HessenwasrevisedinJanuary2021软琼脂集落形成实验一、目的:确定已转化肿瘤细胞的性质并对其进行定量。二、原理:肿瘤细胞能无限繁殖形成细胞集落,而成熟分化的细胞则不能形成集落。CHO-EGFP和CHO-ECRT39/272细胞在体外无需加刺激因子,可在软琼脂培养基中形成集落,其他细胞则丧失了软琼脂中形成集落的能力。三、操作1.收集对数生长期的细胞(如何鉴定),先测定细胞活力并进行活细胞计数,然后调整细胞浓度,用含20%FBS的DMEM制成1000活细胞/ml的细胞悬液。2.用蒸馏水制备%、%两个浓度的低熔点琼脂糖,高压灭菌后,维持在40℃不会凝固;3.%琼脂糖和2xDMEM等体积混合,6孔板中加入,RT凝固作为底层琼脂,置CO2温箱中备用;4.%琼脂糖和2xDMEM等体积混合,再加入细胞悬液充分混匀,RT凝固作为上层琼脂,勿有气泡,将实验组和对照组分两组加好,盖上盖并作好标记。在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。以上各步骤均在无菌条件下进行。5.然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养。6.培养7~l0天,肉眼观察并计数细胞集落。四、结果:以肉眼可见的细胞团(含500个以上细胞)作为计数集落的
标准
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。集落的计数和计算:集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔,集落形成率=集落数/接种培养细胞总数×100%