VEGFR-2拮抗剂洋地黄毒苷及其应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111870608A(43)申请公布日2020.11.03(21)申请号202010820558.X(22)申请日2020.08.14(71)申请人郑州大学地址450000河南省郑州市高新区科学大道100号(72)发明人李国栋　马晶晶　杜江峰　祁元明　高艳锋　(74)专利代理机构郑州亦鼎知识产权代理事务所(普通合伙)41188代理人张夏谦(51)Int.Cl.A61K31/704(2006.01)A61P35/00(2006.01)A61P9/10(2006.01)A61P9/00(2006.01)权利 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 书1页说明书9页附图2页(54)发明名称VEGFR-2拮抗剂洋地黄毒苷及其应用(57)摘要本发明提供了一种新型VEGFR‑2拮抗剂。本发明的化合物，可在哺乳动物中抑制VEGF诱导型血管生成相关疾病，比如肿瘤或视网膜疾病，如早产儿视网膜病变。本发明通过多角度实验，证实了其活性及应用。CN111870608ACN111870608A权　利　要　求　书1/1页1.洋地黄毒苷在制备VEGFR-2拮抗剂中的用途。2.洋地黄毒苷在制备在哺乳动物中抑制VEGF诱导型血管生成的药物中的用途。3.如权利要求2所述的用途，其特征是，所述哺乳动物有肿瘤或视网膜疾病。4.如权利要求2所述的用途，其特征是，所述哺乳动物有早产儿视网膜病变。2CN111870608A说　明　书1/9页VEGFR-2拮抗剂洋地黄毒苷及其应用技术领域[0001]本发明涉及医药领域。背景技术[0002]血管内皮生长因子(VEGF)家族包括VEGF-A等，VEGF-A可以激活表达在内皮细胞上的酪氨酸激酶受体血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)，刺激血管内皮细胞增殖、促进新生血管形成，并进一步促进视网膜病变的发展。首次报道中显示，VEGFR-2是跨膜激酶受体，全长1356个氨基酸。[0003]洋地黄毒苷(地吉妥辛)是强心药物，被列为2B类致癌物，经检索，未见其在VEGF靶点的研究。发明内容[0004]本发明克服了现有技术的不足，通过大量筛选，得到了一种新型VEGFR-2拮抗剂。[0005]本发明公开了洋地黄毒苷作为VEGFR-2拮抗剂的用途，或者在哺乳动物中抑制VEGF诱导型血管生成相关疾病，比如肿瘤或视网膜疾病，如早产儿视网膜病变。[0006]所述拮抗剂是指，能与相应的受体VEGF结合，并能够与配体竞争性的结合受体活性位点的一类物质的总称。[0007]所述VEGF诱导型血管生成是指，由细胞因子VEGF诱导细胞形成新生血管的过程。附图说明[0008]图1为对细胞迁移影响的结果；[0009]图2为对细胞侵袭的影响；[0010]图3为对ARPE-19细胞成管能力影响的结果；[0011]图4为HUVEC细胞管状形成的影响。具体实施方式[0012]下面实验可能涉及的英文缩写：[0013]3CN111870608A说　明　书2/9页[0014][0015]续表[0016]4CN111870608A说　明　书3/9页[0017][0018]一、对候选小分子M-3(洋地黄毒苷)，研究内容与方法概述如下：[0019]1.6.1候选小分子化合物的亲和力筛选[0020]微量热涌动(MST)技术检测小分子化合物与VEGFR-2蛋白的亲和力，并以VEGF165蛋白作为阳性对照。[0021]1.6.2候选小分子化合物的体外活性研究[0022](1)利用划痕实验，测定M-3洋地黄毒苷分别对HUVEC和ARPE-19细胞迁移的影响。[0023](2)利用Transwell实验，测定洋地黄毒苷M-3小分子化合物对ARPE-19细胞侵袭的影响。[0024](3)利用管状形成实验，测定洋地黄毒苷分别对HUVEC和ARPE-19细胞成管能力的影响。[0025]1.6.3候选小分子化合物的角膜渗透性及体内活性研究[0026](1)向新西兰大白兔双眼以滴眼方式给药，同一时间点采集兔眼内房水和耳缘静脉血。[0027](2)HPLC定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 法测定兔房水和耳缘静脉血中M-3小分子化合物的浓度。[0028](3)构建氧诱导的视网膜病变(OIR)模型，对小鼠模型进行治疗，设立实验组和对照组，观察最终筛选得到的M-3小分子化合物体内的生物活性。[0029]二、具体实验及结果如下：[0030]2 VEGFR-2拮抗剂的亲和力筛选：[0031]2.1部分主要试剂说明[0032][0033][0034]2.3实验方法-小分子化合物分子水平亲和力测定[0035](1)利用NT.115TM蛋白标记试剂盒RED进行靶蛋白VEGFR-2的标记，得到染料-蛋白复合物。NT647染料标记人VEGFR-2-His蛋白本次实验所用到的VEGFR-2-His蛋白初始摩尔浓度为：2.35μM。将20μM 50μL的NT647染料与VEGFR-2蛋白混匀，室温，避光反应30min。[0036](2)在此期间进行层析柱的平衡，用PBS7.2平衡3个柱体积(约500μL)即可。[0037](3)标记蛋白的纯化：反应30min结束后，将标记好的蛋白进行凝胶过滤层析，除去未结合的染料。染料蛋白复合物溶液过凝胶柱，待溶液刚渗入柱子后，加入400μL PBS7.2。5CN111870608A说　明　书4/9页随着刚加入的400uL PBS 7.2刚好完全渗入柱子，立刻加入600μL的PBS7.2。接样时，从柱子中滴下的第一滴液体开始接样，总接样量300-400μL左右。最后将凝胶柱冲洗干净，上机测定荧光染料标记效率，根据具体的荧光强弱进行适当稀释。[0038](4)样品的配制：设定小分子化合物的最高浓度为400μM，然后进行梯度稀释，依次设置16个浓度梯度，每管体积为10μL。最后向稀释的小分子溶液中加入10μL标记好的靶蛋白，等体积混匀。用毛细管吸取混合样品，根据浓度由内向外依次升高摆放于样品槽中。[0039](5)样品的检测：利用软件进行检测、实验数据的分析。[0040]2.4实验结果[0041]候选小分子化合物与VEGFR-2蛋白的亲和情况：[0042]实验中我们选择了其配体蛋白VEGF165作为阳性对照，VEGF165蛋白初始浓度只有1.23μM，无法达到结合浓度的饱和点。但多次重复实验发现MST点始终在拟合的S型曲线周围且重复性良好，说明实验中MST体系可靠。其中M-3的结合力强且拟合曲线比较完美，KD值为0.06μM。[0043]3 VEGFR-2拮抗剂的体外活性研究：[0044]3.1主要试剂：[0045][0046][0047]3.2主要试剂配制:[0048](1)PBS(pH＝7.2)溶液：首先称取0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8.0g NaCl及2.08g Na2HPO412H2O，然后用双蒸水定容至1000mL，121℃，高压蒸汽灭菌30min，最后4℃贮存备用。[0049](2)0.25％胰蛋白酶溶液：首先称取40mg EDTA溶于100mL PBS(pH＝7.2)溶液中，121℃，30min，进行高压蒸汽灭菌，然后称取0.5g胰蛋白酶溶于常温的上述混合溶液中，并用0.22μm滤膜过滤除菌，最后分装并保存于-20℃冰箱备用。[0050](3)0.2％结晶紫溶液：电子天平称取0.2g结晶紫粉末，加入到100mL甲醇中超声溶解，之后过滤并避光保存于4℃冰箱。[0051](4)100ng/μL VEGF：将装有10μgVEGF粉末的EP管进行离心(12000rpm，1min)，使管内蛋白粉末至管底。在生物安全柜中，加入100μL无菌的去离子水，稍稍晃动EP管使粉末沉至管底，常温静置30min溶解。移液枪轻轻吹打混匀，分装于无菌的EP管中，每管分装5μL，此时的VEGF浓度为1ug/μL。取出一管分装好的蛋白，再加入90μL无菌水，充分混匀后的蛋白浓度即100ng/μL，将其再分装至无菌的EP管中，于-80℃低温中保存备用。[0052]3.3 实验方法[0053]3.3.1 细胞的复苏、培养及冻存6CN111870608A说　明　书5/9页[0054]3.3.1.1 复苏细胞[0055](1)从-80℃超低温冰箱中取出ARPE-19和HUVEC细胞，迅速将装有细胞的冻存管放入预热的37℃水浴锅中，并不断摇动，使管内液体均匀融化。[0056](2)待冻存管内液体完全溶解可流动时放入离心机中2000rpm，离心5min。[0057](3)离心结束后，从离心机中取出细胞冻存管，拿入生物安全柜中。[0058](4)酒精消毒后，旋开管盖，弃上清液，加入1mL含10％胎牛血清(FBS)的培养基，并重悬轻柔吹打成细胞悬液。[0059](5)将已经吹散的单细胞悬液，转移至已预先加入适量培养基的培养皿中，轻轻摇晃让细胞均匀分布在皿中。放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。ARPE-19细胞用含10％FBS的DMEM/F12培养基培养，HUVEC细胞用含10％FBS的RPMI-1640培养基培养。[0060](6)24h后吸取旧培养基加入适量新鲜培养基，继续培养。[0061]3.3.1.2细胞培养[0062](1)ARPE-19和HUVEC细胞均为贴壁细胞，细胞长满后开始传代。[0063](2)取已灭菌的PBS缓冲液(pH7.2)和已经预热好的培养液，用酒精棉球擦拭好瓶口的放入生物安全柜中备用。[0064](3)从培养箱内取出细胞，小心吸出旧培养液，用PBS缓冲液清洗1-2遍后，加入适量0.25％胰蛋白酶液，放在37℃培养箱中消化1-2min左右。[0065](4)待细胞消化完成后，吸弃胰蛋白酶液，轻轻拍打培养皿，加入新鲜的培养液2-3mL，轻柔吹打分散细胞，将细胞吹打成单细胞悬液。[0066](5)将细胞悬液平均转移至2个已预先加入适量培养基的培养皿中，放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。[0067](6)及时观察细胞的状态，并根据情况给予换液或者传代，待细胞增殖进入对数增长期时即可进行后续实验。[0068]3.3.1.3细胞收集[0069](1)细胞传至3代左右，可以恢复良好活性，选择处于对数生长期的细胞，吸弃旧培养基，用PBS(pH7.2)洗1遍，接着用0.25％胰蛋白酶液于37℃消化1-2min左右。[0070](2)吸弃胰蛋白酶液，加入新鲜培养液，将细胞吹打成单细胞悬液。[0071](3)吸取适量的细胞悬液于15mL离心管中，将离心管放入台式低温冷冻离心机中，以2000rpm/min，4℃条件下离心5min。[0072](4)弃上清，重悬细胞，调整细胞密度至相应的实验浓度待用。[0073]3.3.2划痕实验[0074](1)0.25％胰酶分别消化处理状态良好的ARPE-19和HUVEC细胞，成单细胞悬液后，转移至50mL无菌离心管中，计数，调整ARPE-19和HUVEC细胞密度分别至2×105个/mL和1×105个/mL。[0075](2)将调整好密度的细胞以每孔1mL的体积铺于24孔板中，置于37℃培养箱中过夜培养，当细胞长至孔底的95％左右，用马克笔沿直尺在24孔板底部均匀的标记出两个十字。[0076](3)用中号枪头沿对应位置垂直于孔板底部均匀划线，划线时速度需均匀，否则划伤的细胞层宽窄不同，影响实验结果。用PBS(或无血清培养基)洗去划伤而脱落的细胞团，因此时细胞较脆弱，需缓慢的加入PBS进行清洗以免影响细胞状态。清洗2遍后加入无血清7CN111870608A说　明　书6/9页培养基，放于CO2培养箱。[0077](4)药物配置：培养基稀释药物，使M-3小分子在相应实验孔中的终浓度分别为1nM、10nM和50nM；对照组为含0.0005％DMSO的培养基，每个浓度梯度设置3个复孔。[0078](5)加入小分子后开始计时，培养0h、24h、48h后取出24孔板，显微镜下随机选取4个视野进行拍照，Image J软件计算划痕面积，并根据公式计算细胞的迁移率。结果为3次独立重复实验的平均值。[0079]迁移率公式：迁移率(％)＝[1－S24h/S0h]×100％.[0080]3.3.3 Transwell小室实验[0081](1)将生长状态良好的ARPE-19细胞消化成单细胞悬液，收集于15mL离心管，4℃，1000rpm，离心5min，倒上清，去除管内残余的血清。同上加入PBS(pH＝7.2)再次离心，最后用无血清培养基将细胞重悬，计数，调整ARPE-19细胞密度为5×105个/mL。[0082](2)准备24孔板，加入600μL含10％FBS的培养基，将无菌的Transwell小室放于24孔板中，上室加入250μL无血清细胞悬液，37℃培养箱培养24h。[0083](3)药物配置：培养基稀释药物，使M-3小分子在相应实验孔中的终浓度分别为1nM、10nM和50nM；对照组为含0.0005％DMSO的培养基，每个浓度梯度设置5个复孔。[0084](4)细胞培养24h后取出，弃去上下室培养基，PBS溶液清洗两遍。随后上室和下室分别加入250μL和600μL的多聚甲醛，固定30min左右。固定时上下室之间要避免有气泡。[0085](5)固定结束后，PBS清洗两遍，除去多聚甲醛，用棉签将小室上层的细胞拭去，0.2％结晶紫染液染色20min左右，用PBS溶液清洗两遍。[0086](6)显微镜下观察，每个小室选取10个视野进行拍照记录，Image J软件内进行计数，结果为3次独立重复实验的平均值。[0087]3.3.4体外管状形成实验[0088](1)实验前需将基质胶放入4℃冰箱过夜解冻，使其溶化成可流动的液体状，因基质胶常温下会凝固，故需提前预冷96孔板和枪头。实验时，将预冷的96孔板放于提前备好的冰盒内操做，预冷的枪头迅速向96孔板中加入基质胶，每孔50μL，为避免基质胶铺不均影响后续拍照取样，可提前润洗孔板。[0089](2)37℃，5％CO2培养箱内放置30min，以使基质胶凝固。[0090](3)在此期间，消化处理状态良好的ARPE-19和HUVEC细胞，用含有10％胎牛血清的培养基将细胞密度调至1×105个/mL，每孔200μL，并加入50ng/mL的细胞因子VEGF。[0091](4)加入提前调好浓度的M-3(体系终浓度为1nM、10nM和50nM)和对照组即含0.0005％DMSO的培养基，每个浓度设3个复孔。[0092](5)37℃，5％CO2培养箱内培养一定时间，显微镜下随机挑选5个视野，拍照取样。ARPE-19细胞培养4h，HUEVC培养5h时形成的管状较好。[0093]3.3.5统计学分析[0094]使用SPSS 19.0进行统计学分析。实验数据用平均数±SD表示。采用t检验比较差异显著性，*P<0.05差异显著；**P<0.01差异很显著；***P<0.001差异极其显著。[0095]3.4实验结果[0096]血管新生过程中细胞的迁移和侵袭对新生血管的形成至关重要，为了验证M-3对ARPE-19和HUVEC细胞迁移和侵袭能力的影响，我们设计了划痕和Transwell小室实验。划痕8CN111870608A说　明　书7/9页实验验证M-3对细胞迁移影响的结果：图1：M-3对ARPE-19细胞迁移的影响，结果显示：24h时实验组与阴性对照(Control)组无明显差异，但在48h时阴性对照组的细胞划痕区域愈合率较高，缝隙较小。而实验组愈合率较低，迁移的距离明显小于阴性对照组。综上所述：M-3能够明显抑制ARPE-19细胞的迁移。[0097]Transwell实验验证M-3对ARPE-19细胞侵袭的影响，如图2，设有浓度梯度的M-3实验组细胞的侵袭能力明显受到抑制，与阴性对照组相比具有极显著差异。[0098]病理情况下相关细胞在体内不断地形成管状进而发展成为新生微血管网，这是加剧视网膜发生病变的主要原因。所以管状形成实验是本章验证小分子活性最为关键的实验。为了验证M-3对细胞成管能力的影响，本次实验利用VEGF诱导ARPE-19和HUVEC细胞体外模拟管状形成。观察实验结果，可以看出M-3对ARPE-19和HUVEC细胞的管状形成均有影响。图3：与M-3共孵育4h后，M-3对ARPE-19细胞成管能力影响的结果，发现其在50nM浓度下对细胞成管能力具有显著抑制。图4：与M-3共孵育5h后，M-3对HUVEC细胞管状形成的影响，结果显示，实验组的管状分支与阴性对照组相比具有显著差异，从而得出结论M-3能够明显抑制HUVEC细胞的管状形成。[0099]4 VEGFR-2拮抗剂的角膜渗透性及体内活性研究：[0100]4.1研究思路[0101]为验证小分子化合物在局部滴眼后能否透过致密的角膜组织到达眼内、是否会在短时间内进入血液循环，这里我们设计了角膜渗透性实验。通过高效液相色谱定量分析法检测了对新西兰大白兔应用滴眼液后房水和血浆中药物浓度。角膜透过性实验发现M-3具有很好的穿透性，能够透过角膜进入眼内，这一关键的发现为接下来的体内实验研究提供了良好的依据。[0102]体内实验的探究采用了与人类早产儿视网膜新生血管病变发生、发展极为相似的氧诱导的视网膜病变小鼠模型。模型构建成功后，以滴眼的方式对模型鼠进行给药治疗，最后摘除眼球，通过视网膜切片观察新生血管情况。[0103]4.2 实验材料[0104]4.2.2 部分主要试剂[0105]苏木素染液                          赛维尔生物公司[0106]伊红染液                            赛维尔生物公司[0107]FAS眼球固定液                       赛维尔生物公司[0108]4.2.4主要试剂配制[0109]0.8％硼酸溶液：称取0.8g硼酸粉末于100mL纯水中，搅拌溶解，最后用无菌滤头过滤除菌，放于4℃冰箱备用。[0110]20％乌拉坦溶液：称取20g乌拉坦粉末，放于100mL生理盐水中溶解，待粉末完全溶解后过滤除菌，放于常温备用。[0111]4.3实验方法[0112]4.3.1兔房水和血浆样品采集[0113](1)麻醉：对新西兰大白兔进行称重、固定，20％乌拉坦溶液以5mL/kg的量耳缘静脉注射进行麻醉。为保证注射成功，先将覆盖在静脉皮肤上的毛发剃去，从远心端以30°进针，注射时以前1/3量快，后2/3量慢的方式注射麻药，麻醉药补助量不得超过20％。9CN111870608A说　明　书8/9页[0114](2)滴眼：0.8％硼酸溶液稀释小分子化合物(M-3浓度为152.99μg/mL)，用移液枪精准吸取50μL，双眼分别滴加50μL后使兔子被动闭眼10s左右，并固定头部避免液体流出。[0115](3)分组：单浓度给药20min、40min、80min、120min后，分别对不同组兔子进行采样，实验中每只兔的两只眼睛为互不影响的实验组，两只兔子为4个重复实验。[0116](4)采集房水：固定兔子身体和头部防止挣扎影响采集，1mL注射器拔掉活塞，针头制成与管体呈135°角，针头与角膜表面呈20°左右从角虹膜源刺入前房。随后轻压眼球，房水便自行溢入针管内，最后将获取的房水样品与等体积的乙腈混合，涡旋2min后离心(4℃，12000rpm，10min)取上清。[0117](5)采集血浆：用75％酒精反复擦拭耳缘静脉，手指轻弹几下，直到血管鼓起变粗，用注射器抽血，注意尽量针头全部进入血管，并用手指固定好针头，缓慢抽取，脱脂棉压迫止血。最后要及时将血样放入含有肝素钠的管中，快速混匀，4℃，12000rpm，离心10min，取上清与等体积的乙腈混合备用。[0118]4.3.2高效液相色谱检测[0119](1)色谱条件：C18柱(250×4.6mm,5μm)；流动相：0.1％三氟乙酸∶乙腈(M-3为50∶50)；柱温：25℃；检测波长：M-3为220nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL(定量环)。[0120](2)配制 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线样本(外标)：用0.8％的硼酸溶液将M-3配置成浓度分别为38.25μg/mL、19.12μg/mL、9.56μg/mL、4.78μg/mL、2.39μg/mL、1.20μg/mL、0.60μg/mL的标准溶液，进样20μl，进行LC-MS分析，得到标准曲线。[0121](3)稳定性实验：日内差：取对照样品于0h、2h、4h、8h、12h、进样，计算峰面积RSD值；日间差：取对照品于0d、1d、2d、3d、4d、进样，计算峰面积RSD值；精密度：取对照品连续进样5次计算峰面积RSD值。[0122](4)高效液相色谱分析房水和血浆中小分子化合物浓度：按照对应的色谱条件对房水和血浆样品进行预处理后上样，每次上样量为20μL，根据质谱结果分析各个时间点所取样品中药物浓度。[0123]4.3.3氧诱导的视网膜病变模型的建立[0124](1)分组：7日龄(P7)清洁级C57BL/6J新生鼠性别不限，35只，称其体重后随机分成5组：高氧未治疗组(OIR)、M-3治疗组(OIR+M-3)、施图伦滴眼液对照组(OIR+Stulln Mono)、0.8％硼酸溶液对照组(OIR+0.8％Boric Acid)、正常空气环境饲养对照组(Normal)。[0125](2)构建动物模型：模型构建采用国际上通用的Smith造模法。需高氧处理的P7新生鼠(小鼠7日龄)与哺乳期母鼠一起放置于密闭舱内，向舱内输入氧气，氧流量控制在0.5～0.75L/min，观察仪表指示盘使舱内氧气体积分数在75％±3％范围内。在此期间每隔6个小时监测舱内氧体积分数，如有所下降须及时补氧，防止氧气太低影响造模的成功率；每两天更换新的哺乳母鼠，更换二氧化碳吸附剂，并注意及时换水、加食保证母鼠营养充足。P7新生鼠在高氧环境中饲养5天后返回到正常空气环境中饲养。正常环境饲养组(Normal)新生鼠从出生P0与母鼠一直保持在正常空气环境中饲养至P19(小鼠19日龄)。[0126](3)给药：0.8％硼酸溶液将M-3稀释至3.75ug/kg进行给药，无菌的移液枪精准吸取滴眼液，双眼同时给药每只眼2μL，每天3次，持续治疗7d。注意：小鼠12日龄(P12)时眼睛还未自然睁开，须先用纯水湿润眼皮，随后用无菌眼科手术弯镊沿未睁开的眼缝处轻轻划开，充分暴露眼球后给药。10CN111870608A说　明　书9/9页[0127](4)取样：P19小鼠脱颈处死，摘除眼球。将小鼠倒立旋转后脱颈处死，大拇指和食指抓住小鼠后颈毛发向后揪，绷紧所要摘除眼球侧面部皮肤，使眼球鼓起暴露出眼眶，用弯头镊靠近眼眶皮肤向下压小心端出眼球，注意保留视神经长约2cm，投入FAS眼球固定液中常温固定24h。[0128](5)石蜡切片；固定结束后梯度酒精脱水，二甲苯中透明15min，从小鼠眼球的前后径水平方向用温度为60℃的石蜡包埋，浸蜡6h。放入包埋机，包埋的石蜡经-20℃冷冻后进行切片，切片时以整个视网膜矢状面切片穿过角膜与视神经平行为最佳，厚度为4-5μm，60℃烤箱烤片2h左右，取出备用。由于视网膜组织细胞密集，细胞间质少，烤片时温度不能太高，以防止视网膜组织发生龟裂甚至脱落，影响切片完整性。[0129](6)HE染色：将石蜡切片脱蜡至水，分别用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡后梯度酒精复水；苏木素染色15min，纯水洗5min，盐酸乙醇进行分化30s，纯水洗5min，随后用氨水泛蓝后纯水洗10min，伊红染3min；梯度酒精脱水、利用中性树胶封片、显微镜下观察并分析采集的图像。[0130]4.4实验结果[0131]4.4.1标准曲线及稳定性[0132]通过高效液相色谱分析法对所配置的一系列不同浓度的标准储备液M-3进行检测，记录色谱图。以积分所得峰面积(Y)为纵坐标，小分子化合物浓度(X)为横坐标进行线性回归。小分子化合物含量与峰面积线性关系良好，M-3标准曲线回归方程为Y＝21.317X-16.002，R2＝0.9986。日内差峰面积RSD＝0.57％(n＝5)；日间差峰面积RSD＝1.06％(n＝5)；精密度实验峰面积RSD＝0.54％(n＝5)。以上结果说明无明显变化，供试品溶液稳定，仪器精密度良好。[0133]4.4.2高效液相色谱分析兔房水和血浆中候选小分子化合物浓度情况[0134]为了进一步验证小分子化合物能否有效的透过角膜以及在血液中是否有浓度积累，通过高效液相色谱定量分析法测定滴眼后的兔房水和血浆中小分子化合物浓度。M-3以浓度为152.99μg/mL进行滴眼后，高效液相色谱分析不同时间点样品中药物浓度。结果显示：高效液相色谱法检测到80min时M-3在兔房水中的浓度最高，将峰面积代入标准曲线方程浓度为3.93μg/mL，而在血浆样品的各个时间节点未检测到M-3。[0135]4.4.3M-3对动物模型的治疗结果[0136]利用高氧环境构建了OIR小鼠模型，为了验证模型构建是否成功，为此我们设计了正常对照组小鼠，从P0到P19幼鼠与哺乳母鼠一直在正常空气环境中生活，通过P19正常对照组与高氧诱导的模型组(OIR)小鼠视网膜HE染色结果对比，从中可以看出对照组小鼠视网膜全层细胞排列致密整齐，组织形态未见异常，而高氧诱导的OIR组小鼠视网膜神经节细胞层(GCL)细胞数量减少，箭头指向为突破视网膜内界膜的血管内皮细胞进入了玻璃体，内核层(INL)较薄，细胞数量明显减少且分布紊乱，通过与正常对照组比较说明动物模型构建成功。[0137]对P12模型鼠持续治疗7天，HE染色观察小鼠视网膜情况。从结果可以看出：0.8％硼酸溶液对OIR小鼠视网膜无治疗作用，细胞层结构紊乱，视网膜边界有大量血管内皮细胞突出，M-3治疗的OIR小鼠组和阳性对照施图伦滴眼液(Stulln Mono)治疗结果相同，视网膜组织结构布局整齐，全层细胞排列致密，边缘未见内皮细胞突出。11CN111870608A说　明　书　附　图1/2页图1图212CN111870608A说　明　书　附　图2/2页图3图413