基因定点突变 一,定点突变的目的 把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基. 二,定点突变的原理 通过设计引物,并利用PCR将
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扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了. 三,引物设计原则 引物设计的一般原则不再重复. 突变引物设计的特殊原则: (1)通常引物长度为25~45 bp,我们建议引物长度为30~35 bp.一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12 bp.若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补的引物. (2)如果设定的引物长度为30 bp,接下来需要计算引物的Tm值,看是否达到78℃(GC含量应大于40%). (3)如果Tm值低于78℃,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%). (4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置. (5)最好使用经过纯化的引物. Tm值计算公式:Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5 注:L:引物碱基数;% of GC:引物GC含量. 四,引物设计实例 以GCG→ACG为例: 5'-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3' (1)首先设计30 bp长的上下游引物,并将A (T)设计在引物的中央位置. Primer #1: 5'-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3' Primer #2: 5'-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3' (2)引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.41×40-675/30+81.5).通过计算可以看出其Tm低于78℃,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度. (3)重新调整引物长度. Primer #1: 5'-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3' Primer #2: 5'-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3' 在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物的GC含量为45.7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm为80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了. 五,突变所用聚合酶及Buffer 引物和质粒都准备好后,当然就是做PCR喽,不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,防止引进新的突变. 除了使用基因定点突变试剂盒,如Stratagene和塞百盛的试剂盒,但价格昂贵.可以使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金牌快速taq酶,Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase. 六,如何去掉PCR产物 最简单的
方法
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就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲基化的,所以DpnI酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株. DpnI处理的时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败. 七,如何拿到质粒 直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序,验证突变结果. 八,图示 九,定点突变操作步骤 [A] 诱导突变基因(PCR反应)以待突变的质粒为模板,用设计的引物及Muta-direct 酶进行PCR扩增反应,诱导目的基因突变. 1. 设计点突变引物. [注]参考引物设计指导 2. 准备模板质粒DN A [注]用dam+型菌株(例如DH5α菌株)作为宿主菌.在end+型菌株中常有克隆数低的现象,但是对突变效率没有影响.提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒. 3. [选项]对照反应体系(50μl反应体系) 10×Reaction Buffer 5μl pUC18 control plasmid(10ng/μl,total 20ng) 2μl Control primer mix(20pmol/μl) 2μl dNTP mixture(each 2.5mM) 2μl dH2O 38μl Muta-direct Enzyme 1μl 4. 样品反应体系(50μl反应体系) 10×Reaction Buffer 5μl Sample plasmid(10ng/μl,total 20ng) 2μl Sample primer (F)(10pmol/μl) 1μl Sample primer (R)(10pmol/μl) 1μl dNTP mixture(each 2.5mM) 2μl dH2O 38μl Muta-direct Enzyme 1μl 5. PCR反应条件 [注]按如下参数设置PCR扩增条件. Cycles Temperature Reaction Time 1cycle 95℃ 30sec 15cycle 95℃ 30sec 55℃ 1min 72℃ 1min per plasmid Kb 6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟,然后置于室温(避免反复冻融). [注] 按下列提供的PCR条件进行扩增,控制PCR循环数.注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象. Mutation Cycles 1~2Nucleotide 15cycles 3Nucleotides 18cycles [B] 突变质粒选择 PCR反应结束后使用Mutazyme 酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA. 1. 准备PCR反应产物 2. 加入1μl(10U/μl)Mutazyme 酶37℃温育1小时. [注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme 酶可能发生与样品反应不完全的现象.因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作.如果突变率低,可以适当延长反应时间或增加Mutazyme 酶用量. [C]转化 反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口,当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株,例如DH5α. 1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里,然后放置在冰上30分钟. 2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行. 序列分析 通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变. 为了证实这一结果,我们建议对白色单菌落进行测序分析.
浙公网安备 33021202002483