动物实验模型的制作

http://www.bioon.com/experiment/List_2029.shtml动物模型 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的原则及注意事项一、设计原则　　生物医学科研专业设计中常要考虑如何建立动物模型的问题，因为很多阐明疾病及疗效机制的实验不可能或不应该在病人身上进行。常要依赖于复制动物模型，但一定要进行周密设计，设计时要遵循下列一些原则。　　（一）相似性　　在动物身上复制人类疾病模型。目的在于从中找出可以推广（外推）应用于病人的有关规律。外推法（Extrapolation）要冒风险，因为动物与人到底不是一种生物。例如在动物身上无效的药物不等于临床无效，反之也然。因此，设计动物疾病模型的一个重要原则是，所复制的模型应尽可能近似于人类疾病的情况。　　能够找到与人类疾病相同的动物自发性疾病当然最好。例如日本人找到的大白鼠原发性高血压就是研究人类原发性高血压的理想模型，老母猪自发性冠状动脉粥样硬化是研究人类冠心病的理想模型；自发性狗类风湿性关节炎与人类幼年型类风湿性关节炎十分相似，也是一种理想模型，等等。　　与人类完全相同的动物自发性疾病模型毕竟不可多得，往往需要人工加以复制。为了尽量做到与人类疾病相似，首先要注意动物的选择。例如，小鸡最适宜做高脂血症的模型，因它它的血浆甘油三酯、胆固醇以及游离脂肪酸水平与人十分相似，低密度和极低密度脂蛋白的脂质构成也与人相似。其次，为了尽可能做到模型与人类相似，还要在实践中对方法不断加以改进。例如结扎兔阑尾血管，固然可能使阑尾坏死穿孔并导致腹膜炎，但这与人类急性梗阻性阑尾炎合并穿孔和腹膜不一样，如果给兔结扎阑尾基部而保留原来的血液供应，由此而引起的阑尾穿孔及腹膜炎就与人的情况相似，因而是一种比较理想的方法。　　如果动物型与临床情况不相似，在动物身上有效的治疗方案就不一定能用于临床，反之也然。例如，动物内毒性性休克（EndotoxinShock，单纯给动物静脉输入细菌及其毒素所致的休克）与临床感染性（脓毒性）休克（SepticShock）就不完全一样，因此对动物内毒素性休克有效的疗法长期以来不能被临床医生所采用。现在有人改向结扎胆囊动脉和胆管的动物胆囊中注入细菌，复制人类感染性休克的模型，认为这样动物既有感染又有内毒素中毒，就与临床感染性休克相似。　　为了判定所复制的模型是否与人相似，需要进行一系列的检查。例如有人检查了动物压、脉率、静脉压、呼吸频率、动脉血pH、动脉氧分压和二氧化碳分压、静脉血乳酸盐浓度以及血容量等指标，发现一次定量放血法造成的休克模型与临床出血性休克十分相似，因此认为些法复制的模型是一种较理想的模型。同理，按中医理论用大黄喂小鼠使其出现类似人的“脾虚症”，如果又按中医理论用四君子汤把它治好，那么就有理由把它看成人类“脾虚症”的动物模型。　　（二）重复性　　理想的动物模型应该是可重复的，甚至是可以标准化的。例如用一次定量放血法可百分之百造成出血性休克，百分之百死亡，这就符合可重复性和达到了标准化要求。又如用狗做心肌梗死模型照理很合适，因为它的冠状动脉循环与人相似，而且在实验动物中它最适宜做暴露心脏的剖胸手术，但狗结扎冠状动脉的后果差异太大，不同狗同一动脉同一部位的结扎，其后果很不一致，无法预测，无法标准化。相反，大小白鼠、地鼠和豚鼠结扎冠脉的后果就比较稳定一致，可以预测，因而可以标准化。　　为了增强动物模型复制时的重复性，必须在动物品种、品系、年龄、性别、体重、健康情况、饲养管理；实验及环境条件，季节、昼夜节律、应激、室温、湿度、气压、消毒灭菌；实验方法步骤；药品生产厂家、批号、纯度规格、给药剂型、剂量、途径、方法；麻醉、镇静、镇痛等用药情况；仪器型号、灵敏度、精确度；实验者操作技术熟练程度等等方面保持一致，因为一致性是重现性的可靠保证。　　（三）可靠性　　复制的动物模型来应该力求可靠地反映人类疾病，即可特异地、可靠地反映某种疾病或某种机能、代谢、结构变化，应具备该种疾病的主要症状和体征，经化验或X光照片、心电图、病理切片等证实。若易自发地出现某些相应病变的动物，就不应加以选用，易产生与复制疾病相混淆的疾病者也不宜选用。例如铅中毒可用大白鼠做模型，但有缺点，因为它本身容易患动物地方性肺炎及进行性肾病，后者容易铅中毒所致的肾病相混淆，不易确定该肾病是铅中毒所致还是它本身的疾病所致。用蒙古沙土鼠就比较容易确定，因为一般只有铅中毒才会使它出现相应的肾病变。　　（四）适用性和可控性　　供医学实验研究用的动物模型，在复制时，应尽量考虑到今后临床应用和便于控制其疾病的发展，以利于研究的开展。如雌激素能终止大鼠和小鼠的早期妊娠，但不能终止人的妊娠。因此，选用雌激素复制大鼠和小鼠终止早期妊娠的模型是不适用的，因为在大鼠和小鼠筛选带有雌激素活性的药物时，常常会发现这些药物能终止妊娠，似乎可能是有效的避孕药，但一旦用于人则并不成功。所以，如果知道一个化合物具有雌激素活，用这个化合物在大鼠或小鼠观察终止妊娠的作用是没有意义的。又如选用大小鼠作作实验性腹膜炎就不适用，因为它们对革兰氏阴性细菌具有较高的抵抗力，很不容易造成腹膜炎。有的动物对某致病因子特别敏感，极易死亡，也不适用。如狗腹腔注射粪便滤液引起腹膜炎很快死亡（80%24小时内死亡），来不及做实验治疗观察，而且粪便剂量及细菌菌株不好控制，因此不能准确重复实验结果。　　（五）易行性和经济性　　在复制动物模型时，所采用的方法应尽量做到容易执行和合乎经济原则。灵长类动物与人最近似，复制的疾病模型相似性好，但稀少昂贵，即使猕猴也不可多得，更不用说猩猩、长臂猿。幸好很多小动物如大小鼠、地鼠、豚鼠等也可以复制出十分近似的人类疾病模型。它们容易作到遗传背景明确，体内微生物可加控制、模型性显著且稳定，年龄、性别、体重等可任意选择，而且价谦易得、便于饲养管理，因此可尽量采用。除非不得已或一些特殊疾病（如痢疾、脊髓灰白质炎等）研究需要外，尽量不用灵长类动物。除了在动物选择上要考虑易行性和经济性原则外，而且在模型复制的方法上、指标的观察上也都要注意这一原则。二、注意事项　　研究者的设计动物模型时除了要了解掌握上述一些原则外，还要注意下列一些问题：　　（一）注意模型要尽可能再现所要求的人类疾病　　复制模型时必须强调从研究目的出发，熟悉诱发条件、宿主特征、疾病表现和发病机理，即充分了解所需动物模型的全部信息， 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 是否能得到预期的结果。例如诱发动脉粥样硬化时，草食类动物兔需要的胆固醇剂量比人高得多，而且病变部位并不出现在主动脉弓。病理表现为纤维组织和平滑肌增生为主，可有大量泡沫样细胞形成斑块，这与人类的情况差距较大。因此要求研究者懂得，各种动物所需的诱发剂量、宿主年龄、性别和遗传性状等对实验的影响，以及动物疾病在组织学、生化学、病理学等方面与人类疾病之间的差异。要避免选用与人类对应器官相似性很小的动物疾病作为模型材料。为了增加所复制动物疾病模型与人类疾病的相似性，应尽量选用各种敏感动物与人类疾病相应的动物模型。（二）注意所选用动物的实用价值　　模型应适用于多数研究者使用，容易复制，实验中便于操作和采集各种标本。同时应该首选一般饲养员较熟悉而便于饲养的动物作研究对象，这样，就无需特殊的饲养设施和转运条件，经济上和技术上容易得到保证。　　此外，动物来源必须充足，选用多胎分娩的动物对扩大样本和重复实验是有益的。尤其对慢性疾病模型来说，动物须有一定的生存期，便于长期观察使用，以免模型完成时动物已频于死亡或毙于并发症。　　野生动物在自然环境中观察有助于正确评价自然发病率和死亡率。但记录困难，在实验条件下维持有一定难度，且对人和家畜有直接和间接的威胁，使用时要特别加以注意。因此，复制模型时必须注意动物种群的选择，要了解各类动物种群的特点和对复制动物的影响。　　用于生物医学研究的动物种群，可按其遗传成分和其环境被研究人员控制的程度，分为三种基本类型：⑴实验室类型，它们可提供最大程度的遗传和环境操作；⑵家养类型，不论是乡村或城市饲养的，人类对其干扰的程度不同，且动物环境与人类环境可为能极为接近；⑶自然生态类型。几乎没有人为的干扰。可能某种动物（啮齿目、食肉目、兔形目）可按所有三类类型进行研究，这就增加了对环境和遗传因素作比较研究的可能性。在选用三类动物种群复制动物模型时，必须了解它们各自的优点和缺点，可参考表9-2。表9－2　不同类型的动物种群的优点和缺点优　点缺　点（一）实验室种群　1．连续饲养和记录1．生活于人工环境2．观察迅速2．标准日粮3．个体众多3．宿主体型大小和疾病的急性本质不太适用于临床或研究4．生命周期短4．一般涉及人工诱发的疾病5．标化的环境和/或遗传组成：近交、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡　6．在癌症研究领域中可用于传播性和移植性肿瘤　7．有基本的生化、生理、病理资料　（二）家养动物种群　1．生活于与人类相似或相同的环境1.饲养：空间、价格、管理、安全2．发病率常可比较2.实验对象损失：屠宰3．可研究自然途径感染的自发性疾病3.疾病记录和报导极有限4．短时间内经历疾病的全过程4.可用的免疫学资料有限5．很适于临床研究　6．有无限制的生前和死后标本　7．可能进行传播研究　8．在种群中疾病频率既有升高也有降低　（三）野生动物种群　1．容许估计自然条件下疾病的频率1．疾病记录和报告极有限2．揭示自然条件下的正常周期（非偶然的）2．关于模型动物的基本资料有限3．允许测定自然条件下的因素：3．难以在实验条件下饲养（1）预后（2）监测4．带有对家畜和人有潜在危险性的人畜互传疫病原　　（三）注意环境因素对模型动物的影响　　复制模型的成败往往与环境的改变有密切关系。拥挤、饮食改变、过度光照、噪音、屏障系统的破坏等，任何一项被忽视都可能给模型动物带来严重影响。除此以外，复制过程中固定、出血、麻醉、手术、药物和并发症等处理不当，同样会产生难以估量的恶果。因此，要求尽可能使模型动物处于最小的变动和最少的干扰之中。　　(四)不能盲目地使用近交系动物,不然会导致不能控制的因素进入实验　　例如自发性糖尿病大鼠(BB、Wistar)除具有糖尿病临床特征外，还发现多种病理变化（外周神经系统严重病变、睾丸萎缩、甲状腺炎、胃溃疡、恶性淋巴瘤等）。因此要有目的地选择。半个世纪以来，近交系的开发不断提供着新的动物模型材料，大、小鼠疾病作为模型在医学使用量已高达70～90%。利用近交系作动物模型时还必须认识到：　　1.动物形成亚系后不应该再视为同一品系。要充分了解新品系的特征和背景材料。　　2.即使作为已形成模型的品系，由于不适当的育种方法和环境改变，还可发生新的基因突变和遗传漂变；即存在着变种甚至断种的危险。　　3．国外经常取用二种近交系的杂交一代（F1）作为模型。其个体之间均一性好，对实验的耐受性强，又多少克服了近交系的缺点。但盲目引进F1代动物对复制所要求的模型是缺乏意义的。　　（五）动物进化的高级程度并不意味着所有器官和功能接近于人的程度　　复制动物模型时，在条件允许的情况下，应尽量考虑选用与人相似、进化程度高的动物作模型。但不能因此就认为进化程度越高等的动物其所有器官和功能越接近于人。例如，非人灵长类诱发动脉粥样硬化时，病变部位经常在小动脉、即使出现在大动脉也与人类分布不同。据报导用鸽（WhiteGameauPigeon）作这类模型时，胸主动脉出现的黄斑面积可达10%，镜下变化与人也比较相似，因此也广泛被研究者使用。　　（六）正确地评估动物疾病模型　　应该懂得没有一种动物模型能完全复制人类疾病真实情况，动物毕竟不是人体的缩影。模型实验只是一种间接性研究，只可能在一个局部或几个方面与人类疾病相似。因此，模型实验结论的正确性只是相对的，最终必须在人体身上得到验证。复制过程中一旦出现与人类疾病不同的情况，必须分析其分岐范围和程度，找到相平行的共同点，正确评估哪些是有价值的。　　总之，动物疾病模型这门新兴的科学正吸引着各个领域专业人员投身于这项开发工作。无论医学家、兽医学家还是生物学家，要复制动物模型还必须学习有关知识，精于选用已知的各种模型和开发新的模型，这也应该是研究者的一项基本技能。心梗致心衰的模型建立1.碘酒、酒精局部消毒，3％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射，（1/6ml/100g）。2.待鼠麻醉后，胸部及颈部剪毛，碘酒、酒精局部消毒。3.连接标准肢体导联心电图，监测大鼠心率、心电图变化。4.气管正中横切口（3mm）,气管插管，丝线固定后连接呼吸机，按1.5ml/100g潮气量，70－80次/分给予呼吸末持续正压通气，压力5－15cmH2O之间，根据呼吸频率及呼吸深度进行调整呼吸参数5.游离右颈总动脉，插管检测动脉血压。6.逐层钝性分离肌肉，胸骨左缘约0.5cm处剪断4肋骨（心尖搏动最明显处略向上）断端丝线结扎，防止肋间血管出血。剪开胸膜，暴露胸腔，用线牵拉两侧肋骨代替开胸器，以无菌湿棉球向下压迫左肺以保护肺脏，使心脏暴露良好。剪破心包，左手用眼科镊夹一小棉球，用棉球将胸腺及左心耳轻轻向上推开(推胸腺的动作一定要轻，太重的时候心脏反应型跳动过猛，心脏暴露就不充分)，暴露就不充分)，暴露动脉圆锥与左心耳之间的左冠状动脉。7.在左心耳下（相当于肺动脉圆锥与左心耳之间）找见，以前降支为标志，用3/8圆3×10的不锈钢圆针，6－0丝线在左冠状动脉下约5mm下穿过，进针深度约1mm左右，进出针宽度约在1－2mm左右，逼管法结扎丝线，阻断血流，心电监护见I、II导联ST段明显抬高，证明结扎成功。(1)动脉圆锥与左心耳之间的左冠状动脉在暴露心脏的时候是看不到的,看到的是表层静脉,动脉就在下面1-2mm,所以在此处结扎(2)结扎后进行2个月实验,这是经典的慢性心衰的试验方法,可以再查资料,很确实的(3)动物试验在这麽长的周期死亡率是>60%,也就是说最好最好的结果就是存活60%,这需要你在试验设计时就考虑到,主要是在结扎时,结扎后1~3天,后面也会死亡,但数目相对很少诱发性肝癌动物模型生物谷网站二乙基亚硝胺（DEN）诱发大白鼠肝癌：取体重250g左右的封闭群大白鼠，雌雄不拘。按性别分笼饲养。除给普通食物外，饲以致癌物，即用0.25%DEN水溶液灌胃，剂量为10mg/kg，每周一次，其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中，任其自由饮用。共约4个月可诱发成肝癌。或单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。4-2甲基氨基氮苯（DBA）诱发大鼠肝癌：用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2不应超过1.5～2mg/kg，4～6月就有大量的肝癌诱发成功。2-乙酰氨基酸（2AAF）诱发小鼠、狗、猫、鸡、兔肝癌：给成年大鼠含0.03%2AAF标准饲料。每日每平均2～3mg2AAF（也可将2AAF混于油中灌喂），3～4月后有80～90%动物产生肝肿瘤。二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌：用剂量为每日0.3～14mg/kg体重，混于饲料或饮水中给予，6～9个月后255/300大鼠发生了哮喘大鼠模型的制作和T淋巴细胞的分离实验大鼠分组：根据随机化原则，将24只雄性Wistar大鼠（体重190-250g）按体重编号，采取随机排列表法分为以下4组：（1）正常对照组、（2）哮喘一周组（激发一周）、（3）哮喘两周组（激发二周）和（4）哮喘四周组（激发四周及以上）。哮喘模型的建立：第一天三组哮喘组大鼠每只大腿内侧皮下注射OVA悬液1ml（OVA10mg+氢氧化铝200mg+0.9%生理盐水至1ml），同时腹腔内注射灭活百日咳杆菌悬液1ml（约6*109个菌株）作为佐剂,第8天重复致敏一次，第15天开始将大鼠置于自制玻璃容器中，隔日用402超声雾化器（上海四菱医疗器械厂）给于中等雾量的2%的OVA悬液50ml激发30分钟，每周至少3次，分别按分组激发1周、2周和4周及以上。OVA悬液激发后以大鼠出现烦躁、呛咳、呼吸加快、行动迟缓或俯伏不动等症状以及肺内组织病理切片显示嗜酸粒细胞、淋巴细胞浸润，小气道和小血管收缩为哮喘激发成功。正常对照组腹腔内注射等量PBS1ml代替OVA悬液,2周后雾化吸入中等雾量的PBS液50ml共30min,每天一次，共15天。T淋巴细胞的分离及体外培养对各组大鼠无菌操作行肠系膜下静脉穿刺采血10ml,分装于离心管后用等量PBS液稀释，然后缓慢加于等体积的淋巴细胞分离液上，使形成层次分明的界面。2200rpm离心20分钟，可见层次分明的界面。吸出离心管中间的一层乳白色的液体，加入0.85%的氯化铵以破碎红细胞并室温静置2分钟，然后用PBS终止反应。室温1800rpm离心10分钟，去除上清。继续用PBS稀释液先后洗涤2次，每次1600rpm离心15分钟；去除上清后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液将沉淀调至1ml并轻轻吹打混匀，置37℃，5%CO2温箱孵育1小时；将细胞悬液进一步用无菌尼龙棉柱37℃，5%CO2温箱培养1小时，分离出T细胞，台盼兰染色试验活细胞〉90%；用含10%FBS的RPMI-1640培养液调整T细胞浓度为2*106/ml,接种于24孔培养板内，每孔各1ml,于5%CO2、37℃培养箱内培养。