苗生产实践中被充分证明，能够大量减少培养基 和血清费用，减轻体力劳动和减少污染风险。在下游处理过 程中，超滤和层析技术确保了纯化物的高回收率和终产品的 安全性。 所有这些技术都共同拥有许多重要特性：它们重复稳定，经 济节约并且便于按比例放大；同时，从开始到常规生产都享 受遵循规程要求的生产和维修全程服务。 微载体产品定购信息 产品 包装 货号 cytodex 1适合于一般细胞培养 (比表面积4400 cm2/g) cytodex 1 25 g 17-0448-01 cytodex 1 100 g 17-0448-02 cytodex 1 500 g 17-0448-03 cytodex 2适合于一般病毒培养 (比表面积3300 cm2/g) cytodex 2 25 g 17-0484-01 cytodex 2 100 g 17-0484-02 cytodex 2 500 g 17-0484-03 cytodex 3适合于一般较难培养细胞 (比表面积2700 cm2/g) cytodex 3 10 g 17-0485-01 cytodex 3 100 g 17-0485-02 cytodex 3 500 g 17-0485-03 大规模液相层析和膜分离系统为疫苗生产商提供许多商机，生产更安 全，更有效和成本更低的人用/兽用疫苗以及用于基因治疗的质粒DNA 产品。 4 5 人用重组亚单位疫苗的纯化 乙型肝炎表面抗原疫苗 乙型肝炎 乙型肝炎就是“肝脏感染”，乙型肝炎是常见的五种血清肝炎 感染之一，由B型肝炎病毒引起。肝炎病毒共分五种血清型， 即 A，B，C，D，E。这五种病毒都能引起急性疾病且症状持 续几周，包括皮肤、眼睛 (黄疸)，血尿，极度疲乏，恶心，呕 吐和腹痛。一些症状或许可以持续一年。 乙型肝炎和丙型肝炎病毒能引起慢性感染，病人由此成为一 个潜在的病毒携带者，许多年之后还能发展为肝硬化或肝癌。 由于在全世界范围内乙型肝炎是第十位致死性疾病，所以它 被认为是五种血清型中最严重的。 乙肝疫苗有十分突出的使用安全性和明显的保护性效果。从 1982年以来，全世界已经有超过十亿人份使用过该疫苗。从 1991年起，世界卫生组织 (WHO) 已经要求全世界各个国家 将乙肝疫苗接种列入各国的计划免疫规划中。 纯化策略 据估计全世界约有5%的人口被乙肝病毒感染，仅在中国，就 可能有9%的人群是乙肝病毒的携带者，并且每年新增的感染 者高达一百万。为控制这种趋势，就要付出巨大努力，生产 出既不昂贵，又高效的，能保护人群中未感染者的疫苗产品。 纯化的 r-HBsAg 离心或切向流过滤 去除细胞碎片 Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow层析 r-HBsAg的捕获 Sephadex G 25或者透析过滤 更换缓冲液 DEAE Sepharose 6 Fast Flow层析 去除内毒素和残余DNA 超滤 产品浓缩 Sepharose 6 Fast Flow层析 终纯化 细胞培养上清 (CCS) 图1. 从CHO细胞培养液中纯化重组乙肝病毒表面抗原r-HBsAg的下 游工艺。 由于重组疫苗的大规模生产，目前这个目的已经达到。纯化 乙肝病毒表面抗原 (r-HBsAg) 的层析分离方法既实用，又经 济。 纯化工艺 图1是从中华仓鼠卵巢细胞 (CHO) 培养液中纯化 r-HBsAg的 流程。整个工艺由三步层析纯化，加上为更换缓冲液而进行 的膜过滤和产品浓缩步骤组成。 纯化工艺中的关键步骤是使用了有疏水作用的凝胶介质 Bu- tyl-S Sepharose 6 Fast Flow，它能够从培养液中捕获r-HBsAg 而让其它杂质保留在上清中。这个过程可去除97%的杂蛋白 并对 r-HBsAg的回收率大于 90%。图 2是一个经过澄清的细 胞培养液上样至Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow柱，层析分离 后典型的洗脱图。经过此步骤，目标蛋白被纯化 34倍。 对洗脱组分1，2，3中 r-HBsAg的活性分析显示，组分1中没 有 r-HBsAg活性，组分2中包含了大于90%的 r-HBsAg活性， 接着用 DEAE Sepharose Fast Flow做中度纯化和最后一步用 Sepharose 6 Fast Flow进行精纯化，可将目的蛋白纯化 800 倍。 凝胶介质： Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow 柱： XK50/20 (装柱体积130 ml) 样品： 300 ml浓缩的细胞培养上清 CCS (含有约12 mg的 rHBsAg)， 硫酸铵浓度约为 0.6 M，pH调至 7.0 图2. 经Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow柱层析开始纯化 r-HBsAg的洗 脱图。 Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow是专为从 CHO细胞中纯化 r- HBsAg规模化生产而开发和优化的新产品。它的重要性在从 培养液中捕获目的产物，去除杂质的工艺中已经充分体现， 它对样品条件没有苛刻要求 (如pH值，盐浓度); 这种纯化 方法为大规模疫苗生产提供了一种既实用，又有效并且节省 成本的生产方法。 另外，它能将随后用于中度纯化和精纯化的层析步骤以及为 更换缓冲液和浓缩产品的膜过滤步骤轻松的整合为一体。 Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow，一种BioProcessTM生物分子生 产级介质，提供的支持包括经过验证的生产方法，保证供货 和一套管理支持文件 [Regulatory Support File (RSF)] 以协助 生产企业进行工艺验证并提交给管理机构。 产品定购 乙肝疫苗纯化产品信息 货号 Bytyl-S Sepharose 6 Fast Flow 11-0026-34 产品 包装 货号 Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow 25 ml 17-0978-10 Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow 200 ml 17-0978-02 Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow 1 L 17-0978-03 Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow 5 L 17-0978-04 Sephdex G-25 coarse 100 g 17-0044-01 Sephdex G-25 coarse 500 g 17-0044-02 Sephdex G-25 coarse 5 kg 17-0044-03 DEAE sepharose Fast Flow 25 ml 17-0709-10 DEAE sepharose Fast Flow 500 ml 17-0709-01 DEAE sepharose Fast Flow 10 L 17-0709-05 纯化制备人用病毒疫苗的疫苗 人流感疫苗 6 流感 流感由一种主要侵染上呼吸道的病毒引起，病程通常持续大 约一周，流感的症状主要表现为突发高热，头痛，浑身不适， 干咳，咽痛和流鼻涕。大多数人无需治疗即可恢复，但是对 幼儿、新生儿和服用某些药物的病人，患流感就会带来严重 危险。对于这些人，感染流感会导致各种在原疾病基础上的 严重的并发症，肺炎甚至死亡。 流感在全世界范围内呈快速、季节性流行，并增加医院和其 它保健机构的经济负担，降低劳动生产率。 预防和减少流感流行的主要手段是每年进行流感疫苗免疫。 各型流感疫苗都已被研制出来，并且流感疫苗使用历史超过 了60年。大多数流感疫苗用孵化的鸡胚培养生产，由于考虑 到鸡胚的来源和由卵清蛋白引起的过敏反应等因素，流感疫 苗的生产已经逐步在用动物细胞培养系统取代。这样的生产 系统也更容易达到 FDA和 EMEA所制定的对疫苗高安全性的 要求。 纯化策略 如同其它所有病毒一样，人流感病毒颗粒远比蛋白质和肽这 类分子大，利用这个特征可以从发酵液中分离病毒。它能应 用包括超滤这样的膜分离技术，和凝胶过滤 (分子筛) 这样的 层析分离技术的组合模式进行分离。这两项技术已被结合， 开发成一套完整的流感病毒疫苗下游生产工艺。 纯化的人流感病毒 微孔过滤 0.45 mm 去除细胞碎片 超滤 中空纤维柱 截留分子量750 kDa 病毒浓缩和减少杂质 (HCP) Sepharose 4 Fast Flow层析 去除杂质 (HCP) Q Sepharose XL virus licensed 层析 去除杂质 (HCP) 和 DNA 超滤、透析 中空纤维柱 截留分子量750 kDa 病毒浓缩和配制 人流感病毒细胞培养上清液 图3. 由超滤和层析组成的简单下游工艺制备出符合规程要求的纯病 毒材料。 7 图 5. 由 Sepharose 4 Fast Flow组合分离步骤所收集的外水体积 的病毒进一步用阴离子交换介质 Q Sepharose XL virus licensed 进行纯化。 表 1. 人流感病毒质量 宿主细胞蛋白 未检测到 */剂 宿主细胞核酸 <100 ng/剂 ** 感染性 与蔗糖梯度凝胶纯化的病毒相同 * n.d. = 未检测到 ** dose = 每剂含 45 m g血凝素抗原 (免疫分析定量) 图 4. 用 Sepharose 4 Fast Flow的凝胶过滤纯化过程中的人流感 病毒，洗脱在外水体积中。 （病毒） 血凝素活性 纯化工艺 图 3概述了基本的纯化工艺流程。随着样品经离心和深度过 滤处理后，来自Vero细胞培养的，富含病毒的上清离心可随 时进行进一步纯化。 这些过滤后的培养上清液用通用电气医疗集团的中空纤维超 滤柱作预纯化和浓缩，然后将含有病毒的超滤浓缩液用 Sepharose 4 Fast Flow以凝胶过滤方式纯化。人流感病毒在 外水体积中 (图4)。宿主细胞的组分，例如小DNA和蛋白分 子滞留在凝胶中，在随后的洗脱过程中被洗脱出来。 病毒用离子交换介质 Q Sepharose XL virus licensed作最后的 精纯化。流感病毒存在于穿流液中，而寄主细胞的DNA分子 和其它带负电荷的细胞成分结合在柱上 (图5)。 最后的浓缩和配制是在中空纤维超滤柱上进行第二次超滤/ 透析处理、所获得的结果 (表 1) 显示纯化的病毒符合规程要 求。 评述 这个纯化方法是完全可以按比例放大的。层析柱和超滤柱可 以在位清洗，整个过程能在一到两天内完成。 此外，这套方法特别适用于病毒疫苗制备。开放的中空纤维 交叉滤膜流路建立起具有低的剪切力的平稳通道。 另外，人流感病毒不与柱内胶介质结合，直接流穿层析柱，使 该工艺特别适合应用于那些敏感的病毒颗粒。它对各型的人 流感病毒株都适合，因此可认为是一种通用的病毒纯化工艺。 产品定购 流感疫苗纯化产品信息 货号 Sepharose 4 Fast Flow 18-1020-52 Sepharose 6 Fast Flow Q sepharose XL virus licensed 18-1123-82 产品 包装 货号 Sepharose 4 Fast Flow 1 L 17-0149-01 Sepharose 4 Fast Flow 10 L 17-0149-05 Sepharose 6 Fast Flow 1 L 17-0159-01 Sepharose 6 Fast Flow 10 L 17-0159-05 Q Sepharose XL Virus Lic 300 ml 17-5437-01 Q Sepharose XL Virus Lic 1 L 17-5437-03 Q Sepharose XL Virus Lic 5 L 17-5437-04 8 人和动物基因治疗用质粒的纯化 质粒 DNA 基因治疗 基因治疗就是在基因水平达到治疗疾病的目的。通过将基因 送入靶细胞使其表达有治疗作用的蛋白质或肽来治疗疾病。 质粒 DNA则是将基因送入靶细胞的载体。 用于临床的质粒DNA必须符合严格的纯度要求。如果以后是 商用的产品，所用的纯化方法还必须符合大规模生产和药品 生产管理规范 (GMP) 的要求。 纯化的超螺旋质粒DNA 超滤 中空纤维柱 截留分子量100 kDa 裂解液浓缩 Sepharose 6 Fast Flow层析 去除 RNA PlamidSelect层析 超螺旋质粒DNA 的捕获 SOURCE 30Q层析 精纯/去除痕量的内毒素 超滤 中空纤维柱 截留分子量300 kDa 产品液浓缩和配制 澄清的细胞裂解液 图 6. 用澄清的裂解液为样品的三步层析纯化工艺。 纯化策略 用于基因治疗，质粒DNA必须为超螺旋结构并且不含细菌染 色体 DNA，RNA，蛋白质和内毒素。另外，纯化所用介质和 工艺应便于顺利并节省成本地转化成大规模生产。由于绝大 多数质粒DNA生产所选用的宿主菌是大肠杆菌，纯化的实际 问题就是去除其它核酸，内毒素和痕量污染物。 既经济又高通量的要求使得某些方法不能适用于大规模纯化 生产。尽管用这些技术制备纯化的材料能进入一期临床试验， 但它们并不适用于大规模生产，二、三期临床明确要求的是 能按比例放大，同时也是经济节约的技术。超滤和层析纯化 是完全能按比例放大，低成本并能达到 cGMP的要求的。但 是，这套工艺要把所纯化的质粒大小考虑进去。 纯化工艺 在各种规模的质粒DNA制备中，获得高纯度的质粒DNA是成 功达到治疗目的的关键。在此叙述的三步纯化法是在试验室 开发并通过增加层析柱直径和相应膜过滤面积转化成中试规 模。起始材料选用含有高拷贝质粒的大肠杆菌培养液。碱裂 解后收集，然后离心澄清，在中试规模生产中，这些澄清的 溶菌产物在中空纤维超滤柱上浓缩五倍。 图 6显示该工艺流程图，图7是层析结果:1) 用 Sepharose 6 Fast Flow凝胶过滤去除RNA并更换缓冲液；2) 用PlamidSel- ect从开环 (oc) DNA 质粒中选择纯化超螺旋共价闭环质粒 DNA；3) 用SOURCE 30 Q阴离子交换层析去除内毒素并进行 精纯化。所有的纯化步骤都在AKTApilot系统上进行，最后的 浓缩和缓冲液更换用超滤完成。 图 7. 通过关键的第 2步 PlamidSelect分离，从开环质粒 DNA和残存的杂质，例如基因组 DNA及 RNA分离出超螺旋质粒 DNA。 oc = 开环　ccc = 共价闭环。 系统： AKTApilot 样品：经 Sepharose 6 Fast Flow组份分离的 质粒 DNA 柱： PlamidSlect，FineLINETM 70 系统： AKTApilot 样品：澄清的碱裂解液 柱： Sepharose 6 Fast Flow, BPGTM 100 系统： AKTApilot 样品： PlamidSelect处理后获得的超螺旋 质粒 DNA 柱型： SOURCE 30Q, FineLINETM 35 9 表 2列出中试规模生产中各步的纯化数据。结果显示该工艺 达到高纯度，并符合 cGMP对治疗用质粒的要求。收率也很 高 (表3)。 评述 这种中试规模的工艺达到了大量获得高纯度质粒的目的。它 重复稳定，完全符合cGMP要求，便于进一步按比例放大生产。 注意，在超螺旋质粒纯化起始试剂盒 (Supercoiled Plasmid Purification Starter Pack) 中装有纯化过程中所用的三种凝胶 介质，加上一份详细的操作说明。该试剂盒每次可纯化大约 10 mg符合规格的基因治疗用超螺旋质粒DNA，并成为cGMP 生产路途上的一极好起点。在一些应用中，该工艺可通过简 单减掉一两个层析纯化步骤进行修改，以生产质量稍差的质 粒DNA。其产品纯度将有所降低，但是每克产品的成本减少， 它可能是一些应用工作所希望得到的产品。 表 2. 中试规模运行的最终产品的纯度 共价闭环质粒DNA (%) CGE* 95 共价闭环质粒DNA (%) AGE** 95 质粒浓度 (mg/ml) 3.9 内毒素 (E.U./mg 质粒DNA) 0.05 RNA (m g/mg质粒 DNA) 0.02 基因组DNA 量 (m g/mg质粒DNA) 0.97 蛋白含量 (m g/ml) < 5 1 * 毛细管凝胶电泳 ** 琼脂糖凝胶电泳 1 低于检测范围 产品定购 质粒纯化产品信息 货号 SOURCE 30Q and SOURCE 30S 18-1107-12 Plamidselect-Supercoiled Plasmid Puricication Starter Pack 18-1161-73 超螺旋质粒 DNA下游纯化工艺 28-4057-63 基因治疗及基因质粒药物的生产 2005-03-08-BJ 产品 包装 货号 Sepharose 6 Fast Flow 1 L 17-0159-01 Sepharose 6 Fast Flow 10 L 17-0159-05 Plasmidselect Purification Pack 1 pack 17-6002-94 Plasmidselect 200 ml 17-5257-02 Plasmidselect 1 L 17-5257-03 Plasmidselect Xtra starter Kit 1 pack 28-4052-68 Plasmidselect Xtra 200 ml 28-4024-02 Plasmidselect Xtra 1 L 28-4024-03 SOURCE 30Q 50 ml 17-1275-01 SOURCE 30Q 200 ml 17-1275-02 SOURCE 30Q 1 L 17-1275-03 表 3. 中试规模运行每个纯化步骤后的产量 * 产量 Sepharose 6 Fast Flow** 92 PlamidSlect (%) 72 SOURCE 30Q (%) 98 超滤 (%) 81 * 用A260紫外吸收值计算 ** 用 PicoGreenTM荧光实验 (Molecular Probes公司) 测定超滤澄清液中的 质粒 pDNA浓度 超螺旋质粒纯化起始试剂盒 (PlamidSlect-Supercoiled Plasmid Purification Starter Pack) 每次可纯化大约10 mg符合规格的基因治 疗用超螺旋质粒 DNA。其组成介质 (Sepharose 6 Fast Flow， PlamidSlect和SOURCE 30Q) 随时可根据工艺需求大量购买，以符合 cGMP生产要求。 10 人用基因治疗病毒的纯化 病毒载体 腺病毒和腺病毒相关的病毒载体 腺病毒是非脂包膜病毒，有许多种人和动物特有的血清型。 人腺病毒感染只引起轻度的上呼吸道的炎症，极少引起严重 疾病。绝大多数的成人体内有抗腺病毒的抗体。 人们已对腺病毒进行过很深入地研究，能将它用于基因治疗 是基于它的几个优良特征:(i) 在培养液中很容易生产;(ii) 能 感染各种细胞型;(iii) 腺病毒基因整合进宿主细胞染色体的危 险小; (iv) 容易对其进行基因水平操作和制备突变体或删除病 毒，而且 (v) 病毒粒子非常稳定不易被破坏。 腺病毒相关病毒是很小的单链DNA病毒, 属细小病毒科。有 六种人血清型，全都是非致病性的病毒，这些病毒能够用于 基因治疗的优势是目的基因能够持续在宿主细胞内表达，减 少了需重复使用的试剂量。 纯化策略 腺病毒 (Adv) 的分子量比通常所见的蛋白质分子量大，这种 高分子量和大水化直径将影响到如何处理腺病毒原料的特殊 特性方面的问题，例如对剪切力的耐受度和传质阻力。 目前所用的珠型层析介质的微孔结构对分离如此大的粒子并 不适用，它仅允许大的粒子结合到表面上。下面所列的主要 策略是利用了一种增加表面积和呈现更多配体的，长的，柔 性葡聚糖链的离子交换介质。 纯化工艺 图 8概述了一种基于离子交换介质的，以澄清的细胞裂解液 为起始原料的，特殊的腺病毒纯化工艺流程。Q Sepharose XL virus licensed介质提供快速，可按比例放大的，能将在基因 治疗和疫苗生产中所用的腺病毒或其它病毒进行纯化的方法。 图 8. 腺病毒，Ad5的下游纯化工艺 (图片使用经英国Cobra Biomanufacturing公司允许)。 图 9. Q Sepharose XL virus licensed离子交换 介质纯化腺病毒的层析图 (图片使用经英国 Cobra Biomanufacturing公司允许）。 凝胶介质： Q Sepharose XL virus licensed 样品： 预处理过的 Ad5-CMV-NTR 纯化的 Ad5病毒 微孔过滤 0.65/0.2 m m 去除细胞碎片 超滤 中空纤维柱 截留分子量300 kDa 病毒浓缩 Q Sepharose XL virus licensed 层析 捕获 Ad5病毒载体 Sepharose 4 Fast Flow层析 精纯化 超滤 中空纤维柱 截留分子量300 kDa 产品浓缩和配制 澄清的细胞裂解液 与传统的离心分离病毒相比，这种层析纯化工艺明显省时， 它仅用几小时就能完成传统工艺高达二十四小时的工作，并 且回收率更高。另外，临床批量生产按比例放大呈直线型。图 9 是一个典型的层析纯化图。用于一些腺病毒相关病毒 (AAV4，AAV5) 的高效实用的，以层析纯化为基础的纯化工艺 也已经开发出来。图11是一个在两步离子交换 (Capto MMC 接着 Capto Q) 基础上的纯化工艺。 评述 随着更多病毒性基因治疗和疫苗产品进入临床后期开发，对 快速并能按比例放大的纯化病毒载体方法的需求日益增加， 这种情况对于腺病毒更是迫切。上述工艺中提到的凝胶介质 可以满足生产中对产品安全，有效和经济等方面的需求。上 述两种工艺流程均与生产高效的膜处理工艺相整合。 11 病毒纯化产品信息 Data File Code No. Q sepharose XL 18-1123-82 Capto Q, S, DEAE 11-0025-76 Capto MMC 11-0035-45 Poster Code No. Rapid adenovirus purification using Q Sepharose XL (virus licensed) 18-1178-07 Further reading (4) Capto MMC Capto Q, S, DEAE 图 10. A. Capto MMC纯化腺相关病毒AAV4 B. Capto Q精细纯化 AAV4 图 11. 纯化 AAV4的工艺流程。 Purified recombinant AAV 4eGFP 去除细胞碎片 超滤 中空纤维膜柱 截留分子量300 kDa 超滤 中空纤维膜柱 截留分子量300 kDa 细胞裂解 深层过滤 捕获 离子交换／凝胶过滤 中度纯化 Capto MMC 精纯 Capto Q 病毒浓缩 病毒捕获 精细纯化 病毒浓缩和制剂 纯化 AAV 病毒收获 12 纯化用于制备动物病毒疫苗的病毒 口蹄疫疾病疫苗 口蹄疫疾病 口蹄疫疾病 (FMD) 是对牲畜群破坏极大的疾病，它的主要临 床症状是引起牲畜发热，并在口腔和鼻腔内，在蹄指的空隙 内和蹄冠的根部形成囊泡。所有的裂蹄动物对口蹄疫都易感， 口蹄疫又具有很强的传染性。口蹄疫的流行在经济上会引起 巨大损失，患有口蹄疫的幼小动物直接死亡，成年动物不产 奶，肉品减少和畜牧产业停滞是造成损失的主要原因。 今天，在家畜疫苗研究方面，能有效控制该病的改进型口蹄 疫疫苗成为研究热点。南美的许多国家都将控制口蹄疫列入 国家或地区性计划，对牲畜实行免疫接种。与其他控制手段， 例如监视和隔离相比，免疫接种是根治该病的重要组成部分。 本文中所举的例子就来自于由阿根廷口蹄疫控制计划所采用 的方法。 纯化策略 在阿根廷，与人用疫苗相比，家畜疫苗一直是低价格疫苗。然 而，随着国家优质牲畜价格的一路攀升，加上更严格的规定 约束，这些举措造成牧民要花更多的钱购买高质量疫苗。尽 管疫苗生产仍然必须选择那些易行且花费相对低廉方法。 南美市场的更多特点是，疫苗生产商往往希望在同一剂疫苗 中能含有一种以上的细菌或病毒疫苗，这将迫使生产商浓缩 其最终的纯化产品。另外政府规定也促使产品质量更统一， 并达到更高的质量要求。在许多生产工艺中，靠膜过滤来澄 清和浓缩样品会有助于达到这个目标。 纯化工艺 在阿根廷，Frenkel系统和地鼠肾细胞 (BHK) 悬浮培养是两个 最常用的疫苗生产方法，而且用聚乙二醇 (PEG) 沉淀和交叉 流过滤是浓缩的两个主要方法。 由于Frenkel是一个陈旧生产方法，该方法包括采用感染的牛 舌下腺上皮细胞为原料，出于对疯牛病的关注，使这个生产 方法主要集中在以BHK细胞的生产工艺上，以便能更安全和 更好地推出更纯的疫苗。图12是采用BHK生产方法获得的粗 制疫苗的一个总的生产和纯化策略。 特别将中空纤维柱用于 口蹄疫疫苗的生产。 13 在浓缩方面，PEG 沉淀是一个非常有效的办法，但是却需要 很多容器空间并花费大量时间。交叉流过滤会更快些，因为 不再需要沉淀将样品澄清，同时由于交叉流过滤装置更小， 所以占用的厂房更少。 用 0.2 m m或者 0.45 m m的微孔滤膜：Lumen E可以达到澄清 目的，平均通量约为20 LMH。也可用大的制备柱，例如规格 为 85和 75的柱。 可用带 Lumen C和E，平均通量约为40 LMH的膜通过交叉流 过滤进行浓缩，由于这种截留分子量为 500 KDa的膜可以允 许不要的，低分子量的蛋白质流出，所以用它可提供更纯的 产品，该工艺同样也很快——取决于每批样品量——只需3- 6小时就能完成该项工作，而用 PEG沉淀通常需要 48小时。 评述 在阿根廷和其它南美国家，类似于本文所述的改进过的生产 方法和纯化方法正逐步提升牲畜疫苗质量，扩大市场。这些 都得益于大规模的生产工艺 (约10 000升批量) 和自动化生 产水平，现在，生产者已经能提供纯度更高，效用更好的牲 畜疫苗，其价格也比人用疫苗低。应当注意的是，口蹄疫疫 苗应当在 3A级的生物安全区内生产。 产品信息 超滤产品信息 货号 UniFlux membrane filteration system 18-1177-25 中空纤维应用集锦 图 12. 用 BHK法生产口蹄疫疫苗的 基本工艺流程步骤。 离心 澄清 浓缩 配制 分装 病毒灭活 细胞培养 14 对下游纯化工艺的杰出见解和技术支持 Fast Trak 生产工艺开发 我们从事解决蛋白质纯化方面的问题已近六十年，我们在该 工作方面的经验是他人无法相提并论的。在这期间我们所积 累的专门知识和实践经验成为为您提供技术支持服务，帮您 解决工艺开发和生产问题的一部分。加上自身的专长，我们 拥有 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 广泛的公司外网和专家服务网，它能为您带来许多 帮助。 Fast Trak 教学 通用电气医疗集团的Fast Trak Education机构向您提供我们对 下游纯化工艺的理解和工作经验，以对您的员工进行培训。 Fast Trak课程对从事下游工艺工作的研究人员，工艺开发人 员和生产人员进行培训并对生产管理提供培训。我们为中试 和生产操作提供手把手的装柱，层析和膜过滤技术，以及工 艺优化和按比例放大方面的培训。在疫苗和载体纯化方面遇 到的特殊问题是我们重点关注的领域。此项课程可在我们的 Fast Trak培训中心进行，或者根据您的需要在您所在处安排 培训课程。 Fast Trak 验证 管理当局要求生产预防性或治疗性疫苗，或者其它病毒产品 的公司必须对所采用的生产工艺进行验证。 Fast Trak验证，将我们提供给医药生产企业的层析层析和膜 过滤纯化系统方面的经验与我们对规程要求相方面的知识结 合在一起，最终形成一系列的服务项目和文件资料，这将有 助于疫苗生产商尽快开始生产并减少验证费用。 用户定制介质 疫苗和载体纯化过程中经常需要根据不同的蛋白质来修改纯 化方法，所以有时还要根据需要对已有的，成型的纯化介质 进行修饰并不奇怪。用户定制介质 [Custom Designed Media (CDM) ] 是通用电气医疗集团研制这种按要求生产产品的一 项服务工作。 我们已经与一些工业用户合作，为大规模纯化生产工艺研发 出CDM介质，它们包含主要的层析技术并且所有研发过程都 有详细文件。例如，大多数已有符合规程的支持文件 (Regulatory Support Files)。 欲获得更多我们对疫苗生产厂商的技术支持服务信息请登陆 网站：www.gehealthcare.com/protein_purification 或者与您当地的通用电气医疗集团销售代表联系。 在欧洲进行的工艺开发和装柱课程。 C hr om at og ra ph y co lu m ns C hr om at og ra ph y m ed ia Pr oc es s de ve lo pm en t M an uf ac tu ri ng Fa st T ra k C hr om at og ra ph y sy st em s M em br an e sy st em s M em br an e de vi ce s M ic ro ca rr ie r m at ric es Re se ar ch 15 通用电气(中国)医疗集团有权在任何时候，在不另行 通知 关于发布提成方案的通知关于xx通知关于成立公司筹建组的通知关于红头文件的使用公开通知关于计发全勤奖的通知 的情况下，不负有任何义务地 改变上述规格和性能，并有权终止该产品的供应。如需要最新信息请与通用电气(中国) 医疗集团在国内的销售代表联系。 网站: http://www.gelifesciences.com.cn 电邮: lifesciences@ge.com 通用电气 (中国) 医疗集团 详情请与通用电气 (中国) 医疗集团各办事处联系： 香港办事处 香港九龙旺角亚皆老街 8号 朗豪坊办公大楼 12楼 电话：(852) 2100 6314 传真：(852) 2100 6338 北京办事处 北京市经济技术开发区 永昌北路 1号 电话：(010) 5806 9689 传真：(010) 6787 1162 邮编：100176 上海办事处 上海市虹桥开发区兴义路 8号 万都中心 2401室 电话：(021) 5257 4650-67337 传真：(021) 5208 1282 邮编：200336 广州办事处 广州市建设六马路 33号 宜安广场 1212室 电话：(020) 8363 3828-67961, 67956 传真：(020) 8363 3291 邮编：510060 成都办事处 成都市新华大道文武路 42号 新时代广场 12层 A-C单元 电话：(028) 8678 2581 传真：(028) 8678 2582 邮编：610017 GE imagination at work 参考文献： 1. Belew, M. et al. Purification of recombinant hepatitia B Surface antigen produced by transformed Chinese hamster ovary (CHO) cell line grown in culture Bioseparation 1, 397-408 (1991). 2. Scale up of a cost-effective and generic purification process for plasmid DNA. Life Science News Vol 16, 16-17, Code No 11-0003-48. 3. Scale-up of a method for highly pure plasmid DNA. Downstream 38. 20-21 (2004). Code No 11-0012-70. 4. Brument, N. et al. A versatile and scalable two-step ion-exchange chromatography process for purification of recombinant adeno- associated virus serotypes-2 and -5. Molecular Therapy 6. 678-686 (2002). 5. Herzer, S. et al. Key issues in the process development of purification procedures for viral vector and plasmid biopharmaceuticals. BioProcessing Journal 4, 67-72 (2005). 6. Pitarresi, T. M. et al. Purification of plasmid DNA on an anion exchange column without the use of RNase to process scale. Molecular Therapy 9, [Supplement 1] 53-54 (2004). 7. Herzer, S. Process design and scale-up of viral vector gene therapy products: New purification challenges. Cell & Gene Therapy 1, 43-48 (2004). 8. Diogo, M. M. et al Studies on the retention of plasmid DNA and Escherichia coli nucleic acids by hydrophobic interaction chromatography. Bioseparation . 10, 211-220 (2001) 9. Ferreira, G. N. Cabral, J. M. and Prazeres, D. M. Purification of supercoiled plasmid DNA using chromatographic processes. J. Mol. Recognit. 11, 250- 251 (1998). 10. Diogo, M. M. et al. Production, purification and analysis of an expemental DNA vaccine against rabies. J. Gen. Med. 3, 577-584 (2001). 11. Jendrek, S. and Ekstrom, D. et al. Development of a production and purification method for type 5 adenovirus. BioProcessing Journal 4, 42-47 (2005). 12. Blanche, F. et al. An improved anion-exchange HPLC method for the detection and purification of adenoviral particles. Gene Ther. 7, 1055-1062 (2000). 13. Purification human influenza virus vaccine - towards a generic strategy. Downstream 37, 20-21 (2004) Code No 11-0008-46. 2007-09-26-BJ