Nikon A1R激光共聚焦扫描

NikonA1R激光共聚焦扫描显微镜操作指南上海科技大学生命科学与技术学院2016年7月A1R操作 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 书1目录1.激光共聚焦显微镜组件介绍.............................................................................21.1显微镜主机介绍................................................................................................21.2显微镜调试的常用组件....................................................................................31.3遥控器................................................................................................................41.4软件控制............................................................................................................42.激光共聚焦显微镜的使用.................................................................................62.1开机顺序.............................................................................................................62.2显微镜的操作.....................................................................................................73.拍摄共聚焦图像..................................................................................................83.1共聚焦光路调节................................................................................................83.2xy图像拍摄........................................................................................................93.3xyz图像拍摄.....................................................................................................123.4xyt图像拍摄.....................................................................................................133.5大图拍摄..........................................................................................................133.6ROI荧光强度扫描........................................................................................143.7多点序列扫描..................................................................................................154.图像保存和处理..............................................................................................17附录.........................................................................................................................23A1R操作说明书21.激光共聚焦显微镜组件介绍1.1显微镜主机介绍（1）滤光片：包括D---毛玻璃；NCB---色温平衡片；ND---减光片；“GIF”---绿色滤光片和用于PFS的红外滤光片；（2）视场光阑；（3）聚光器升降旋钮；（4）起偏器（DIC用）；（5）聚光器对中旋钮；（6）孔径光阑；（7）聚光器模块（包括明视场，DIC）；（8）滤色块转盘（包括DIC检偏器）；A1R操作说明书3（9）手动荧光光闸；（10）电动焦距调节旋钮；（11）ND减光片；（12）遥控器；（13）透射光电源；（14）汞灯荧光光源；（15）PFS控制器（16）HUB控制器1.2显微镜调试的常用组件前面板控制（1）状态显示屏；（2）PFS开关按钮；（3）光路端口切换按钮；（4）中间变倍旋钮侧面板控制（1）调焦旋钮（2）粗微调切换按钮（3）物镜切换按钮；（4）滤光块，DIC检偏切换按钮（5）透射光光源开关（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此按钮无效）（6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）（7）物镜复位（8）物镜向下移动至最低处（约500um）A1R操作说明书4注意：在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色HUB控制器（显微镜示意图15位置）右侧的电源开关打开。1.3遥控器TiPad长寿命汞灯遥控器(1)镜切换按钮(2)滤光块，DIC检偏器切换按钮(3)DIC检偏器快速切换按钮(4)光路端口切换按钮(5)PFSON/OFF(6)聚光器转盘切换按钮(7)透射光源控制按钮(8)荧光光强控制(9)荧光光闸1.4软件控制A1R操作说明书5A1R操作说明书62.激光共聚焦显微镜的使用2.1开机顺序共聚焦部分（1）接通激光台的电源（特别注意488nm和561nm激光器的打开程序）（7）接通共聚焦控制器电源显微镜部分（2）接通汞灯（目视荧光观察用灯）电源，打开约10min稳定，关闭需要超过15min后才可以再次启动（3）接通卤素灯（目视透射光观察用灯）电源（4）接通电动载物台电源（5）Piezo快扫台（不用共振扫描时可略过此步）（6）接通显微镜主体电源计算机部分（8）开启计算机与显示器（9）启动“NIS-Elements”软件（确保上述开机完成后才能打开软件）19StandByA1R操作说明书72.2显微镜的操作（1）明场观察a)打开电源开关，并打开显微镜透射光卤素灯电源开关；b)把滤色块移到空位；c)把起偏器，检偏器移出光路；d)把聚光器切换到A状态；e)检查出光端口。（2）微分干涉(DIC)观察a)按照明视场透射光观察方法调节好显微镜；b)把起偏器，检偏器移入光路；c)按照相对应物镜将聚光器转到相应N1/N2位置（请参见另外所附对照表）；d)检查出光端口；e)旋转起偏器，选择最佳显示效果。（3）荧光观察a)打开荧光电源稍待片刻至光源指示灯不闪（打开约10min稳定，关闭需要超过15min后才可以再次启动）b)确认透射光开关处于关闭状态；c)检查出光端口；d)选择合适的滤色块；e)打开光闸，调节荧光亮度，进行观察；f)不观察时，把光闸关掉，以避免荧光淬灭。A1R操作说明书83.拍摄共聚焦图像3.1共聚焦光路调节（1）打开软件（2）NIS的操作界面（3）按需选择合适的OC（OpticalConfigurations）成像条件（4）建立新的光路OC（OpticalConfigurations）配置如果默认的快捷操作系统无法满足成像的需要，可重新进行CameraSettings设定，建立新的OC。可根据样品情况选择所需染料或者荧光蛋白，并选择是否需要拍摄明场透射光。亦可通过改变探测模式来改变接受光波长范围：[DU4]：标准探测器，[SD]：光谱探测器，[VF]：虚拟滤色片。A1R操作说明书9○1探测器：当前所选探测模式○2通道交替：选择是同时打开所有用于扫描的激光，还是顺序地一次打开一个激光器（用于防串色）○3Setting按钮：打开Opticalpath窗口，用于选择探测器，二向色镜，探测通道以及每个通道所对应的荧光染料，激光等○4状态：各个通道的设置情况(染料名称，激光波长以及探测波长带宽).○5TD：透射探测器状态处于使用中("ON")或是未使用("OFF").最后确认光路设置点击[ok]按钮。确认使用此光路配置，光路设置窗口关闭3.2xy图像拍摄界面调出方式：软件灰色空白处，鼠标右击菜单中选择[AcquisitionControls]->[A1plusCompactGUI]A1R操作说明书10（1）拍摄流程：a)选择共振[Resonant]或检流计式[Galvano]扫描方式。（A1R系统同时含有此2种扫描模式，）如在光谱探测（SpectralDetector）模式和虚拟滤色片(VirtualFilter)模式下，只有检流计式扫描模式可用，因此不能改变扫描模式。b)选择要使用的激光/通道。c)在Pinhole的项目中选择要使用的激光波长。点击按钮，选择与物镜最匹配的针孔尺寸。d)点击[Scan]按钮，边观察图像边调节激光功率和检测器的灵敏度HV。HV：探测器灵敏度Offset：信号的偏移（标准：0）Laser：激光功率（当鼠标移动到相应位置可直接使用滚轮进行精细调节）e)将像素数调整为所需要的分辨率。图像较暗时，请降低扫描速度。A1R操作说明书11f)根据需要进行Average。g)点击[Capture]按钮以获取图像。h)激活要保存的图像，从菜单栏中选择[File]->[SaveAs]以进行保存。（2）图像显示调节点击按钮调出LUTs窗口进行细致的图像显示调节。（3）扫描区域调节点击ScanArea窗口按钮，用鼠标拖动绿色边框，以缩小扫描区域。在鼠标变为十字箭头的状态下移动边框，鼠标右击以决定扫描的位置。可在Zoom中确认缩放倍率。在绿色边框的旋转用点上拖动鼠标，可以进行扫描区域的旋转。在Rotation中可以确认所设定的旋转角度。旋转范围为-90度～90度。缩放区域点右键后，边框变绿，表示区域选定。A1R操作说明书123.3xyz图像拍摄（1）点击软件左边工具栏按钮，启动CaptureZ－Series对话框（如下图）。（2）点击[Definedtop&bottom]按钮。（3）点击[Reset]按钮。（4）点击[Scan]按钮，边观察图像边转动显微镜的调焦手轮（微调模式），点击[Top]按钮，决定Top。（5）点击[Scan]按钮，边观察图像边转动显微镜的调焦手轮（微调模式），点击[Bottom]按钮，决定Bottom。（6）决定Step（7）根据需要，选择[SavetoFile]，在保存的同时获取A1R操作说明书13图像。（8）参照“3.2”Live模式下设置拍摄参数。（9）点击[Runnow]按钮，获取Z序列图像。3.4xyt图像拍摄（1）点击软件左边工具栏按钮，启动CaptureTimelapse对话框。（2）决定时间间隔（Interval）和持续时间（Duration）。（3）选择[SavetoFile]，在保存的同时获取图像。（4）参照“3.2”Live模式下设置拍摄参数。（5）点击[Runnow]按钮，获取时间序列图像。3.5大图拍摄（1）从菜单栏中选择[Acquire]->[ScanLargeImage]，启动ScanLargeImage窗口。（2）设定要扫描的范围。A1R操作说明书14（3）针对ZSeries进行设定。（4）设定图像的重叠补偿。（5）选择有无阴影补偿。（6）设定多通道拍摄参数（7）在Focus中设定对焦方法。（8）选择保存方法。（9）选择保存路径和保存格式。（10）点击按钮，获取LargeImage图像。3.6ROI荧光强度扫描（1）点击，打开经时序列图像程序。（2）鼠标右击软件上的灰色部分，从弹出的菜单中选择[AnalysisControls]->[TimeMeasurement]以调出控件界面。（3）在图像上设定ROI（RegionOfInterest）。a)点击[Define]按钮，启动DefineROI窗口。b)在图像上设定ROI。c)点击[Finish]按钮以结束设定。（4）进行经时变化分析。a)点击[Measure]按钮，绘制图表。b)以中任意一种测量模式进行分析。MultiROIs：可以显示多个ROI的经时变化（每次只可选择1个通道）MultiDyes：可以显示多个通道（ALL、Custom）的A1R操作说明书15经时变化（每次只可选择1个ROI）c)点击，选择ExportData，点击[Export]按钮，可以保存为文本数据。3.7多点序列扫描（1）点击软件左边工具栏的按钮，启动NDAcquisition对话框。（2）选择[XY]选项卡。（3）操作电动载物台的摇杆，移动到要获取的点。（边观察Live图像边移动会比较方便）（4）点击PointName，登录位置信息。如果选择IncludeZ，则Z位置也会被登录。可登录的有显微镜的Z位置或完美调焦系统的偏移值（要跟踪的焦点的位置）（5）重复上述步骤(3)～(4)，登录所需要的点。（6）选择[Time]选项卡。（7）决定时间间隔（Interval）和持续时间（Duration）。（8）选择[SavetoFile]，在保存的同时获取图像。（9）参照“3.2”Live模式下设置拍摄参数。（10）点击[Runnow]按钮，获取多点时间序列图像。A1R操作说明书16XYZOverview面板提供高级载物台与Z轴控制功能软件灰色空白处，鼠标右击菜单中选择[AcquisitionControls]->[XYZOverview]A1R操作说明书174.图像保存和处理4.1图像保存（1）NIS-Elements软件图像图层：NIS-Elements软件显示图像分为3个基本层次：a)注释层：保存注释，测量信息；b)Binary层：二元阈值分析；c)图像层：根据相机不同获得不同位深的图像。（2）NIS-Elements文档类型：a)RGB图像：彩色相机拍摄图像格式；b)多通道图像（Multi-channel）：多通道拍摄单幅图像；c)Nd2多维图像：包括时间，Z轴，多点，多通道等的多维图像。（3）NIS-Elements拍摄图像保存的格式：NIS-Elements软件默认的图片格式有2种，jp2000格式用于单一图像的保存，nd2格式用于多维图像的保存。图像也可以保存成tif，jpg，bmp，gif，png等，多维图像可以保存成avi等常见格式。注意：请在保存所需要图片格式前保存拍摄默认原始格式，原始格式包含图片拍摄所有条件信息。查看拍摄信息，请在图像上单击鼠标右键选择imageproperty。调用原图片拍摄条件，请在图像上右击鼠标选择reusecamerasettings工具。注意：如果要在Windows或者Office软件里查看拍摄得到的图像，需要在image菜单下convert栏里将图像转换成8位RGB图像，并另存为常见图像格式，例如tif，jpg等。（4）图像查看a)LUTs注意：应用按钮后，图像原始荧光强度信息会被改变，如果要对图像荧光强度进行测量，请勿按此按钮。该窗口也可以在预览时使用。A1R操作说明书18b)多通道平铺显示(SplitComponents)c)缩放控制（RoomControl）d)一般控制（generalcontrol）○1显示探测框，探测框应用与光强柱状图，自动曝光和自动白平衡功能；○2显示背景框，背景框用于参考区域的背景扣减（Image>Background>SubtractBackground）；○3显示网格，用来做粗略的距离的查看；○4显示标尺，给图像加标尺，如果要用其他格式输出图像，请使用BurnScale功能；○5测量框，选择测量范围；○6感兴趣区域选择；○7路径光强分析，使用View>AnalysisControl>IntensityProfile功能可以用来查看任意直线，折线路径上的各通道光强分布。以上各个按钮处，均可以单击鼠标右键进行详细的设定和相应属性的更改。e)状态栏（StatusBar）：显示当前图像定标信息，指针位置，光强，图像形式和分辨率。f)通道的控制:对于多通道图像，用鼠标左键选择已拍摄图像的某个通道，将其拖出窗口即可得到单通道图像。如果要合并2个单通道图像，只需要将一张图像的通道选中，同样用鼠标左键将其拖动到需要合并的图像窗口即可。通道的颜色可以用鼠标在对应通道位置右击，在channelproperty对话框中进行更改。g)ND控制A1R操作说明书194.2图像分析（1）ROIStatistics感兴趣区域统计:a.打开需要分析的图像，选择感兴趣区域设定工具（IV->4.->f），电击图标右边倒三角箭头，选择矩形，椭圆或者自由曲线等模式，在图像上选取感兴趣区域范围（ROI区域还可以用ROI菜单下的ROIEditer模式来进行修改和编辑）。b.在图像显示区域空白处点击鼠标右键弹出菜单，选择Analysis里ROIStatistics项，弹出以下窗口，ROI栏即可得到感兴趣区域面积，平均光强，总光强，信噪比等信息。（2）Thresholding阈值分析:阈值分析是通过软件生成一个Binary图层，来进行图像的分析。A1R操作说明书20○1阈值分析模式选择：根据所需分析图像类型选择相应的分析模式，RGB，HSI（对比度，饱和度，亮度分析），MCH（单通道分析），Intensity（亮度分析）。○2阈值选取工具，选取相应大小范围阈值加入到所选范围内，点可以对选取阈值范围更新计算Binary。选可以实时更新Binary图层信息。○3手动选择阈值范围，或者在左上或者右上角输入数字来约束阈值范围；○4从左至右依次为清除碎片工具，平滑边缘工具，形态学分割器，可以用来去除图像内细小碎片干扰，自动圆滑区域边缘，自动分割有交叠的多个目标；○5对上面得到的目标进行筛选工具，根据大小，周长，亮度等信息设定需要的Binary目标。○6查看阈值分析结果，在图像显示区域空白处点击鼠标右键弹出菜单，选择Analysis里ROIStatistics项，如上页图片，阈值分析得到的统计结果在 表格 关于规范使用各类表格的通知入职表格免费下载关于主播时间做一个表格详细英语字母大小写表格下载简历表格模板下载 中Binary栏显示出来。提示：在进行阈值设定后，根据需要可以在Binary菜单下选择Fillinholes工具进行孔洞的填充或缩减，膨胀，打开，封闭,形态学分割等多种数学形态学图形修正工具进行Binary的微调，以使结果更准确。（3）BinaryEdit二元蒙板层编辑：NIS-Elements软件提供Binary编辑工具。按键盘的Tab键或者在Binary菜单选择BinaryEdit项，软件自动切换到编辑界面，可以进行Binary区域的填充，切割，增加目标区域，修改目标区域等功能。注意：BinaryEdit可以进行前景和背景的编辑，编辑的时候请确认左上角图标是FG（前景）还是BG（背景）。（4）ObjectCount目标计数：依照Thresholding的方法选择相A1R操作说明书21应的目标，按执行按钮，软件会自动计算当前条件下的目标数量，并在下面列表中显示每个目标的面积，平均光强，周长等等特征测量的信息。选择按钮可以以同样条件对整个ND文件的每一帧图片进行分析计数，然后在图标右端下拉菜单选择输出格式为txt文本或者excel表格（需要系统安装了office）。如果要看所有目标的统计数据，请在ROIStatistics里的Binary栏查看结果。（5）AnnotationsandMeasurements标注和手动测量：使用Annotations栏，可以选择不同的标注方式进行图像的注解和标记，从左到右依次为：箭头，直线，矩形，椭圆，文字输入，折线，自由曲线。在Measurelength栏可以用来进行长度测量，从左到右依次为两点之间距离测量，平行线之间距离测量，折线路程长度测量，对角线测量，自动寻找边缘测量距离等。A1R操作说明书22Area栏进行感兴趣区域的面积测量，根据需要设定不同的曲线，矩形，椭圆等ROI区域。依次还可以对图像进行监督，半径，半轴长的测量，以及手动计数和分类等功能操作。所有的测量结果均显示在下面的列表中，通过列表左上角下拉菜单选择需要查看的测量结果类型，可以分别查看统计数据并导出数据到本地。6).TimeMeasurement时间测量：在时间序列图像上选取感兴趣区域（测量栏ROI处），选择Measure进行时间测量，可以选择多个感兴趣区域进行测量，也可以对感兴趣区域的多个通道进行时间测量。测量结果可以以图表或者数据表格的形式输出（在Export选项进行选择）。MultiROIs：分析多个ROI区域的时间变化。MultiDyes：分析多个通道的时间变化。A1R操作说明书23附录一：显微镜光路调节和照明注意事项（一）柯勒照明的调节方法1.选择10X物镜；2.调焦，使标本清晰成像；3.缩小视场光阑（显微镜视图2位置）；4.上下调节聚光器（显微镜视图3位置），使视场光阑边缘清晰；5.调节聚光器对中旋钮，使其居中；6.放大视场光阑，使其刚刚外切于视野。（二）长寿命汞灯电源的注意事项1.电源打开以后，大约10分钟左右光源达到稳定状态；2.电源关闭以后，至少要等10分钟才能重新打开。（三）物镜盖玻片矫正环的调节方法1.调焦，使图像相对最清楚；2.把矫正环向一个方向转动一定角度，此时图像变模糊，调焦，使图像相对最清楚；3.判断此时的图像质量是否有所改善。如有改善，则按照该方向再旋转一定角度；如质量下降，则反方向旋转；1.4.重复2）和3）直到图像质量改善之后又有所下降；反方向旋转，回到倒数第二次的位置即可。A1R操作说明书24附录二：Ti-E物镜，DIC插片，DIC棱镜对照表Ti-E:CombinationsofobjectiveandDICprismObjectiveDICSliderN1/N2PlanApo10×10×N1PlanApoVC20×20×N2PlanApo40×40×N2PlanApoVC60×60×N2PlanApoVC100×100×N2A1R操作说明书25附录三：图标工具栏和左图标工具栏图标介绍：Open：打开文件ZStackLive：Z轴序列预览Save：保存当前文件Integrate：叠加，多次拍摄图像累积Savenext：将当前文件保存为新文件Average：平均，多次拍摄图像平均Print：打印CapturetoRAMBuffer：拍摄存至缓存Undo：撤销前一步操作BinaryToolbar：二元蒙板编辑工具Redo：还原一步撤销的操作CaptureMultichannel：拍摄多通道LiveFast：快速预览CaptureMultipoint：拍摄多点RAMBufferON：打开内存拍摄Copy：复制BackgroudCorrectionON：打开背景校正PasteAsNewImage：粘贴复制图像OpticalConfigurations：光路配置设定Crop：剪切NewOpticalConfiguration：创建光路配置RunMacro：执行宏命令PointingTool：指针按钮CloseAll：关闭全部窗口MagnifierGlass：图像放大工具GeneralOption：打开设置窗口Annotations&Measurement：注释和测量CustomizeToolbar：自定义工具栏多维拍摄窗口Define/RunExperiment：打开CaptureTimeLapse：拍摄时间序列CaptureZSeries：拍摄Z轴序列A1R操作说明书26附录四：控制窗口介绍NIS-ElementsAR软件所有控制窗口均可以在主菜单栏View菜单下找到，或者在图像显示区域点击鼠标右键弹出。Acquisition：AVIAcquisition：AVI拍摄AutoCaptureFolder：自动拍摄存储文件夹CameraSettings*：相机设定CaptureFRETImage*：拍摄FRET图像FiltersandShutters*：滤色块和光闸控制Lamp*：光源控制NDAcquisition*：多维图像拍摄Nosepiece*：物镜转盘控制MicroscopeControlPad*：显微镜控制面板XYZNavigation*：XYZ导航ZSeries*：Z轴序列Visualization:BinaryLayers：二元蒙板层编辑Histogram：柱状图LUTs:LUTsOpenedImages：已打开图像Preview：预览窗口Synchronizer：窗口同步器XYOverview*：XY预览Analysis:AnnotationsandMeasurements：注释和测量AutomatedMeasurement：自动测量AutomatedMeasurementResults：自动测量结果BinaryToolbar：二元蒙板编辑工具Colocalization：共定位分析EDFZ-Profile*：Z序列景深扩展IntensityProfile：光强分析ObjectCount*：目标计数ObjectClassifier*：目标分类PixelClassifier：像素分类A1R操作说明书27附录五:图像格式批量转换操作如何用NIS-Elements进行图像批量转换，例如：用户拍摄得到的多个12bit多通道图像，希望快速对所有的图像格式进行转换，以便从windows里打开或者用其他图像软件编辑。可以采用下列步骤：（1）将所有需要转换格式的文件拷贝副本到一个新文件夹中（此项请特别注意，否则转换完成后原始图像会改变）；（2）选择File/Sequences/PlaySequences命令，弹出如下窗口：（3）在窗口左侧3的位置选择需要转换图像所在的文件夹；（4）在图示4的PlayMode橙色框中选择：Openimagestofullscreen或者Don’tloadimages,usecommands；（5）点击图示5位置ExecuteCommand(s)选项右侧绿色框中图标，弹出PasteCommands窗口（下图）；（6）选中左边栏里Macro选项里面的RunMacro(…)选项，然后在图示6位置红色框处指定图像格式转换*.mac宏命令文件所在的位置，单击ok；A1R操作说明书28（7）点击Play，指令将会自动对选择文件夹中的图像进行处理，执行完毕后按enter键退出。（8）选择File/Sequences/Convertfiles命令，弹出如下窗口，在Directories栏里选择前面转换相同的文件夹，在蓝色框位置指定需要保存文件夹，在outputfileformat栏下选择tiff格式或者jpeg格式，点击ok完成。（9）查看指定保存文件夹，即可得到需要的图片。A1R操作说明书29注意：8bitRGBsave宏文件包括了三个操作：图片转换成8bit，转换成RGB格式，保存。操作的前面部分是图像的转换，最后两步是文件格式的转换。软件版本不同，界面稍有不同，请根据实际情况操作。