酵母双杂交

主要内容2酵母双杂交系统技术介绍背景介绍:关注蛋白质3酵母双杂交系统技术介绍背景介绍:为什么要研究蛋白互作？4酵母双杂交系统技术介绍背景介绍:Clontech酵母双系统的功能May21,20185酵母双杂交系统技术介绍背景介绍May21,20186酵母双杂交系统技术介绍背景介绍May21,20187酵母双杂交系统技术介绍背景介绍ReporterGeneMay21,20188酵母双杂交系统技术介绍ReporterGeneReporterGene主要内容May21,20189酵母双杂交系统技术介绍基本原理:酵母双杂交参考文献Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.FieldsS,SongO.DepartmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.28000次引用May21,201810酵母双杂交系统技术介绍基本原理:GAL4转录因子的结构ADDNA-BDBD结合结构域AD激活结构域May21,201811酵母双杂交系统技术介绍基本原理:GAL4转录因子的分子机理在GAL4based双杂交系统中:正常情况在酵母细胞内PromotergalmetabolicgeneGALUASTranscriptionADBDMay21,201812酵母双杂交系统技术介绍ReporterGeneGAL4AD基本原理:三个启动子，四个报告基因May21,2018X-a-gal蓝白筛选May21,201813酵母双杂交系统技术介绍主要内容May21,201814酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统:MMSeriesMay21,201815酵母双杂交系统技术介绍ClontechMM系统的优点SMART方法与同源重组技术结合构建文库，聪明的酵母自己做克隆。AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景生长，大大降低假阳性。文库构建于型酵母菌株α型Y187中，方便后续与a型菌株Y2HGold进行mating直接筛选。May21,201816酵母双杂交系统技术介绍ClontechMM系统:蛋白互作基本流程自己构建文库：630490预制细菌文库：638802（传统型）预制酵母菌文库：630480（均一化，通用型）Clontech蛋白互作相关试剂盒酵母双杂交系统：630489酵母菌转化试剂盒：630439酵母培养基（套装）：630495插入片段检测：630497酵母质粒提取：630467体内验证：630489630305体外Co-IP验证：630458630459631723631604May21,201817酵母双杂交系统技术介绍文库构建:ClontechMM文库构建方法SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmatingAAAAAAAAATTTTTTTTCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGGMay21,201818酵母双杂交系统技术介绍SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmating自己做克隆May21,201819酵母双杂交系统技术介绍文库构建:ClontechMM文库构建方法SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmatingMay21,201820酵母双杂交系统技术介绍文库构建:ClontechMM文库构建方法文库构建:ClontechMM自制文库筛选SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmatingDDO/X/A混合QDO/X/AMay21,201821酵母双杂交系统技术介绍文库筛选:ClontechMM文库筛选630489Matchmaker™GoldYeastTwo-HybridSystemY187Y2HGold三个载体阳性对照，阴性对照。BDvector：pGBKT7ADvector:pGADT7630439极大提高转化率可以单独购买May21,201822酵母双杂交系统技术介绍文库筛选:ClontechMM系统质粒May21,201823酵母双杂交系统技术介绍文库筛选:诱饵载体构建及其自激活检测May21,201824酵母双杂交系统技术介绍文库筛选:Mating方法筛选Y187α型DDO筛选二倍体Y2HGolda型Mating接合反应酵母的有性生殖过程，Clontech利用这个过程，实现了文库筛选。MixMatingQDO筛选May21,201825酵母双杂交系统技术介绍文库筛选:均一化通用文库筛选DDO/X/A混合QDO/X/AMay21,201826酵母双杂交系统技术介绍文库筛选:传统细菌文库筛选取1ml菌液按照一定比例用LB稀释，150ul/板进行涂板，过夜培养。将提取的质粒转化Y187，获得酵母文库。将文库与诱饵培养液混合，进行Mating。涂筛选板，挑取阳性克隆子。刮取平板上的菌落，提取质粒。May21,201827酵母双杂交系统技术介绍文库筛选:验证阳性克隆子（PCR确认）630497Matchmaker™InsertCheckPCRMix2May21,201828酵母双杂交系统技术介绍文库筛选:酵母质粒提取630467EasyyeastPlasmidIsolationKitMay21,201829酵母双杂交系统技术介绍验证互作:体内验证SEAP630305MammalianMatchmakerTwo-HybridAssayKit2May21,201830酵母双杂交系统技术介绍验证互作:体外Co-IP验证ProteinA/GAgarosebeadsMatchmakerChemiluminescentCo-IPVectorSet（630458）MatchmakerChemiluminescentCo-IPKit（630459）ProlabelChemiluminescentDetectionKit（631723）May21,201831酵母双杂交系统技术介绍验证互作:体外Co-IP验证实验流程验证互作:FRET分析632466pDsRed-Monomer-C1Vector632470pAcGFP1-C1-VectorMay21,201833酵母双杂交系统技术介绍ClontechMatchmaker系统产品选择指南May21,201834酵母双杂交系统技术介绍TheFRIGIDAComplexActivatesTranscriptionofFLC,aStrongFloweringRepressorinArabidopsis,byRecruitingChromatinModificationFactorsKChoi,JKim,HJHwang,SKim…-ThePlantCell…,2011-AmSocPlantBiolExtracellularsignal-regulatedkinase8(Erk8)controlsestrogen-relatedreceptorα(ERRα)cellularlocalizationandinhibitsitstranscriptionalactivityMRossi,DColecchia,CIavarone,AStrambi…-JournalofBiological…,2011–ASBMBWSB-1,anovelIL-21receptorbindingmolecule,enhancesthematurationofIL-21receptorHNara,TOnoda,MRahman,AAraki…-Cellular…,2011–ElsevierFHL1interactswithoestrogenreceptorsandregulatesbreastcancercellgrowthLDing,CNiu,YZheng,ZXiong…-JournalofCellular…,2011-WileyOnlineLibraryRab4interactswiththehumanP‐glycoproteinandmodulatesitssurfaceexpressioninmultidrugresistantK562cellsCFerrándiz‐Huertas…-…JournalofCancer,2011-WileyOnlineLibrary6.DuplicatedC-classMADS-boxgenesrevealdistinctrolesingynostemiumdevelopmentinCymbidiumensifolium(Orchidaceae)SYWang,PFLee,YILee,YYHsiao…-PlantandCell…,2011-JpnSocPlantPhysiolProteinInteractionDomainMappingofHumanKinetochoreProteinBlinkinRevealsaConsensusMotifforBindingofSpindleAssemblyCheckpointProteinsBub1andBubR1TKiyomitsu,HMurakami…-MolecularandCellular…,2011-AmSocMicrobiolClontechMatchmaker系统近期参考文献May21,201835酵母双杂交系统技术介绍主要内容May21,201836酵母双杂交系统技术介绍常见问题分析:酵母双杂交文库如何获得？购买Clontech公司预制文库用630490自己构建文库请Takara公司提供文库构建服务如何获得酵母双杂交文库May21,201837酵母双杂交系统技术介绍常见问题分析:一定要做自激活检测吗？必须滴！自激活检测必须做：1.需要在Y2HGold菌株中进行。2.如果出现自激活现象需要调整AbA浓度或者调整序列。3.如果菌落生长过慢，可能是表达有毒性，需要用低拷贝质粒pGBT9(630490提供)。May21,201838酵母双杂交系统技术介绍常见问题分析:诱饵的大小有限制吗？我们有文献报道的8-750个氨基酸都有成功的案例。Heery,D.M.etal.(1997)Nature387(6634):733–736.2.SchaeferB.C.,Ed.(1997)GeneCloningandAnalysis:CurrentInnovations,(HorizonScientificPress),pp11–28.May21,201839酵母双杂交系统技术介绍常见问题分析:培养基为什么那么软？灭菌条件控制调整PH购买方便包装让培养基正常起来May21,201840酵母双杂交系统技术介绍：800-810-6261；010-80720985/86：service@takarabiomed.com.cn：www.takarabiomed.com.cn我们就在这里等您……May21,201841酵母双杂交系统技术介绍ThankYou！May21,201842