吸附剂的活性与相对湿度对薄层色谱的影响

五、吸附剂的活性与相对湿度对薄层色谱的影响 吸附剂的活性一般是指吸附剂的表面特性。活性、吸附剂种类、溶剂系统 和温度等因素一起决定了一个物质的 Rf值。如其他因素不变，活性提高，Rf值 降低，反之 Rf值增大。 吸附剂的活性包括两方面：表面能与表面积。表面能越大，吸附剂与被吸 附物质的相互作用越强。单位重量的表面积（自由表面）即比表面积越大，吸附 剂能力越强。图 1以氧化铝为例说明自由表面与吸附剂活性的关系。强活性的与 弱活性的氧化铝均暴露在相对湿度 60%的环境一定时间后，均达到同样的中等程 度的活性。 “相对湿度”(relative humidity)是指在一定温度下大气中水蒸气饱和的程 度，即： %相对湿度 (r.h.)=绝对湿度 (gH2O/m2 空气) / 饱和湿度 (gH2O/m2 空气) 在封闭系统中，用干燥剂除去一部分水分，绝对湿度降低，从而相对湿度 也降低。但如果提高温度绝对湿度不变，饱和湿度增加，相对湿度降低。图 2说 明绝对湿度、相对湿度与温度的关系。如大气中含水 6g/m³（=绝对湿度），30°C 时相当于 20%r.h.，而在 5°C时，相当于 90% r.h.薄层吸附剂与大气水蒸气的交换 与平衡是由相对湿度而不是绝对湿度控制的。当吸附剂暴露在“潮湿”大气中， 吸附剂与大气水蒸气的水分子达到一定的平衡浓度 Cs，Cs与 r.h.的关系可以通过 等温吸附线表达（图 3）。吸附剂表面吸附的水分是‘物理’的可逆的吸附，可 以在一定的相对湿度下重新达到吸附平衡。而不论在此之前是何种相对湿度的状 态。所以对于亲水性的吸附剂，相对湿度是理想的活性调节剂。了解相对湿度的 作用，首先要知道薄层板的活性在一定的湿度下能保持多久，即“活性转化速 率”的问题。早在 1965年 Dallas已发现标准的硅胶薄层板（0.25mm，20x20cm） 暴露在大气中 3分钟，吸附的水达到最高容量的 50%，5分钟后达到 70%，而大 大降低了活性。八十年代的商品预制板，这种活性转化速率较之六十年代的薄层 板大约低 10~20%，但仍然是不可忽视的问题。 在日常的实践中，当硅胶 G或氧化铝薄层板从干燥器中取出，从点样到在 N-展开箱中展开，薄层的活性主要取决于当时实验室的相对湿度。一般所谓的薄 层色谱重现性差，环境湿度是主要的因素之一。目前在我国，多数实验室还是以 用自制薄层板为主，而且我国地狱地域辽阔，一年中气候变化和差别较大，更是 一个不容忽视的问题。有的实验报告认为薄层板不必活化，也可以得到好的分 离，这在相当干燥的大气下操作是完全可能的，但当相对湿度增大时，层析结果 必然发生改变，首先是 Rf值，其次是分离度，甚至影响到分离的成败。如牛胆汁 的薄层色谱分析，将点样后的薄层板在 32%r.h.下放置 15分钟再在干燥的展开箱 中展开，可以得到较好等分离；但将点样后的薄层板在 80%r.h.大气下放置 15分 钟再展开，结果所有的斑点均挤在大约 Rf值 0.6~0.7的位置形成一个拖尾的变形 的斑点而面目全非（图 4）。另一个相反的例子是由草药 Hamamelis等提取物制 成的“视明露”滴眼剂的醋酸乙酯萃取液的薄层色谱分析，在 72%r.h.下展开比在 低湿度下展开，分离度明显提高（图 5）。 文献中常常提到薄层板放置在大气中一段时间会失去活性，这一说法也不 准确，因为如果放置在非常干燥的自然条件下，薄层板的活性仍然是很高的。而 通常在 110°C活化也只是在干燥自制薄层板时才是有意义的，因为储存在硫酸干 燥器的高活性薄层板，在室温大气下数秒钟或数分钟即被重新调节。同样的原 因，旧薄层板的加热再活化也是意义不大的。甚至一再的加热会导致一部分硅醇 基的不可逆的变化。所以一次制备许多薄层板，备数日乃至猪周临用前活化使用 的做法是不可取的。真正可靠的控制活性的方法是在特别设计的在展开前和展开 中能避免薄层板与大气相互作用的展开箱中展开，如双槽展开箱及 Vairo-KS （TLC or HPTLC）展开箱（这里尚未涉及点样过程中薄层板与大气的接触问 题）。 调节相对湿度最常用的是硫酸溶液。硫酸的浓度、比重与相对湿度的关系 见图 6。配制的方法举例如下： 需要的相对湿度 50% 相当的硫酸浓度 42.6% H2SO4 96.0 42.6 42.6 H2O 0 53.4 即 53.4份水加 42.6份硫酸（W/W）得 42.6%的硫酸：相当 50%相对湿度。 用硫酸溶液时应注意与大容量空气接触时易于被大气中的水分“稀释”； 另外当浓度 85%以上时，酸本身的蒸气压可能会干扰吸收水分的作用。图 6一般 可以满足实验室的需要。 相对湿度也可以用无机盐饱和溶液调节，举例如下： 无机盐 相对湿度% 无机盐 相对湿度% H2PO4 •1/2H2O 9 ZnCl2•1.5H2O 10 K(HCOO) 21.3 K(CH3COO) 22.7 CaCl2•6H2O 32.3 KSCN 47 NaCl 75.7 KCl 85 用无机盐控制湿度应当用过饱和溶液，以保证有过剩的固态无机盐在溶液 中。而且要搅拌均匀，以免溶液的表面被空气中的水分稀释。 一般而言，适宜的相对湿度是随着样品的性质和溶液的极性不同而不同。 就溶液而言，溶剂的极性增大，适宜的 r.h.范围较宽，如用苯作展开剂，适宜的湿 度范围很窄，要求在较低的相对湿度进行；用乙醚，在 20~50%r.h.范围结果重现 良好；如用氯仿 : 异丙醇 : 25%氨水 （45:45:10），在 20~80%r.h.范围可以有好的 重现性。这主要是因为在展开箱中溶剂蒸气有取代吸附在薄层板上的水分子的趋 势，取代的比率取决于溶剂蒸气的极性和蒸气量。非极性溶剂（如苯）取代水分 子的可能性很小，对水很“敏感”，在湿度较高时，溶剂前沿上升到一定高度， 在薄层板面上苯、水“脱混”，引起 Rf值改变，甚至形成“水印”和斑点畸形。 而用亲水性溶剂如（乙醇）时，它们的蒸气容易取代薄层板上原来吸附的水分 子，这种取代的速率决定于溶剂蒸气的浓度。溶剂系统的极性越大，蒸气浓度越 高，取代的越多，原来吸附的水分子的影响越小。因而在一个较宽的湿度范围可 以得到较好的重现性。如果考虑到溶剂对样品的选择性，样品本身的极性，尤其 对湿度敏感的样品，情况要更为复杂。含水的非极性多元溶剂系统在不同温度下 由于含水量的差异，明显地影响分离的效果，在相对湿度不加控制的情况下，重 现性是很查差的。 此外，配制样品溶液的溶剂如果是亲水性的（如甲醇、乙醇、丙酮），点 样时溶液中吸收的水分被遗留在原点上，对整个板面而言，这点水分是微不足道 的，但对这一样品斑点的局部而言，尤其在高湿度环境下，对分离效果将产生不 利的影响。所以点样时同步干燥或后继干燥常常是很需要的。 有机粘合剂对相对湿度的作用也有影响，如图 7。此外，商品硅胶的孔径 有 40，60和 100 Å 三种，以五种染料（dye 1: Ceres violet BRN, 2, fat yellow, 3, Ceres brown BRN, 4, ceres black, 5, Bleu VIF Organol）为样品，在 Vario-KS展开 箱，以苯展开，可以从 Rf值看到不同孔径与相对湿度的关系（图 8）。 以上讨论的是亲水性吸附剂，而且以应用最广的硅胶为主。各种化学键合 相薄层板（反相板，氨基键合相板，腈基键合相板，二醇基键合相板，镜象化学 键合相板等）不在本文讨论范围。