RNA干扰对烟草NtPPO8基因沉默的效应分析

姚怡帆 代卓毅 江智敏 徐 敏 李芳芳张 希 党 伟 武兆云 丁永乐 杨铁钊

（1河南农业大学烟草学院，450002，河南郑州；2浙江中烟工业有限责任公司，310008，浙江杭州；3中国烟草总公司河南省公司，450002，河南郑州；4陕西中烟工业有限责任公司技术中心，721013，陕西宝鸡）

植物多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化还原酶[1]，有多种功能，能增强植物的抗逆性，也会催化产生深褐色的醌类物质。PPO基因在不同植物中的存在形式有较大的差异，在大部分植物中以多基因家族的形式存在[2]。目前在烟草中利用生物信息学方法从普通烟草基因组中鉴定出10个PPO基因家族成员[3]。近年来，对PPO的研究主要集中在其分布、特性、功能和酶活抑制等方面，对PPO基因的染色体定位、克隆、表达分析及基因转化的研究也屡见报道[4]。目前，关于PPO基因功能的研究主要集中在酶促褐变中的作用。褐变问题一直是很多果蔬收获后贮藏、加工等过程导致质量下降、经济价值降低的一个重要因素。PPO介导的酶促棕色化反应会对烟草等作物的质量造成负面影响[5-7]。在烟叶烘烤过程中，过高的PPO活性会使烟叶变褐，不仅影响烤烟的外观质量，还会影响烟叶内化学物质以及香气成分的含量，进而影响其感官质量[8-9]。烟草多酚氧化酶基因NtPPOE的表达影响了烟叶PPO活性，且烟叶的烘烤特性与PPO活性存在极为密切的联系，烟叶PPO活性与烤后杂色烟叶比例呈显著正相关[10]。降低PPO活性能使其不同程度地显示出不易褐变和耐贮藏的特性[11]。伴随PPO酶活调控范畴的发展，使用分子技术调节PPO的表达已经成为PPO研究的崭新领域[12-13]。基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）技术作为RNA干扰技术的一种手段，是近20年发展起来的、能够快速鉴定基因功能的反向遗传学重要方法之一。烟草脆裂病毒（TRV）是一种双分体、正链RNA病毒，携带目的基因的TRV衍生载体可以稳定迅速地侵染植物，且不产生TRV病毒症状[14]。在VIGS病毒基因组中插入的基因片段与mRNA的转录方向相反时可以获得更高的沉默效率[15]，且用400～500bp基因片段重组的病毒沉默载体侵染植株，沉默效果更显著[16]。VIGS技术可以使携带目标基因片段的TRV侵染植物，导致后续侵入病毒的靶向同源基因降解，达到抑制靶基因病毒侵染的目的[17-20]。刘天波等[13]研究表明，在烟草中利用此方法沉默了马铃薯Y病毒基因，有效防治烟草马铃薯Y病毒病。武明珠等[21]研究表明，在烟草中利用VIGS方法沉默了NtbHLH93基因后发现总甾醇、豆甾醇、胆固醇和β-谷甾醇的含量显著降低。因此推断利用VIGS技术沉默NtPPO8基因会使NtPPO8基因表达量下调，从而导致PPO活性降低。国内外学者关于降低PPO活性方面开展了大量研究，但是目前以VIGS技术来调控PPO表达的研究鲜见报道。本试验以NtPPO8基因为切入点，从10个PPO家族中选取在叶中优势表达的NtPPO8基因。通过试验构建靶向NtPPO8基因片段的烟草脆裂病毒TRV载体，转化农杆菌后处理烟苗，利用RT-qPCR检测NtPPO8基因表达量及PPO活性，评价VIGS处理烟株的效果，旨在建立TRV介导的VIGS体系调控NtPPO8基因，为烟草烘烤与调制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草品种为中烟100和K326，由河南农业大学烟草学院育种实验室提供。根癌农杆菌GV3101、TRV1和TRV2载体均购自上海凯益生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 根据已测定NtPPO8（基因登录号：Ntab0594570）基因的特异性区段，使用Primer 5.0设计特异性引物。引物为VI NtPPO8-XbaI-F：GC TCTAGATGCTCTTGGTTACGTCTTGG，VINtPPO8-BamHI-R：CGGGATCC ACAAGTTTCCAACAGGG TCC。引物序列中的划线部分表示酶切位点。

1.2.2 VIGS载体的构建方法 选取烤烟K326的烟叶1片，经液氮速冻后研磨并提取RNA。按照反转录试剂盒说明方法，26S rRNA为内参基因，上游引物为 5′-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3′，下游引物 5′-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3′为反转录引物，以保存的K326烟草cDNA为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，采用VI NtPPO8-XbaI-F、VI NtPPO8-BamHI-R引物，在高保真酶的作用下扩增基因干扰片段。电泳检测条带单一，为防止目的基因片段中出现杂带，将扩增后的目的片段切胶回收。经过Xba I/Bam HI双酶切基因片段和pTRV2载体，纯化回收基因片段和载体骨架，酶连后转化大肠杆菌，涂布Kana抗性平板，对长出的抗性菌落进行PCR检测目的基因片段，并从中挑取PCR阳性的菌样提取质粒，采用载体上通用引物TRV-CeXu（5′CATTAGCGAC ATCTAAATAGG3′）进行测序。提取测序正确的大肠杆菌质粒，并转化农杆菌GV3101。限制性内切酶消化、大肠杆菌转化等分子生物学实验及农杆菌转化的操作方法参考刘晓彬等[22]的研究。

1.2.3 VIGS病毒发酵液的配制 将携带目标基因的病毒载体pTRV1、pTRV2和pTRV2-NtPPO8质粒的农杆菌菌株分别在带有卡那霉素（浓度为50μg/mL）和利福平（浓度为50μg/mL）的LB培养基中在28℃、180转/min恒温培养24h，调整OD600≈0.6～1.0，将带有载体 pTRV1、pTRV2 和pTRV2-NtPPO8的农杆菌分别等体积混合，将农杆菌菌液转移至50mL塑料离心管中，离心2min，弃上清液，使用侵染缓冲液（NaCl 50mmol/L、MES 50mmol/L、乙酰丁香酮0.1mmol/L）重悬洗涤后的菌体至 OD600≈0.6～1.0。

1.2.4 试验设计 试验地土质为黄壤土，肥力中等，2020年3月15日播种，5月10日移栽，8月24日打顶，其他栽培 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 按照当地优质烟叶生产技术规范进行。在中烟100移栽后50d进行注射接种。设置3个处理，空载体发酵液注射10株（P0）、使用含NtPPO8基因的重组载体发酵液注射10株（P1），并设5株野生型烟株为空白对照（CK）。平均每株烟株菌液接种5mL。每个处理重复3次，共75株。在每个处理中随机选取3株单株分别设为Z1、Z2和Z3。

在接种后10、20、30、40d分别在Z1、Z2、Z3烟株的S1（第8叶位）、S5（第12叶位）、S9（第17叶位）、S13（第22叶位）处进行取样，每次取烟叶样本5g，同时检测NtPPO8基因的表达量以及PPO活性。

1.2.5 测定指标及方法 将待检测的烟叶样本用液氮研磨，提取总RNA，参照Trans Gen Biotech公司Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 反转录成cDNA。再以cDNA为模板，烟草NtPPO8的Real time-PCR检测按照 Quant qRT-PCR kit（S Y B RGreen）（TIANGEN公司）使用说明在Quant Studio Tnl 6 Flex荧光定量PCR仪器（ABI公司）上进行qRT-PCR检测。3个生物学重复，3个技术重复，利用Excel进行统计分析。分析NtPPO8的相对表达量，内参基因为18S。引物如表1。以CK作为对照组，以P0、P1为试验组，NtPPO8基因沉默效率（%）=（对照组基因相对表达量-试验组基因相对表达量）/对照组基因相对表达量×100。沉默PPO活性效率（%）=（对照组PPO活性-试验组PPO活性）/对照组PPO活性×100。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

采用邻苯二酚分光光度法测定烟叶中PPO活性[23]。PPO的提取：称取烟叶样品1.0g于研钵中，加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）少量和磷酸缓冲溶液（pH=6.8）8mL，冰浴下研磨至匀浆，4℃下12 000转/min离心20min，取上清液，待测。PPO的测定：于试管中依次加入邻苯二酚溶液（0.2mol/L）1.5mL和磷酸缓冲溶液（pH=6.8）1.5mL、待测液50μL，参比溶液中不加待测液。420nm波长下测定吸光度，1min后再次测定吸光度。PPO活性以每克烟叶样品中每分钟内A420变化0.01个单位表示，记为ΔOD/(g·min)。

2 结果与分析

2.1 VIGS载体的构建

从烟草基因组数据库中选择1个转录水平响应PPO的NtPPO8基因。使用NCBI Blast和NCBI Primer Blast选择基因的特异性区段作为VIGS载体的靶向区域，并设计用于检测基因相对表达量的qRT-PCR引物。本试验以保存的K326 cDNA为模板，PCR扩增得到412bpNtPPO8基因片段，连接到T载体，再使用BamHI/KpnI酶切后连接到pTRV2，获得pTRV2-NtPPO8表达载体。酶连后转化大肠杆菌，涂布Kana抗性平板，对长出的抗性菌落进行PCR检测目的基因片段（图1），并从中挑取PCR阳性的菌样提取质粒，采用载体上通用引物：TRV-CeXu（5′CATTAGCGACATCTAAATA GG3′）进行测序。图2第1行为TRV2-NtPPO8载体6号克隆测序结果，第2行为参考序列。测序结果（图2）显示TRV2-NtPPO8序列和参考序列一致。

图1 载体构建菌落PCR电泳图Fig.1 Vector construction colonyPCRelectrophoresisdiagram

图2 TRV2-NtPPO8载体测序比对结果Fig.2 Results of TRV2-NtPPO8 vector sequencing vector sequencing comparison

2.2 RNA干扰对烟草NtPPO8基因表达量及酶活性的影响

根据图3a可知，在Z1、Z2、Z3中CK与P1处理差异呈显著，其他均不显著。P1与CK和P0处理相比，P1处理的基因表达量大幅下调。P1处理沉默NtPPO8基因表达量效率最高的植株达78.89%（植株Z2），最低的为76.35%（植株Z1），平均沉默效率为77.90%。P0处理沉默NtPPO8基因表达量最高的植株达14.28%（植株Z2），最低的为3.31%（植株Z3），平均沉默效率为8.51%。在CK和P0处理中，Z3与Z1和Z2有显著差异，其他均不显著。

根据图3b可知，在Z1、Z2、Z3的PPO活性中CK与P1呈极显著差异，其他均不显著。P1处理降低PPO活性的效率最高的植株达59.09%（植株Z3），最低的为55.82%（植株Z1），平均效率为57.35%；P0处理降低PPO活性最高的植株达5.61%（植株Z2），最低的为2.47%（植株Z3），平均效率为4.36%。在Z1、Z2、Z3单株中，CK中的Z1与Z3单株呈显著差异，P0处理中Z1与Z2、Z3呈显著差异，其他均不显著。

图3 不同处理对PPO活性及NtPPO8基因相对表达量的影响Fig.3 The effects of different treatments on PPO activity and NtPPO8 gene expression

2.3 RNA干扰的传导效应分析

根据图4a可知，在叶位S1、S5、S9时，CK与P1相比呈显著差异，在S13叶位时CK与P1处理呈极显著差异，其他均不显著。P1处理沉默NtPPO8基因表达量的效率在S1叶位为78.46%，S5叶位为78.10%，S9叶位为77.37%，S13叶位为68.88%。P0处理沉默NtPPO8基因表达量的效率在S1叶位为4.29%，S5叶位为2.86%，S9叶位为3.89%，S13叶位为3.31%。NtPPO8基因表达量随着接种部位的增加而增加，沉默NtPPO8基因表达量效率都随着接种部位的增加而降低。在P1处理中S13与其他叶位间呈显著差异，其他均不显著。

根据图4b可知，所有叶位的CK与P1均呈极显著性差异，其他均不显著。PPO活性都随着接种叶位的增加而增加。P1处理降低PPO活性的效率在S1叶位为59.09%，S5叶位为54.15%，S9叶位为54.30%，S13叶位为52.36%。P0处理降低PPO活性的效率在S1叶位为2.92%，S5叶位为3.26%，S9叶位为3.79%，S13叶位为1.78%。P1处理中，S1与S13有显著差异，其他处理间均不显著。

图4 表达载体处理不同部位烟草中的PPO活性以及NtPPO8基因的相对表达量Fig.4 PPO activity and NtPPO8 gene expression in different parts of tobacco treated by expression vector

2.4 RNA干扰基因沉默的持续效应分析

根据图5a可知，CK与P1处理呈显著差异，其他均不显著。P1处理沉默NtPPO8基因表达量的效率在10d为78.18%，20d为 78.46%，30d为75.70%，40d为74.46%。P0处理沉默NtPPO8基因表达量的效率在10d为1.57%，20d为4.65%，30d为3.77%，40d为2.91%。NtPPO8基因表达量随着时间的增加而增加，沉默NtPPO8基因表达量效率也随着接种时间的增加而降低。CK、P0和P1处理的NtPPO8基因表达量都在10d时最低，在40d时最高。

根据图5b可知，CK与P1处理相比呈极显著差异，其他均不显著。P1处理降低PPO活性的效率在10d为59.09%，20d为63.25%，30d为53.44%，40d为49.08%。P0处理降低PPO活性的效率在10d为2.63%，20d为2.84%，30d为2.19%，40d为8.09%。PPO活性随着时间的增加先降后增，降低PPO活性的效率随接种时间的增加呈先增后降趋势。总体看来，在接种20d时降低PPO活性的效果最好。

图5 表达载体处理不同时间烟草中的PPO活性及NtPPO8基因的相对表达量Fig.5 PPO activity and NtPPO8 gene expression in tobacco treated with expression vector at different times

3 讨论

褐变问题一直是很多果蔬收获后贮藏、加工等过程导致质量下降和经济价值降低的一个重要因素。烟草中的PPO活性对烟草的调制、烤后烟叶的颜色以及卷烟的加工、贮藏都有重要影响[24]。降低PPO活性能使其不同程度地显示出不易褐变和耐贮藏的特性[11]。调制过程中降低PPO活性能使烟叶难以变褐，烟叶的烘烤特性与PPO活性高低存在极为密切的联系，烟叶PPO活性与烤后杂色烟叶比例呈显著正相关[8]。

本研究结果表明，利用VIGS体系对烟草NtPPO8基因的沉默是有效的，且NtPPO8基因表达量与PPO活性呈正比。当NtPPO8基因表达量下降时，PPO活性也随之下降。李建平等[25]研究表明，含有GhCPK基因的TRV载体对棉花进行侵染后，可使棉花抗黄蒌病基因沉默。陈坤梅等[26]研究表明，含有BSMV基因的TRV载体对小麦进行侵染后，可使小麦抗光氧化基因沉默。这与本试验结果相似，证明了使用VIGS方法接种的同一处理组中全部检测的植株都具有较为理想的VIGS效率，且P1较CK处理也有极显著差异，这表明本方法可以用于大规模基因沉默植物材料的制备。但研究中烟株的PPO活性高低与NtPPO8基因表达量变化并不完全一致，推测是因为烟叶中的PPO活性同时受到复数基因的调控，且每个基因对PPO活性的影响有所差异，导致烟叶的酶活性变化与基因表达量变化不完全一致，要研究烟草不同PPO基因对褐变的贡献率，还需获得沉默单个或多个基因的转化体。

同时，本研究结果表明，VIGS接种后的载体会随着烟株的生长在植物体内运输，实现对植物内源基因的系统性沉默。孙天杰等[27]研究表明，TRV病毒在侵染的细胞内完成组装，并进入韧皮部进行长距离运输，实现系统侵染。王心宇等[28]研究发现，利用VIGS体系，病毒可高效扩散到棉花受体的根、茎和叶等器官，这与本试验结果相似。本研究发现，将携带TRV-NtPPO8载体的农杆菌对烟株进行侵染后，对处理植株不同位置的叶片进行检测，发现接种S1至S13均有较为理想的沉默效果，其中接种S1的沉默效率最高，达到78.46%，在到达S13叶位时，沉默效率为68.88%。证明了病毒载体会随着烟株的生长而向上传导，从而使整株发生系统性侵染。

本研究结果表明，VIGS的沉默效果具有持久性。VIGS有效的沉默期是该技术应用的关键影响因素，VIGS有效的沉默期一般为3周左右，之后将出现基因沉默衰减和表型恢复等现象[29-30]。在马铃薯Y病毒的研究中发现对烟株进行TRV-CP病毒载体的侵染，在45d左右时不同处理烟株中TRV的含量仍能检测出[13]。Senthil等[29]研究发现，VIGS在番茄上有效期可达2年以上。而有报道[29]显示，VIGS的持续时间可延长至3个月。本研究在接种约40d时不同处理烟株的PPO活性的沉默效率仍显著表达，表明构建的VIGS体系能够较长时间稳定表达，且沉默效果还可以持续。根据目前研究发现，VIGS的持续时间不是一个确定的值，因此，猜测VIGS的持久效果受别的因素影响。Rui等[31]研究表明，采用低温和低湿的方法可适当延长基因沉默的时间，在合适的条件下，VIGS的作用能够持续几年甚至一生。因此，VIGS的持久性以及干扰因素还需要进一步探究。

本试验为后续进一步研究病毒长距离运输及植物性状长期观察的试验以及VIGS的持久性及影响因素提供了良好的试验操作体系。并为提高改善烟叶耐烤性及降低烟叶褐变比例提供了新的思路和方法，具有较好的应用前景。

4 结论

利用VIGS载体建立了基于病毒诱导的烟草PPO沉默体系。基于该体系能够有效沉默NtPPO8基因的表达且降低PPO活性。VIGS接种后的载体会随着烟株的生长在植物体内运输，实现对植物内源基因的系统性沉默，且VIGS的沉默效果具有持久性，在40d时仍能有效表达。

-全文完-