重组酿酒酵母的木糖发酵性能研究

第 28卷第 1期 2008年 2月 林 产 化 学 与 工 业 Chemistry and Industry of Forest Products Vo1．28 No．1 Feb．2008 旦 XU Yong 重组酿酒酵母的木糖发酵性能研究 徐 勇 ，陈 英 ，勇 强 ，黄敏仁 ，余世袁 (1．南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037； 2．南京林业大学 森林资源与环境学院，江苏 南京 210037) 摘 要： 利用聚合酶链式反应(PCR)技术从毕赤树干酵母的基因组中扩增得到木糖还原酶基因 xyl 1和木糖醇脱氢酶基因xyl 2， -fl']分别或同时与高拷 贝型酵母表达载体 YEp 24重组，再经醋酸 锂转化酿酒酵母，得到了3种不同类型的重组酵母菌株 ，其中重组酿酒酵母菌株 NLR04可利用单一 的木糖为碳源进行生长，并能够在微氧或厌氧环境中缓慢发酵木糖生成乙醇，乙醇得率可达到理论得率的 37．0％。该 研究可为微生物的木糖代谢工程提供种质资源。 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 结果表明，与毕赤树干酵母不同，在重组酿酒酵母中木糖还原酶基 因以组成型表达，而木糖醇脱氢酶基因在某种程序上受木糖的诱导。与毕赤树干酵母相比，重组酿酒酵母菌株 中的木糖 醇脱氢酶的比活力明显较低，这说明在 Sc NLR04中该基因的表达存在某些抑制作用，这一缺陷可能是重组酵母菌株发 酵木糖的瓶颈之一。 关键词 ： 木糖发酵；重组酿酒酵母 ；乙醇 中图分类号 ：TQ920．1；Q819 文献标识码：A 文章编号：0253—2417(2008)01—0023—06 Study on Xylose—fermentation Capacity of Recombinant Saccharomyces cerevisiae XU Yong ，CHEN Ying ，YONG Qiang ，HUANG Min—Yell ，YU Shi—yuan (1．College of Chemical Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China； 2．College of Forest Resources and Environment，Naming Forestry University，Nanjing 210037，China) Abstract：In order to establish the xylose—fermentation pathway in Saccharomyces cerevisiae，two key genes for xylose—metaboliz— ing，xylose reductase xyl 1 and xylitol dehydrogenase xyl 2，were amplified from Pichia stipitis by polymerase chain reaction (PCR)technique and cloned into YEp 24，a high—copy expression vector in yeast，respectively and simultaneously，and then they were constructed into S．cerevisiae by transformation using lithium acetate．In three recombinant strains，the recombinant S． cerevisiae NLR04 could grow and ferm ent in media with xylose as sole carbon source while the two genes xyl 1 and xyl 2 were transferred simultaneously into an auxotrophic mutant of S．cerevisiae，and it showed an ineffective capacity of ferm enting xylose to ethanol under trace oxygen or anaerobic conditions and its ethanol yield could reach 37．0％ of the theoretical value．These recombinant yeast strains enriched the strains library for the xylose—metabolic engineering．Detective results confirm that there was some difference between P．stipitis and the recombinant S．cerevisiae NLR04 in the gene xyl 1 and the gene 2 expression mechanism，the gene xyl 1 is constitutely expressed in the latter but xylose—inducible in the former．However，the gene xyl 2 is reversed as it is constitutely expressed in the form er but xylose—inducible to some extent．On the xylitol—dehydrogenase relative enzyme activity，the recombinant S．cerevisiae NLR04 is markedly lower than stiptis。which maybe the one of bottlenecks for xylose—utilization in recombinant strains． Key words：xylose—ferm entation；recombinant Saccharomyces cerevisiae；ethanol 植物纤维质资源生物转化制取燃料乙醇是当前全球研究的热点，其中己糖、戊糖的同步乙醇发酵是 关键的技术难点之一 。在乙醇发酵工业中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有厌氧、耗糖快、耐 收稿日期：2006—12—12 基金项目：江苏省高技术计划项 目(BG2005327)；江苏省高校自然科学重大基础研究项 目(06KJA22015)； 国家973计划(2007CB70801) 作者简介：徐 勇(1971一)，男，湖北安陆人，副教授，博士，从事林产生物化工研究。 维普资讯 http://www.cqvip.com 林 产 化 学 与 工 业 第 28卷 抑制物强、耐高糖、耐乙醇和代谢副产物少等优良性能，一直是乙醇生产中应用最广泛的菌种，但它不具 备木糖代谢能力。研究表明，酿酒酵母不能发酵或利用木糖的根本原因在于缺乏转化木糖生成木酮糖 的相关代谢途径，即缺乏编译木糖还原酶(XR)的基因 1和木糖醇脱氢酶(XDH)的基因 yf 2 L3 。 与之相比，毕赤树干酵母(Pichia stipits)和休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)被公认为是目前木糖乙醇 发酵的优良天然酵母菌种，且前者的木糖发酵性能更为优越。但是，与酿酒酵母相比它们在工业发酵上 的不足也十分明显 。因此，选择酿酒酵母为宿主菌株，将毕赤树干酵母等菌株的木糖代谢关键酶 基因转入酿酒酵母，实现两者优良遗传性能的组合，并最终构建出性能适宜的己糖、戊糖同步厌氧乙醇 发酵重组酵母菌株一直是研发的热点 J。依据上述理论，人们已经开展了相应的基因重组研究，并获 得了一些不同类型的重组菌株，但生产性能均不理想，大部分重组菌发酵木糖的乙醇得率低，一般均需 要以葡萄糖为其辅助碳源，也不能在厌氧条件下发酵木糖。作者通过转基因技术，克隆毕赤树干酵母的 木糖还原酶基因训 1和木糖醇脱氢酶基因 2，构建出含有 1和 2的系列表达载体，并转入营 养缺陷型酿酒酵母 ，筛选获得不同类型的木糖乙醇发酵重组酵母菌株，在此基础上开展了重组菌株木糖 厌氧发酵能力研究，期望能够为微生物的木糖代谢工程和植物纤维资源生物转化制取燃料乙醇的研究 提供种质资源和理论基础。 1 材料与方法 1．1 菌株和质粒 大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a(supE44 AlaeU169( 80 lacZM15)hdsR17 recA A1 endA1 gyrA96 thi一1 relA1)，毕赤树干酵母和休哈塔假丝酵母(野生型，南京林业大学保存)，酿酒酵母(Mata，ura3， trpl，中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC 1917)。质粒 YEp24(URA3，Ap ，Tc ，ATCC 37051)， pGEMR_T Easy Vector(Ap ，Promega公司)，pDM302一FU(Ap ，南京林业大学)。 1．2 毕赤树干酵母的培养和基因组 DNA提取 从平板上挑取酵母菌单菌落，接入到 50 mL酵母膏胨葡萄糖 (YPD)培养基，在 30℃ 条件下， 150 r／rain振荡培养至对数生长中期。采用玻砂破菌法提取酵母的基因组 DNA ，以Triton裂解混合液 破菌，提取的基因组 DNA于 一20℃保存。 1．3 PCR扩增 X1和X2序列和 DNA序列测定 由GeneBank检索得到 P．stipitis基因组 DNA中xyl 1(gi 3260，2 052 bp)和xyl 2(gi 3262，1 963 bp)的全序列，采用 Oligo软件设计得聚合酶链式反应(PCR)扩增的引物对。其中， 1的扩增引物对 为5'-GATCCACAGACACTAATrGGT一3 和5'-TrCACGGGCAAGAGAAGAATG一3 ； 2的扩增引物对为 5，_TCGTCCCTATGTCGTATGTTT一3 和 5"AACGGTCTGGGGGTAAACTFG-3 。 采用 Mastercycler gradient 5331扩增仪(Eppendorf Germany)进行 PCR扩增反应。PCR扩增体系为 50 L，其中酵母基因组 DNA约 100 ng，引物的浓度均为0．25 I．~mol／L，0．5 mmol／L dNTP，1×PCR缓冲 液，2 U Tap酶(TaKaRa)，2．5 mmol／LMgC12。PCR扩增反应程序：94 oC变性60 s，53℃ 退火 30 s，72℃ 延伸90 s，循环 2轮；94℃变性 60 s，55℃退火 30 s，72℃ 延伸 120 s，共循环28轮；4 oC保存。 DNA测序由上海博亚生物技术有限公司完成，采用 T载体测序法在 ABI3730型测序仪 (ABI Company，USA)上完成。 1．4 重组菌株的构建 采用 CaC1 法转化大肠杆菌，以十二烷基硫酸钠(SDS)碱裂解法提取质粒，限制性内切酶、连接酶 和质粒提取试剂盒均由Promega公司提供。采用醋酸锂法转化酿酒酵母，以相应的营养缺陷型 sc—x 培养基平板筛选重组酵母菌株，酵母的质粒提取采用玻砂破菌法 。 1．5 重组酿酒酵母的兼气发酵和微氧(厌氧)发酵 在 100 mL无菌三角瓶中，加入适量营养缺陷型 SC-ura培养基，接种后以棉花塞封口为兼气发酵； 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 徐 勇，等：重组酿酒酵母的木糖发酵性能研究 接种后以无菌橡皮塞塞紧瓶 口，尽量使培养基能够充满瓶体积以驱氧，并在橡皮塞上穿刺 1枚孔径 0，5 mm的无菌针头以排放在发酵过程中生成的气体，此为微供氧或厌氧发酵。发酵实验均在 3O℃ 条 件下 8O r／min振荡培养 ，定期以无菌吸量管或注射器从摇瓶中吸取 3 mL发酵液进行分析。 1，6 酵母菌的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的活力测定 在兼气发酵条件培养各种酵母菌株得培养液，取5 mL培养液在4 000 r／min和4℃ 条件下离心发 酵液5 min后得细胞，以 1 mL 0，1 mol／L磷酸钠缓冲液 (pH值 7．0)重悬并洗涤细胞，然后以 1 mL 0．1 mol／L磷酸钠破菌液(pH值 7．0)重悬细胞沉淀物，采用玻砂法在冰浴中破菌，13 000 r／min离心 5 min后取上清液即得胞内酶提取液，转入 一7O℃ 保存。 木糖还原酶(EC 1．1．1，21，XR)以每分钟氧化 1 la,mol NAD(P)H所对应的酶量定义为 1 U；木糖醇 脱氢酶活力(EC 1，1，1．14，XDH)以每分钟氧化 1 la,mol NAD(P)H所对应的酶量定义为 1 U 。采用 Bradford法(Coomassie brilliant blue，Sigma USA)测定蛋白质的浓度。 1．7 发酵液的分析与测定 酵母细胞的浓度以浊度法表示。采用高效液相色谱法分析发酵液的组成。高效液相色谱仪 Waters HPLC 246一E，色谱柱 Aminex HPX一87H(Bio—Rad Labs，USA)，采用折光示差检测器检测。进样量 3～ 5 L，柱温55℃，流动相5 mmol／L H2SO ，洗脱流速0．6 mL／min。 2 结果与分析 2．1 xyl 1和xyl 2的序列扩增与分析 采用本研究中的 PCR扩增引物对可以分别扩增出的长度为 1 970 bp的 1片段和长度为 1 908 bp的 2片段。由图1可 见，采用本研究的引物进行 PCR扩增的产物特异性高 ，可分别获 得序列长度约 2 000和 1 900 bp的片段，与预期的 1和 训 2 片段长度一致。分别将上述的 1和 2扩增产物转入 T载 体，采用质粒测序法分别测定 T—x1和 T—x2的序列，拼接得 1的序列长度为 1 977 bp， 2的序列长度为 1 910 bp。两者 分别与报道的P．stipitis的 yf 1(gi 3260)和xyl 2(gi 3262)序列 进行 BLASTn(序列相似性搜索)的结果表明， 1的相似性系 数达到98％，包含 P．stipitis的木糖还原酶基因的 1 969 bp片 段，即获得了该酶基因 1的全长序列； 2的相似性系数达 1 500 bp 2 000bp 3 000 bp M．核酸 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 物 100 bp DNA ladder marker 100 bp； 1．x t 1；2．x l 2 到99％，包含了 P．stipitis木糖醇脱氢酶基因的 1 908 bp片段。图1 X1和X2的PCR扩增产物电泳图谱 分析拼接后的 1和 2的序列可知，二者均含有了在酿酒酵 Fig·1 Electrophoretogram of PCR prod- 母转录和翻译所必要的启动子和终止子 ，即它们具有了在酿 ucts 0f genes xyl 1 and xyl 2 from 酒酵母细胞中转录的必要结构。 tipitis 2．2 重组酿酒酵母菌株的构建 将上述 1和 2产物分别或同时克隆至酵母表达载体 YEp 24可以得到不同类型的表达质粒 YEp 24一X1、YEp 24一X2和 YEp 24-X1X2，它们分别含有 1、 2和 1一 2序列(如图 2所示)。 再将上述表达质粒转入 E．coli DH5a进行增殖后分别提取各重组表达载体，再采用醋酸锂转化法将它 们转入S．cerevisiae，在含葡萄糖的无尿嘧啶合成培养基 SC—ura。平板上通过尿嘧啶营养互补标记筛选 出不同类型的重组子单菌落，经 PCR检测 目标基因后可分别得到重组酿酒酵母菌株 NLR01、NLR02、 NLR03和 NLR04。 采用不同的营养缺陷型培养基对各酵母菌株进行液体培养，培养结果如表 1所示。与宿主酵母菌 株相同，重组菌株 NLR01、NLR02和 NLR03都不能在木糖培养基中生长，但 NLR03和 NLR04都能够利 用木糖醇生长，NLR04还能够在仅含有木糖单一碳源的培养基中生长，该代谢特征与各重组酵母菌株 维普资讯 http://www.cqvip.com 林 产 化 学 与 工 业 第 28卷 的基因型相吻合，这表明被转入的目的基因xyl 1或xyl 2都能够在酿酒酵母中正确地表达，使其具备了 代谢木糖醇或木糖的能力。 0丌 rop T Sphl 图2 3种重组表达载体质粒的结构图 Fig．2 Gene structures of three recombinant expression vectors of genes xyl 1 and xyl 2 表 1 重组酵母菌株的碳源利用性能比较 Table 1 Comparison of the growth of different rec0nIb．mant strains on varied med ia NA 1)SC—ura。含葡萄糖的无尿嘧啶合成培养基 glucose—synthetic medium without uracil；SC．ura 含木糖的无尿嘧啶合成基 xylose．synthetic medium without uracil；SC-ura 含木糖醇的无尿嘧啶合成基 xylitol synthetic medium without uracil；SC—trp。含葡萄糖的无色氨酸合成培养 基 glueo~-synthetic medium without tryptophan；SC—lira—trp。含葡萄糖的无尿嘧啶和色氨酸合成培养基 glucose—synthetic medium without uracil or tryptophan；“+”表示能够生长 growth；“一”表示不能够生长 no—growth I 一 。 较弱，生长 11 d后仅能够消耗约 2．4 g／L木糖，生成 发酵时恻F 协“ “ 0．50 g／L木糖醇和0．40 g／L乙醇，对应的得率分别达 一u一不话xy ；一△一pH但P 山e； 到0．21和 0．17 g／g,其中乙醇得率达到理论得率的 一。一乙醇 h “。 ；一▲一oD；一。一 木糖醇xy i 37．0％。分析其原因，可能是由于微供氧条件不足以 图3 重组酿酒酵母NLR04兼气发酵木糖 维持酿酒酵母细胞内木糖代谢途径所需要的氧化还 Fig·3 Oxygen-limited fermentation of xylose by 原电势，导致木糖的发酵受阻。 r~ombinant cerevisiae NLRo4 2．4 xyl 1基因的xyl 2基因在重组酿酒酵母中的表达 由表2可见，毕赤树干酵母的木糖还原酶基因训 1和木糖醇脱氢酶基因 2均可以在重组酿酒 酵母中表达生成相应的酶组分。但不同之处在于， 1基因在毕赤树干酵母和休哈塔假丝酵母中受木 糖的专一性诱导，而在重组酿酒酵母中却为组成型表达，不需要木糖的诱导；在 3种酵母菌株中， 2 基因在葡萄糖和木糖碳源中均能够表达生成 XDH，可能属于组成型表达，但它在重组酿酒酵母中的表 达强度受到碳源种类的影响明显。该实验结果与文献相符 引。 与毕赤树干酵母和休哈塔假丝酵母相比，重组酵母菌株 NLR04的XDH酶活力明显降低，这表明， 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 徐 勇，等：重组酿酒酵母的木糖发酵性能研究 27 在 NLR04中xyl 2基因表达存在某些抑制作用，这一缺陷可能是形成重组酵母菌株 NLR04木糖发酵的 瓶颈之一 ， 。 表2 不同酵母菌株的相对酶活力对照表 Table 2 Comparison of relative enzymatic activity of XR and XDH in various yeast strains 1)YPG含葡萄糖的酵母膏胨培养基 yeast peptone glucose medium；YPX含木糖的酵母膏胨培养基 yeast peptone xylose medium；SC。含葡萄 糖的合成培养基 glusoce．synthetic medium；SC．ura。含葡萄糖的无尿嘧啶合成培养基 glucose．synthetic medium without uracil；SC_ura 含木糖 的无尿嘧啶合成基 xylose—synthetic medium without uracil；2)NADPH—XR依赖型木糖还原酶 NADPH—dependent xylose reductase；NADH- XR依赖型木糖还原酶NADH—dependent xylose reductase；NAD 一XDH依赖型木糖醇脱氢酶 NAD 一dependent xylitol dehydrogenase 3 讨 论 迄今为止，所有重组菌株发酵木糖产乙醇的生产性能都未达到工业化生产的要求，即木糖的发酵一 般需要提供葡萄糖作为辅助碳源，也不能在厌氧条件下进行发酵，并且发酵戊糖生成乙醇的产量和得率 较低。目前，普遍认为制约重组酵母菌株木糖发酵的主要因素集中在以下3个方面 ：1)酿酒酵母本 身磷酸戊糖途径的局限性。与木糖代谢的野生菌株相比，重组菌的转醛酶和转酮酶活力太低 ，导致木糖 经磷酸化进入糖酵解受阻，使木糖更倾向于流向氧化代谢。这种观点已经不断地被后续研究所证实。 2)“氧化还原电势失衡”学说。毕赤树干酵母木糖还原酶具有的 NADPH依赖的偏好性，因此木糖醇脱 氢步骤生成的NADH只有部分或不能作为 XR的辅酶用于催化木糖还原生成木糖醇，剩余的 NADH必 须通过呼吸链氧化以维持细胞的氧化还原电势平衡 ，这样必然造成细胞内的氧化还原电势失衡。3)酿 酒酵母菌木糖跨膜转运制约。 为了提高重组酵母菌株的木糖发酵能力，根据上述理论对重组酵母菌株进一步开展了一些相关的 研究工作，主要从以下几个方面人手：加强酿酒酵母木酮糖激酶基因 XKS1，转入转醛酶基因 XAL和转 酮酶基因TKL，采用高表达的质粒载体以提高木糖代谢酶基因的表达水平和强化重组菌的木糖跨膜转 运能力，但是目前所获得的重组酵母菌株的木糖厌氧乙醇发酵性能仍然很不理想，主要表现在木糖利用 速率慢，代谢副产物多和乙醇产量低 ' J，木糖发酵重组酵母菌株的研究仍然存在着许多关键的技术 问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 有待突破。 通过上述大量的基础研究，人们已经逐渐取得了共识，即必须从细胞整体水平来考察酵母菌的木糖 代谢流和代谢调控网络，而不仅仅只关注少数几个关键酶基因，换言之要开展微生物木糖代谢工程和调 控机理的系统研究 ’H ，其基础工作之一就是要构建出不同类型的木糖代谢重组酵母菌株以提供研究 的种质资源。 目前，随着分子生物技术及其相关学科的飞速发展，基因重组技术 日臻完善，如生物信息学、基因删 除、干扰 RNA等新技术的引入，为微生物木糖代谢工程的研究提供了良好的技术保障和理论支持，也必 将有力地推动植物纤维原料生物转化制取乙醇研究的发展。 4 结 论 利用聚合酶链式反应(PCR)技术从毕赤树干酵母的基因组中扩增得到木糖还原酶基因xyl 1和木 糖醇脱氢酶基因xyl 2可以在酿酒酵母中有效表达，表现出相应的木糖还原糖和木糖醇脱氢酶活力。含 维普资讯 http://www.cqvip.com 林 产 化 学 与 工 业 第 28卷 有训 1和xyl 2的重组酿酒酵母菌株 NLR04可在兼气和厌氧条件下利用单一的木糖为碳源进行生长， 并且在微氧或厌氧环境中可缓慢发酵木糖生成乙醇，乙醇的得率可达到理论得率的37．0％。该研究可 为微生物的木糖代谢工程提供种质资源。 参考文献： [1]ARTHUR J R，CHARLOTI~K W，BRIAN H D，et a1．The pathway forward for biofuels and biomaterials[J]．Sci，2006，311：484．489． [2]ZALDIVAR J，NIELSEN J，OISSON J．Fuel ethanol production from lignocellulose：a challenge for metabolic engineering and process integra— tion[J]．Appl Microb Biotechnol，2001，56：17-34． [3]PETYER K，RENE A，CORNELIS P，et a1．Isolation and characterization ofthe P．stipitis xylitol dehydrogenase gene，XYL2，and construc— tion of a xylose·utilizing S．cerevisiae transformant[J]．Curr Genet，1990，18：493—500． [4]SHINYA T，NORIYUKI N，MANEE T，et a1．Isolation of xylose reductase gene of P．stipitis and its expression in S．cerevisiae[J]．Appl Biochem Biotech，1991，28／29：327-340． [5]SLINIGER P J，BOTHAST R J，OKOS M R，et a1．Comparative evaluation of ethanol production by xylose·fermenting yeasts presented higIl xylose concentration[J]．Biotechnol Lett，1985，7：431-436． [6]DUPREEZ 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关于社区教育工作总结关于年中工作总结关于校园安全工作总结关于校园安全工作总结关于意识形态工作总结 座谈会，宋湛谦 理事长作了2007年工作总结，宋永芳秘书长传达了全国林学会秘书长会议文件，在宁10多位理事和顾 问参加了会议。 (中国林学会林化分会) 维普资讯 http://www.cqvip.com