9种大孔树脂对萝卜硫素柱层析分离研

9种大孔树脂对萝卜硫素柱层析分离研 云南农业大学学报（自然科学），2016，31（1）：173－177JournalofYunnanAgriculturalUniversity（NaturalScience）DOI：10.16211/j.issn.1004－390X（n）.2016.01.027 http：//xb.ynau.edu.cnE-mail：xb@ynau.edu.cn 9种大孔树脂对萝卜硫素柱层析分离研究* 1 谢述琼，何 珺 2＊＊ （1.贵州理工学院，贵州贵阳550003；2.贵州省生化工程中心，贵州贵阳550025） 摘要：萝卜硫素是天然抗癌活性物质，具有较好的应用前景。本试验研究了9种大孔树脂对西兰花种子提取液中萝卜硫素的柱层析分离效果。首先，采用9种大孔树脂对西兰花种子提取液中萝卜硫素进行静态吸附率及解吸率进行考察，然后再对静态吸附率及解吸率较高的3种树脂进行回收率、纯度以及成本的对比考察，确定选用的树脂类型，最后对确定选用树脂的动态参数进行优选。结果表明：9种大孔树脂中具有较高的静8，SP825和SP850树脂；经过对比考察，确定采用AB-8大孔树脂对萝卜硫素进行柱态吸附率及解吸率是AB-层析，得到的动态参数为：树脂最大吸附量为20.07mg/g；2BV30%乙醇洗杂，4BV50%乙醇洗脱；树脂柱8大孔树脂，不仅效果好而且成本低，适合工最佳径高比为1∶8。因此，萝卜硫素初提物的分离可以采用AB-业生产应用。 关键词：大孔树脂；萝卜硫素；分离效果中图分类号：K284.2 文献标志码：A 文章编号：1004－390X（2016）01－0173－05 ＲesearchonColumnChromatographySeparationof SulforaphanewithNineKindsofMacroporousＲesins XIEShuqiong1，HEJun2 （1.GuizhouInstituteofTechnology，Guiyang550003，China； 2.ＲesearchCenterofBiochemistryEngineeringofGuizhouProvince，Guiyang550025，China） Abstract：Sulforaphaneisakindofnaturalanticanceractivesubstancesandhasgoodapplicationprospect．Westudiedthechromatographyseparationwithninekindsofmacroporousresinsforsulfora-phaneofbroccoliseedsextract．Firstly，thestaticadsorptionanddesorptionrateofsulforaphaneofbroccoliseedsextractwithninekindsofmacroporousresinswereinvestigated，andthentherecoveryrate，purityandcostwiththeselectedthreekindsofresinswereexamined．Finally，thebestdynamicparameterofselectedresinwasselected．TheresultsshowedthatAB-8andSP825，SP850resinshadhigherstaticadsorptionanddesorptionrateofninekindsofmactoporousresins．Throughthecontrast，AB-8resinforcolumnchromatographyofsulforaphanewereselected，theparameterswereasfollows：themaximumadsorptionquantityis20.07mg/g；2BV30%ethanoltowash，4BV50%ethanoltoe-lute；bestdiameterratioofresincolumnis1∶8．Therefore，separationofsulforaphanecanuseAB-8resin，whichnotonlyhasthegoodeffectbutalsolowcost，itissuitableforindustrialproduction．Keywords：macroporousresin；sulforaphane；separationeffect． 收稿日期：2014－07－21修回日期：2015－03－13网络出版时间：2016－01－1515：05*基金项目：贵阳市乌当区科学技术计划项目（2012051）。 作者简介：谢述琼（1988—），女，四川德阳人，硕士，讲师，主要从事天然产物研究与新药开发研究。 E-mail：752461628@qq.com ＊＊通信作者Correspondingauthor：何珺（1974—），女，贵州湄潭人，硕士，副教授，主要从事天然产物活性成分分 mail：hejun1016@163.com离提取及分析测试研究。E-网络出版地址：http：//www．cnki．net/kcms/detail/53．1044．S．20160115．1505．028．html 174云南农业大学学报 1.21.2.1 试验方法 第31卷 流行病学研究表明：多食蔬菜和水果可阻止 ［1］ 或减慢癌症和心血管疾病的发生，在众多含有抗癌活性成分的蔬菜中，十字花科蔬菜防癌、抗 ［2］ 癌能力最强，经常食用十字花科蔬菜，可以显 ［3］［4］［5］ 著降低患胰腺癌、肺癌、结肠癌和前列腺［6］ 癌的概率。十字花科蔬菜（洋白菜、花茎甘 西兰花种子中萝卜硫素提取液的制备 精确称取西兰花种子100g，粉碎至30～60目后，加水200mL，在35℃下酶解8h，加入无水乙醇800mL，超声浸提60min，采用定性滤纸过滤，滤出物为萝卜硫素的初提物。将滤液在30℃条件下真空浓缩蒸发乙醇，抽滤至清亮备用。 蓝、球茎甘蓝青花椰菜、芥蓝、莴苣、白萝卜和高丽菜等）富含多种芥子苷（glucosinolate，GLs），其中，葡萄糖莱菔子苷经黑芥子硫酸苷酶酶解（myrosinase）或酸水解后，产生的萝卜硫素（sulforaphen，SF）是迄今为止蔬菜中发现的最强的抗癌活性成分，其分离纯化方法对萝卜硫素的进一步研究具有很大影响。已有研究采用溶剂萃取、制备型HPLC，硅胶柱或者凝胶柱等来分离萝卜硫素 ［1，7－9］ 1.2.2 萝卜硫素静态吸附率和解吸率考察 分别准确称量2.0g9种不同类型大孔吸附树 脂置于具塞锥形瓶中，各加入50mL1.2.1节制得的滤液样品，置于24℃恒温震荡床吸附24h，过滤，后取3mL样液过微孔滤膜，用HPLC检测其中萝卜硫素的含量。将过滤留下来的树脂用大量水洗后，转移至具塞锥形瓶中，加入70%乙醇溶液50mL，置于24℃恒温震荡床解吸24h，过滤后取3mL样液过微孔滤膜后用HPLC检测其萝卜硫素的含量。各树脂重复5次试验，所得数据用于计算各树脂的静态吸附率及解析率平均值，计算公式分别为 吸附率=［（饱和吸附量（mg/g）量（mg）］/初始量（mg）×100%； ×树脂质 ，这些方法虽有效，但成本太高， 只适合实验室小批量研究，不适合工业大生产。本研究以西兰花种子提取物为原料，研究了初提物中萝卜硫素在9种大孔树脂中的分离效果，初步探明几种大孔树脂对其吸附率以及解析率；本8对萝卜硫素的分析效果试验经过对比发现AB-8树脂较SP850更好而且成本更低，因此对AB-的动态参数进行进一步的探索。11.1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法试验材料 解吸率=［（解吸液浓度（mg/mL）×解吸 液体积（mL）］/［（饱和吸附量（mg/g）×树脂质量（mg）］×100%。1.2.3AB-8和SP825，SP850树脂对比试验 将按照1.2.1节制得的萝卜硫素提取液的样8，SP825品分成3份，每份89mL，分别用AB-和SP850大孔树脂柱层析，50%乙醇400mL洗脱大孔树脂层析柱上的萝卜硫素，收集洗脱液，为 萝卜硫素粗品，分别记录其体积，并采用用HPLC检测其中萝卜硫素的含量，计算其回收率。 生产商producers 试验所采用的9种大孔树脂见表1；试材为西兰花种子，购自上海奇瑞种业有限公司；试药4441，纯度≥90%，包括：萝卜硫素对照品（S-购自Sigma公司）、乙醇（AＲ，天津科密欧化学试剂厂）、纯化水（贵州省生化工程中心制备）。 表1 Tab.1 编号No．123456789 大孔吸附树脂macroporousresinsAB-8ADS-17BS-75D-101DM-130HPD417HPD5000SP825SP850 9种大孔树脂 Ninekindsofmacroporousresin 将余下的萝卜硫素粗品在35℃条件下真空浓缩至 浸膏，称取浸膏5mg左右，并溶于10mL甲醇，用HPLC检测其中萝卜硫素的含量，按以下公式进行计算：初始量（mg）样体积（mL）； =上样浓度（mg/mL） ×上 沧州宝恩化工有限公司天津市海光化工有限公司蚌埠市辽源新材料有限公司南开大学化工厂 安徽三星树脂科技有限公司河北沧州宝恩化工有限公司西安蓝深公司 北京慧德易科技有限责任公司北京慧德易科技有限责任公司 饱和吸附量（mg/g）=｛初始量（mg）－［（吸附后浓度（mg/mL）×吸附后体积（mL）］｝/树脂质量（mg）。根据5次重复试验的数据计算其纯度，按以下公式计算： 萝卜硫素纯度（%） =［C标（mg/mL） × 第1期谢述琼，等：9种大孔树脂对萝卜硫素柱层析分离研究175 A样×90%×10（mL）］/（A标×M浸膏）。1.2.41.2.4.1 AB-8树脂动态参数的考察 泄露曲线的考察 取200mL萝卜硫素质量浓度为0.505mg/mL 30%乙醇（2BV）和50%乙醇（4BV）以3mL/min的流速洗脱，分别测每1BV洗脱液中萝卜硫素的含量。试验重复5次并计算其平均值。1.4色谱条件 色谱柱：HypersilC18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；流速：0.8mL/min；检测器： ［10］ 紫外检测仪；波长：201nm；灵敏度：0.04AUFS；柱温：35℃；进样体积：10μL；流动相：甲醇—水（20∶80）。1.5 对照品溶液制备 4441，纯度≥准确称取萝卜硫素对照品（S-90%，购自sigma公司）5mg于25mL量瓶中，加入甲醇超声溶解，并定容至刻度，备用。 1.6数据统计与分析方法 进行5次重复试验得到相关数据，将得到的数据采用方差分析确定数据是否有效，然后计算每组数据的平均数，最后在Excel表格中通过制作图表来分析结果。22.1 结果与分析 的萝卜硫素提取液上柱，以3mL/min的流速每10mL收集一份流出液，共收集12份。分别测定各单体萝卜硫素的含量。试验重复5次，计算所得数据的平均值，并作泄露曲线。1.2.4.2 溶剂洗脱浓度的考察 8树脂装柱，将100g西兰花种子预处理AB-按照1.2.1节方法制得的萝卜硫素提取液上柱， 预吸附1h后，依次用水（3BV），10%，30%， 50%，70%，95%乙醇溶液（各3BV），以3mL/min流速洗脱，分别测不同乙醇浓度洗脱液中萝卜硫素的含量。试验重复5次并计算其平均值。1.2.4.3溶剂洗脱量的考察 8树脂装柱，将100g西兰花种子预处理AB-按照1.2.1节方法制得的萝卜硫素提取液上柱，预吸附1h后，依次用水（2BV）、30%乙醇溶液 （2BV）和50%乙醇溶液（4BV），以3mL/min流速洗脱，分别测每1BV洗脱液中萝卜硫素含量并计算总含量。试验重复5次并计算其平均值。1.2.4.4 径高比的考察 装3根等规格的树脂柱，径高比分别为1∶4，1∶6和1∶8，将按照1.2.1节方法制得的萝卜硫素提取液分别以相同量上柱，然后依次用水（2BV）、 表2 Tab.2树脂类型resintypeADS-17BS-75D101HPD417DM130HPD5000AB-8SP825SP850 萝卜硫素静态吸附率和解吸率考察 8，SP825和SP850树由表2可以看出：AB-脂具有较高的静态吸附率及解吸率，且三者的饱 和吸附量、静态吸附率以及解析率较接近，因此， 对这3种树脂做回收率、纯度以及价格的对比考察。 9种大孔树脂对西兰花种子中萝卜硫素静态吸附率及解吸率 静态吸附率/%adsorptionrate 21.7329.5529.5138.2943.8944.7878.9776.8081.76 70%乙醇静态解吸率/%70%ethanolstaticdesorptionrate 42.8266.1858.6471.5478.1176.2979.2484.7283.63 Thestaticadsorptionanddesorptionrateofninekindsofmacroporousresinswithsulforaphaneinbroccoliseeds －1 饱和吸附量/（mg·g） adsorption7.6710.4410.3913.4815.3615.7120.7821.1322.27 2.2 AB-8和SP825、SP850树脂对比实验 8树脂的回收率、对西兰由表3可看出：AB-SP850树脂高。但是，SP825，SP850树脂的价格 8树脂的6倍，所以选择AB-8大孔树脂来是AB-分离萝卜硫素较好。 花种子提取物中萝卜硫素的纯化程度均较SP825， 176 表3 Tab.3树脂类型theresintypeAB-8SP825SP850 云南农业大学学报 3种大孔树脂对西兰花种子中萝卜硫素的回收率和纯度 上柱后含量/mgcontentaftercolumn 136.52124.53122.88 回收率/%recovery93.2483.3784.41 纯度/%purity40.8526.5129.75 第31卷 Therecoveryrateandpurityofthreekindsofmacroporousresinswithsulforaphaneinbroccoliseeds 上柱前含量/mgcontentbeforecolumn 146.41149.37145.58 －1 价格/（元·L） price/（yuan·L－1） 58 350350 2.32.3.1 AB-8树脂的动态参数2.3.3 泄露曲线 图1表明：萝卜硫素在收集到第3份流出液时出现泄露，在收集到第9份流出液时候达到饱 溶剂洗脱量 图3表明：4BV的50%乙醇可基本全部洗脱 萝卜硫素，因此，生产中可以选用50%乙醇洗脱液来富集萝卜硫素 。 8树脂的最大吸附量和，因此确定该条件下AB-为20.07mg/g 。 2.3.2 溶剂洗脱浓度 图2表明：萝卜硫素基本没有被水、10%乙 2.3.4 醇和30%乙醇洗脱，而50%乙醇可集中洗脱全部萝卜硫素，70%乙醇洗脱液中萝卜硫素含量甚微，因此可以选用50%乙醇为洗脱溶剂 。 径高比 图4表明：径高比越高，萝卜硫素的分离、富集色层越集中，而1∶8富集萝卜硫素效果最好， 因此确定其为最佳径高比 。 第1期3 讨论 谢述琼，等：9种大孔树脂对萝卜硫素柱层析分离研究177 ．哈尔滨商业大学学取、分离与抗癌活性研究［J］报（自然科学版），2005，21（3）：270． ［2］石林娟．西兰花籽中萝卜硫苷提取分离工艺研究 ［D］．合肥：合肥工业大学，2013． ［3］胡延雷，张小林，高艳．抗癌物质莱菔子素的最新 J］．化工中间体，2006（9）：7．研究进展［ ［4］陈秋芳，贾宏汝．十字花科植物的研究价值及开发 ．利用前景［J］（34）：11183． ［5］郭彩杰，崔娜，李健，等．十字花科植物中莱菔硫烷 ．西北植物学报，2009，29防癌机制研究进展［J］（10）：2146． ［6］THEJASSP，KUTTANG．Antimetastaticactivityofsulforap-hane［J］．LifeSciences，2006，78（26）：3043． ［7］梁锦锋，沈莲清．西兰花种子中萝卜硫素的提纯及 C］//2012年全国对胶质瘤细胞A172增殖的影响［ 中药注射剂安全性评价及质量控制学术研讨会，2014：248． ［8］刘锡建，肖稳发，曹俭，等．SP850树脂分离萝卜硫素 ［J］食品与发酵工业，2011，37（7）：197． ［9］李椿方．大孔吸附树脂和逆流色谱分离纯化莱菔硫 D］．北京：北京工业大学，2010．烷的研究［ ［10］黄肖钦，马朱莉，李娜，等．西兰花种子酶解生成 J］．上海工程技术大学学报萝卜硫素的条件研究［2010，24（3）：277． 安徽农业科学，2007，35 本试验选用成本相对较低且易操作的一些大 孔树脂来分离萝卜硫素，目的是找到一个分离萝8，卜硫素效果最好的树脂，通过对比，发现AB-SP850，SP825具有较高的静态吸附率及解吸率，8，SP825和SP850树脂在回收率、但通过对AB-8树脂的纯度纯度和成本的对比考察，发现AB-较SP825，SP850树脂高10%，回收率约为其1.4 倍左右，成本不到其1/5，因此在萝卜硫素的分8大孔树脂来对其进行分离纯化工艺中采用AB-离成本低廉适合工业化生产。 8大孔树脂的动态层析参数本试验还对AB-进行了研究，确定其最大吸附量为20.07mg/g，50%乙醇基本可以洗脱下全部萝卜硫素，大孔树脂柱的最佳径高比为1∶8，在分离萝卜硫素样品时，样品上柱后用2BV纯水和2BV30%乙醇的除 杂，4BV50%乙醇洗脱萝卜硫素，富集效果良好，为以后萝卜硫素的分离纯化工艺更进一步研究的开展提供参考。 ［参考文献］ ［1］季宇彬，池文杰，邹翔，等．西兰花中萝卜硫素提