审评三部　蒋煜　马磊  张哲峰  张星一

审评三部　蒋煜　马磊 张哲峰 张星一摘要：有关物质是药物质量控制的重要项目。与发达国家相比，国内申请人对头孢菌素有关物质的研究显得比较薄弱。本文对该类抗生素有关物质的产生途径和结构进行了分析，以期引起申请人注意，并进一步重视对该类抗生素有关物质的研究工作，不断提高有关物质研究和控制水平。我们将继续对各具体品种以及各国对该类抗生素有关物质控制的情况进行介绍和分析。关键词：头孢菌素　有关物质　质量控制一、概述　　β-内酰胺抗生素为一类结构中含四元环内酰胺的抗生素，从结构上进行分类，主要包括青霉素类、头孢类等典型的β-内酰胺和非典型内酰胺如青霉烯、氧头孢、碳头孢、单环内酰胺等。　　其中，头孢菌素是该类抗生素中最大的一个分支。自1964年，美国E.Lilly开发成功头孢噻吩以来，四十年间，目前全球已上市了包括第一代到第四代的头孢菌素品种约56种。据日本厚生省统计，日本抗生素市场中头孢菌素占49.34%，口服头孢菌素占口服抗生素的45.2%，注射用头孢菌素占注射用抗生素的53.9%（统计年限不清）。据2004年全国医院用药商情(IMS)统计数据，2004年国内销售的头孢菌素类品种多达36种，销售额达160亿元以上，上亿元的品种有21个，其中十亿元以上的有五个，而实际未统计在内的销售额远不止于此。　　另一方面，头孢菌素目前的申报数量在整个抗生素中也占有相当大的比例。多个厂家申报同一个品种的现象非常普遍。例如，第二代头孢菌素头孢替坦二钠及其制剂即有三十来家申请人。　　与目前的临床应用量相比，以及与某些医药研发发达国家相比，目前国内申请人对于头孢菌素的质量研究，特别是有关物质研究，尚存在一定差距。以纳入中国药典的头孢呋辛钠为例，国外对有关物质研究过程非常细致，并且在质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 中对已知杂质FMA-HACA、反式-CURO、FMA-HACA内酯，以及未明确结构的杂质1、杂质2分别进行了单独控制，在此基础之上对于其他单个杂质以及总杂质进行了单独控制。而国内申请人则研究较为简单，多数参照中国药典列出的色谱条件进行研究，对已知杂质不做分析，在标准中也仅对单个杂质以及总杂质进行质控。　　本文拟结合头孢菌素有关物质可能的引入形式、杂质种类，以及控制方法等进行分析，以期申请人进一步重视对有关物质的研究。二、头孢菌素有关物质的引入途径以及存在形式　　与其他合成药物类似，头孢菌素有关物质的引入形式包括：1、在合成过程中引入（由起始原料、中间体引入，副反应引入）；2、在制剂生产以及保存过程中降解产生（水解、聚合，异构）等。需要注意的是，部分有关物质即可能是在合成反应过程中引入，也可能是在保存中降解产生，还有可能在体内分解产生。如：去乙酰头孢噻肟可同时为头孢噻肟的代谢物和降解产物。2.1　合成过程中引入2.1.1 起始原料以及中间体因素   图1　7-ACA结构2.1.1.1　头孢母核　　由于合成以及精制不完全的原因，部分起始原料可能混入最终产品中。主要包括：头孢菌素的几种主要起始原料7-ACA、7-ADCA，以及将7-ACA碳3位上的乙酰氧甲基用其他侧链取代得到的一系列高级中间体，如GCLE、7-TMCA、7-TDA等。2.1.1.2 C-3位和C-7位的侧链　　包括用于合成头孢噻肟、头孢曲松、头孢地嗪、头孢他美酯等的氨噻肟酸系列中间体，包括氨噻肟酸、AE-活性酯、氨噻肟酸乙酯，去甲氨噻肟酸乙酯等；合成头孢氨苄和头孢羟氨苄的苯甘氨酸以及对羟基苯甘氨酸。研究显示，用于合成头孢哌酮、头孢孟多、头孢替坦、头孢甲肟、头孢替安等的N-甲基硫四唑(MTT)，可能与人血液凝固疾病及戒酒硫样反应有关联。图2　N-甲基硫四唑(MTT)　　对于第一代头孢菌素，如：头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克洛，头孢拉定等，在C-7位侧链引入苄氨基，由后者引入一个新的手性碳原子，苄氨基的纯度直接影响了终产品的纯度。2..1.1.3　各步反应产生的中间体，由于反应不完全或者精制方法等因素而可能引入最终产品中。　　例如：头孢西丁钠，采用7-ACA缩合得到头孢噻吩酸，然后在7-α位引入甲氧基，水解除去保护基后得到头孢西丁。头孢噻吩酸可能混入最终产物中。2.1.1.4　在起始原料以及中间体生产过程中混入的有关物质，也可能随反应引入最终产品中。如混入7-ADCA中的Δ3异构体可能随反应混入最终产物中。 1：7-ADCA△3异构体；2：7-ADCA△2异构体； 3：头孢氨苄△3异构体；4：头孢氨苄△2异构体    图3 头孢氨苄可能含有的杂质2.1.2　副反应引入　　副反应是引入杂质的一个重要因素。　　例如头孢呋辛钠的合成中，可采用氯磺酰异氰酸酯（CSI）对3位羟甲基进行氨甲酰反应。研究显示加入CSI的时间和温度对于7位侧链中肟基构型影响较大，如果滴加时间过程较长，则反式异构体的生成量显著增加。        图4 头孢呋辛钠合成过程中氨甲酰反应　　另外，对于部分C-3位含季铵杂环的第三代或第四代头孢菌素，引入季铵杂环的工艺步骤可产生副反应产物△异构体。文献显示终产物中△异构体含量与合成路线以及合成工艺明显相关。例如在合成头孢吡肟的过程中（如下图所示），母环引入N-甲基吡咯烷的反应可以同时生成△3/△2异构体，其中△3异构体的含量与合成路线是先3位取代后7位酰化或先7位酰化后3位取代、以及反应的具体工艺条件如反应溶剂，反应温度等密切相关。 图5 头孢吡肟合成过程中产生△异构体的可能机制2.2　保存以及制剂生产过程中引入2.2.1　C-3位水解　　在酸性、碱性和中性溶液状态下，C-3位侧链的水解是头孢菌素的主要降解途径之一。在pH值小于4时，这类C-3位降解衍生物迅速分子内环化，生成内酯化合物。当C-3位基团为乙烯基时，如头孢地尼、头孢美唑等，也会与C-4位羧基进行分子内环合，形成五元环内酯。其降解的途径如下：             图6　C-3位水解机理　　3位侧链上的杂环取代基脱落后可形成两部分有关物质：脱取代基头孢残基以及小分子降解物。　　头孢他啶和头孢匹罗，水解分别产生吡啶和2,3-环戊烯吡啶，这些C-3位降解物现已引起越来越多的关注。在头孢他啶质量标准中对吡啶进行了单独控制。　　当R2为N-甲基硫四唑(MTT)基团时，会水解产生MTT，给药后体内也会出现少量MTT的代谢物，如头孢孟多、头孢替坦、头孢甲肟、头孢哌酮、头孢替安等。如2.1.1.2所述，MTT也是上述头孢菌素的合成起始原料。　　　　当R2为乙酰氧甲基、氨基甲酰或类似结构时，水解均可导致乙酰基氧(硫)键断裂，生成脱乙酰基衍生物，如头孢乙腈、头孢匹林、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢来星、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻呋等，如下图所示。Indelicato等用同位素H218O标记的方法，提出在酸性条件下的C-3位水解断裂，不单单存在乙酰基氧(硫)键断裂，其中，约55%～63%的反应是可逆的烷基-氧键断裂，如上图所示。　　　　　           图7　头孢呋辛钠的降解过程2.2.2　开环降解2.2.2.1　一般水解过程　　虽然与青霉素相比，头孢菌素β-内酰胺环中N原子上的未公用电子对与氢化噻嗪环的双键具有共轭体系，增加了稳定性。但是由于其母核上C-3位乙酰氧基是一个较好的离去基团，在固态或者溶液状态下，受酸、碱和酶的催化，容易接受亲核试剂对内酰胺羰基的进攻使C-3位乙酰氧基带负电离去。导致头孢类药物β-内酰胺环开环而失活，发生降解后可引起pH值的降低。如果C-3位连有强吸电子基团或者C-7位侧链酰胺键连接有供电子基团时，可增强内酰胺环受亲核攻击的敏感性。如果C-7位侧链酰胺键连接有吸电子基团，则反应敏感度降低。      图8　亲核试剂导致β-内酰胺环开环机理    图9　头孢唑林的开环过程以及可能产生的有关物质2.2.2.2　侧链参与开环降解反应　　头孢菌素C-7位碳上R1位酰胺键能够发生断裂。C-7位侧链上含α-氨基的头孢菌素，如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克洛等能降解生成哌嗪二酮类降解产物。在碱性环境下（pH8），其水解速率是侧链中无α-氨基的10～20倍，提示可能存在分子内氨基亲核反应机制，开环后经分子内环合，产生2,5-哌嗪二酮衍生物．图10　分子内氨基亲核反应机理  图11　2,5-二酮哌嗪衍生物生成示意图　　具有苯甘氨酸侧链结构的头孢菌素，如头孢克洛、氯碳头孢等。在水溶液状态以及固态下，C-7位侧链的氨基攻击C-6位水解后，形成苯基氨基乙酰-乙醛，然后通过复杂的分子内环化、氧化及羟醛缩合形成2-羟基-3-苯基吡嗪衍生物。       图12　头孢克洛降解形成2-羟基-3-苯基吡嗪衍生物途径　　另外，头孢菌素开环后，可进一步缩合形成噻唑结构。如头孢克洛，在酸性水溶液中，内酰胺环开环，分子内硫原子可对C-3位C进行跨环攻击，导致C-3位氯原子离去，形成了环硫中间体，再而丢失一个质子生成噻唑结构中间体，最终形成了噻唑衍生物。           图13　头孢克洛降解形成噻唑衍生物途径2.2.3　侧链的其他降解反应　　头孢克洛、头孢哌酮钠在C-7位侧链引入手性碳原子后，可形成R或S异构体，其中S异构体的抗菌活性要远远弱于R异构体，BP在头孢哌酮钠杂质栏中列出了S异构体结构，中国药典在头孢哌酮钠含量测定时采用S异构体对照品进行了系统适用性试验。文献还显示，头孢哌酮常有一未知杂质容易被误为认为是S异构体，但是其UV吸收与S异构体不同，可采用二极管阵列检测器进行鉴别或者控制。头孢孟多酯钠C-7位侧链为甲酰氧基-2-苯乙酰氨基，在保存过程中可形成脱甲酰氧基物。2.2.4　△异构化　　部分在C-2位羧酸根酯化形成前体药物的口服头孢菌素，如头孢泊肟酯、头孢呋辛酯，头孢克洛，在保存过程中可能发生△异构现象。有文献认为当头孢菌素在C-2位羧基存在吸电子基团时，容易产生△异构现象，该反应受碱催化，在较高的pH值或者高温条件下更容易发生，而当C-2位为羧酸根时，在相同条件下则不会产生△异构化。有研究利用3-酯头孢唑林进一步对异构化的机理和影响条件进行了研究，并探讨了可能的降解途径，如下图所示。另有文献讨论了几种口服头孢菌素前体药物在口服后在体内发生△异构化导致生物利用度降低的现象。另外文献显示对于头孢克洛，除6，7位结构外，△异构体是头孢克洛在固态下的主要降解产物。　　关于头孢菌素△异构化产生以及质控的详细情况，可见本文作者于2006年在第三届药品技术审评研讨会论坛上的文章《β-内酰胺抗生素△异构体研究》。 2.2.5　差向异构化　　头孢菌素的6,7位碳为6R、7R构型，多数头孢菌素存在6R、7S型差向异构体，有文献认为在碱性条件下更容易产生差向异构化。另外，在头孢地尼中尚产生了6S、7R型差向异构体，未发现其他头孢菌素存在该类异构体。2.2.6　顺反异构化　　部分第三代、第四代头孢菌素，具有顺式甲氧亚氨基以及类似结构，如头孢噻肟、头孢唑肟、头孢甲肟、头孢曲松、头孢唑喃、头孢他啶、头孢克肟、头孢匹罗、头孢吡肟，头孢唑兰，以及单环类β－内酰胺氨曲南等等。研究显示该顺式甲氧亚氨基结构对于抗菌活性起着重要作用，如头孢噻肟（顺式结构）抗菌活性要比反式结构强40～100倍。在某些情况下，可能降解生成反式异构体。研究显示某些顺式异构体对紫外光敏感，如头孢噻肟钠水溶液（2×10-3m），254nm紫外光照射45分钟有50％降解，4小时后损失95％，感光降解产物主要是反式异构体。中国药典纳入的头孢曲松即采用将其在紫外线照射24小时后产生反式异构体进行系统适用性试验。            图15　头孢曲松在紫外线照射后产生反式异构体2.2.7　酯的水解　　为适宜于口服，某些头孢菌素以前药形式存在，如头孢呋辛酯，头孢替安酯、头孢泊肟酯，头孢托仑酯等在C-2位羧基形成酯键前药。另外，头孢孟多酯钠，在给药后，药物受酯酶水解脱去羧基侧链形成活性成分。这些前体药物在某些条件下可水解成为活性成分。2.2.8　其他　　头孢菌素的降解反应还包括5位硫原子氧化为亚砜，C-2位羧基氧化为羰基或者脱落，等等。三、实例　　英国药典头孢克洛中纳入的杂质及其结构 四、小结   上文初步分析了头孢菌素产生有关物质的不同途径以及可能的结构。由于头孢母核发酵技术以及头孢菌素合成工艺的不断完善，在生产过程中产生的杂质越来越能得到控制，对产品中的有关物质含量控制也越来越趋于严格。比如，盐酸头孢吡肟，美国药典对杂质A和杂质B（分别为E异构体和△异构体）的控制分别为不超过0.3%和0.2%，其他有关物质控制不超过0.1%。JP14对盐酸头孢吡肟总杂质的控制为不超过0.5%。　　另一方面，随着分析技术的不断提高，对有关物质结构及可能产生原因的认识也越来越深入，也有助于不断提高对有关物质的控制。参考文献：1、陈兆坤,胡昌勤.头孢菌素类抗生素的降解机制.国外医药抗生素分册,2004,25(6),249.2、胡敏,胡昌勤.LCMS鉴定头孢菌素降解物结构.药物分析杂志,2005,25(3),369.3、何锡文,唐波.头孢氨苄降解产物荧光性质的研究及分析应用.高等学校化学学报,1995,16(1),26.4、李启隆,陈寿爱.头孢噻肟钠的降解及其产物伏安行为的研究.高等学校化学学报,1994,15(3),339.5、丁莉霞,陈玉英.色谱优化法分离头孢唑啉钠及其相关物质.药物分析杂志,1995,15(1),3.6、《高效液相色谱法在抗生素质控分析中的应用》胡昌勤等人著7、EP20048、USP28