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苯酚硫酸法测定鲜人参中多糖含量

      作者：钟岩 潘浦群 王艳红 初丽伟

【Summary】  　　目的建立了测定鲜人参中多糖含量的分析方法。方法用苯酚硫酸法，在波长490 nm处测定吸光度，人参多糖在10～160 μg范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.998 7。平均回收率为98.40%，RSD=2.53%。结果人参多糖的最佳提取条件为：料液比为1∶10，提取温度为100℃，提取时间为4 h，人参多糖换算因子为1.58，鲜人参中多糖的含量为18.14 g/100 g。结论该方法简便、准确率高、重现性好。

【Keys】  鲜人参 多糖 苯酚 硫酸法 含量

　　Abstract：ObjectiveTo established an analysis method for the determination of  the content of polysaccharides from fresh root of Panax ginseng.MethodsThe method of phenolvitriol.The absorbency rate was tested in wavelength 490 nm.ResultsThere was a good linear relationship between the absorbency and the content in the range of 10～160 μg.The correlation coefficient was 0.998 7. The relative recovery was 98.40% and RSD was 2.53%.The optimum extraction condition of Ginseng polysaccharides was 1∶10(dry weight:water),100℃,4 h.while the converting factor of polysaccharide in fresh root of Panax ginseng was 1.58.Its polysaccharide content was 18.14g/100 g.ConclusionThis method is simple,accurate and repeatable border="1".

　　Key words：Fresh root of Panax ginseng；  Polysaccharide；  Method of phenol-vitriol

　　人参为五加科植物Panax ginseng C.A.Mey 的干燥根，在我国有着悠久的药用历史，主要含有人参皂苷、人参多糖、人参多肽及挥发油、多种氨基酸、脂肪酸及微量元素等有效成分。人参多糖对机体的免疫功能、造血功能以及在抗肿瘤和降血糖等方面均有较为肯定的药理学作用。由于人参多糖的来源不同，所以同一植物不同的提取方法获得的多糖，甚至人参多糖的不同组分的生物学活性差异甚大［1～5］。
   
　　本实验利用多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖，并迅速脱水生成醛糖衍生物，在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，该衍生物在波长490 nm 处和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系，采用比色法对鲜人参多糖含量进行测定。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料与仪器

　　鲜人参；无水乙醇（AR）；95%乙醇（AR）；硫酸（AR）；苯酚（AR）；葡萄糖（AR）。植物粉碎机，电子天平，DU-7500紫外分光光度计（美国Backman公司），离心机，真空干燥器，恒温水浴，真空冷冻干燥机等。

　　1.2  鲜人参多糖的提取与精制新鲜的鲜人参，植物粉碎机粉碎后，称取适量样品，按浸提比1∶20，在100℃水浴中提取4 h，趁热用布氏漏斗抽滤，浓缩，加3倍体积95%乙醇醇沉，置冰箱24 h，离心20 min（5 000 r/min），沉淀用适量95%乙醇洗涤两遍，真空冷冻干燥，得人参粗多糖。

　　称取一定量人参粗多糖，制成粗多糖质量分数为1%的溶液，采用Sevage法除蛋白，量取水浸浓缩液的体积为V(ml)，向其加入1/5V的氯仿和1/25V的正丁醇，振荡20 min，3 000 r/min的转速下，离心15 min，合并上清液测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复上述操作，直至氯仿层与正丁醇层之间无白色沉淀。

　　将水浸浓缩液倒入下端扎好的截流分子量为6 000～8 000的半透膜袋中，将袋的另一端用绳扎好后，悬挂在盛有水的烧杯里，将烧杯放在磁力搅拌器上，开动搅拌，蒸馏水透析48 h，期间每2h更换一次水，经常更换清水使透析膜内溶液的浓度差加大，并加以搅拌，加快透析速度，除去无机盐、单糖、双糖等小分子杂质。加3倍体积95%乙醇醇沉。沉淀放入真空冷冻干燥机内，冷冻干燥48 h，获得白色固体粉末，干燥即得精制人参多糖。

　　1.2.1  样品溶液的制备

　　精密称取适量样品，分别置具塞三角瓶中，按一定料液比、浸提温度、浸提时间，在热水浴中浸提4 h，用布氏漏斗抽滤，浓缩，浓缩后加3倍体积95%乙醇溶液，静置24 h后，离心，沉淀用蒸馏水溶解，定容至250 ml，即为待测样液。

　　1.2.2  标准曲线的制备

　　精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品1 g，置于100 ml容量瓶中，溶解并稀释至刻度，配成10 mg/ml的标准贮备液，吸上述贮备液1 ml定容至100 ml，配成0.1 mg/ml的工作液。精密移取葡萄糖标准液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 ml于25 ml具塞刻度试管中，加蒸馏水至2.0 ml，再各加5%苯酚溶液1.0 ml摇匀，迅速加入浓H2SO4溶液5 ml，振摇5 min，放置10 min，置沸水浴中加热20 min，取出冷却至室温，于490 nm，以试剂空白为参比测定吸光度。

　　1.2.3  换算因子的测定精密称取干燥至恒重的精致人参多糖5.0 mg［6,7］，加蒸馏水溶解，转移至25 ml容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀得人参多糖储备液；吸取多糖储备液2.0 ml，置于10 ml容量瓶中，加水定容；吸取上述溶液2.0 ml，按标准曲线的绘制方法测定吸光度，同时做空白对照；由回归方程求出此人参多糖储备液中葡萄糖的浓度，并计算其中葡萄糖含量。按下式计算换算因子f：f=m/(c×D×V)，式中m为人参多糖的质量（mg），c为人参多糖储备液中葡萄糖浓度（mg/L），D为人参多糖的稀释倍数，V为体积（ml），测得f=1.58(n=7)。

　　1.2.4  回收率的测定精密称取适量的样品加入标准葡萄糖溶液（10 mg/ml），按照上述方法同时做3个重复，分别测其吸光度，根据葡萄糖的检出量，计算其回收率，结果见表1。

　　回收率（%）=实验测值-样品所含被测成分量/加入纯品量×100%

　　1.2.5  多糖含量的测定［8,9］精密吸取样品液0.2 ml，于具塞刻度试管中，加蒸馏水至2 ml，按照上述步骤操作，同时做3个重复，测得吸光度值，由回归方程计算样品液中葡萄糖浓度（C），按下面公式计算样品液中人参多糖的质量分数。

　　多糖含量（%）=C×D×V×f×10-6 /m×100%

　　式中：C为样品浓度（μg/ml），D为稀释倍数，V为定容体积(ml)，f为换算因子，m为供试样品的质量（g）

　　2  结果与分析

　　2.1  标准曲线的测定结果苯酚-硫酸法测得标准曲线的回归方程：A=0.008+0.012C，r=0.998 7。A为吸光度值，C为葡萄糖含量（μg/ml）。实验表明标准葡萄糖在10～160 μg之间呈良好的线性关系。2.2   回收率的测定结果见表1。表1  多糖的回收结果（略）

　　样品的平均回收率达到98.40%，说明本方法的准确率较高。

　　2.3  多糖含量的测定结果

　　2.3.1  多糖提取条件的确定

　　提取温度的确定：取鲜人参粉末10 g，选浸提比1∶20，浸提时间4 h，浸提温度采用60，80，100℃，趁热抽滤，浓缩，加3倍体积95%乙醇醇沉24 h，沉淀，干燥称重，结果分别为3.4%，4.3%，5.2%。从结果可知，浸提温度为100℃时，所测得的多糖含量最高。

　　料液比的确定：取鲜人参粉末10 g，选浸提温度100℃，浸提时间4h，浸提比采用1∶10，1∶20，1∶50，趁热抽滤，浓缩，加3倍体积95%乙醇醇沉24 h，沉淀，干燥称重，结果分别为5.0%，4.8%，4.1%。从结果可知，料液比为1∶10时，所测得的多糖含量最高。

　　提取次数的确定：取鲜人参粉末10 g，选浸提温度100℃，浸提时间4 h，浸提比采用1∶20， 浸提次数采用1次，2次，3次，趁热抽滤，浓缩，加3倍体积95%乙醇醇沉24 h，沉淀，干燥称重，结果分别为6.3%，6.2%，6.1%。从结果可知，多糖在3次提取中得率没有多大差别，所以综合考虑鲜人参粉末提取1次即可。

　　提取时间的确定：取鲜人参粉末10 g，选浸提比1∶20，浸提温度100℃，浸提时间采用2，3，4 h，趁热抽滤，浓缩，加3倍体积95%乙醇醇沉24 h，沉淀，干燥称重。结果分别为3.5%，4.2%，5.9%。从结果可知，浸提时间为4 h时，所测得的多糖含量最高。