细菌提取方法

细菌DNA提取方案金葡菌细胞壁厚,不容易破壁.下面我提供几个方法.希望对你有些参考DNA提取的几种方法.浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者别离,常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提居到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细月破碎液除去RNP再以IMNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比拟,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA时,参加适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的别离.在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中参加柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA..阴离子去污剂法：用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键名^合,由于阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA..苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子外 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相.离心分层后取出水层,屡次重复操作,再合并含DNA的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNAo此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出.此法的特点是使提取的DNA保持天然状态..水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中参加固体氯化钠调节至2.6M.参加2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%?80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中枯燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改进,在提取过程中参加SDS.NaCVCTAB法,我一直,比拟好用,至少做PCR时没有问题.试剂的配制?Tris?Cl(1M,100ml):12.11gTris碱溶于80mlddH2O中,力口4.2ml浓盐酸,调pH至8.0.最后定容到100ml.?EDTA(0.5M,100ml):18.61gNa2EDTA?2H2O溶解在700mlddH2O中,用10MNaOH调pH至8.0,定容至100ml.?TE缓冲液(pH8.0):10mMTris?Cl(pH8.0)、1mMEDTA(pH8.0).在98.8mlddH2O中参加1mlTris?Cl(1M,pH8.0),0.2mlEDTA(0.5MpH8.0).?HCl(1M):91.38mlddH2O中力口入8.62ml浓盐酸.?NaOH(10M)?10%SDS10gSDS溶在60ml水中,加热搅拌助溶.定容至100ml.?NaCl(5M)?CTAB/NaCl80mlH2O中溶解4.1gNaCl,缓慢参加CTAB10g,加热搅拌,定容至100ml.?酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)?氯仿：异戊醇(24:1)?70%乙醇步骤：1:5ml细菌培养至饱和状态,取1.5ml培养物离心2min；2:沉淀物参加567ulTE反复吹打.力口30ul1%SDS和3^l20mg/ml的proteinaseK,混匀,37c水浴1h;3:力口100ul5MNaCl混匀,再参加80lCTAB/NaCl混匀.65c水浴10min；4:参加等体积(720口的氯仿/异戊醇,混匀,离心4-5min,上清液转入一新管；5:参加等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,离心5min,上清液转移至一新管；6:参加0.6体积的异丙醇,轻混,沉淀DNA30min,13000rpm15min,弃上清；7:参加1ml70%乙醇洗涤DNA;8:离心5min,弃上清,枯燥,溶于40lTEK细菌DNA提取方案：革兰氏阴性菌,如E.coli,一般有三种可以选择的方法.一、水煮模板法一一主要用于PCR反响1、接种单菌落于LB或脑心平板,连续画线,37摄氏度培养18—24小时.2、刮取1〜2接种环菌苔参加150微升三蒸水中,混匀,100摄氏度煮沸10分钟.3、12000转/分钟离心10分钟,取上清,—20摄氏度保存备用.操作最简便,对试剂条件要求低.缺点是纯度不够高,可能会含有RNA、蛋白等杂质.但是作为一般检测目的的PCR反响模板已经足够了.有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版,编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段.编者建议：此法得到的模版保存时间短,强烈建议每月重新制作一次.二、CTAB/NaCl法1、接种一单菌落于5mlLB中,30C培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100m12%LB中,37C、220r/min培养16小时；3、5000r/min离心10分钟,弃去上清.4、参加10m1TE离心洗涤后,用10m1TE溶解菌体,混匀,-20C保存备用.5、取3.5ml菌悬液,参加184心l10%SDS,混匀,参加37心l10mg/ml蛋白酶K,混匀,37C温育1小时6、参加740心l5mol/LNaCl,再参加512心lCTAB/NaCl,混匀,65C温育10分钟.7、参加等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保存上清.8、上清中参加等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24：1),混匀,10000r/min离心5分钟,保存上清.9、参加0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀.10、用1mlTE溶解DNA,参加终浓度为20心g/mlRNaseA,4c保存.CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高,蛋白杂质较少,保存时间长,编者更喜欢把终浓度为20gg/mlRnaseA加在第5步温育的时候,这样最后没有RnaseA污染.每一步操作细致一些,得到的DNA可用于Southernblot.编者建议：长时间保存DNA可放于-20C,但要尽量减少反复冻融,否那么影响DNA质量.三、盐析法1、1.5ml对数期菌液2、12000rpm30s3、200ul裂解液(同CTAB/NaCl法),37c,1hr4、66ul5MNaCL,混匀充分,12000rpm10min5、上清用粗枪头取至新管6、等体积酚充分混匀,12000rpm3min,反复抽提至无蛋白层7、取水层,等体积氯仿混匀,12000rpm3min8、上清至新管,2倍体积预冷无水乙醇9、-20C,20min,14000rpm,15min10、400ul70%冷乙醇洗涤11、枯燥,100ul20ug/mlRNaseA,37C,30min12、2倍体积无水乙醇沉淀,70%冷乙醇洗涤13、枯燥,溶于100ulTE介于方法一和方法二之间,CTAB虽然取出糖分效果较好,但CTAB本身也是有毒的,所以此方法放弃了CTAB.革兰氏阳性菌,由于细胞壁的结构与阴性菌有差异,裂解比阴性菌稍微麻烦一些,可以采取CTAB/NaCl法稍加修改,在第四步参加终浓度2mg/ml的溶菌酶,37度温育1h.实验注意：提基因组最好要将枪头尖剪掉〔剪掉以后在酒精灯上迅速过一下,使其断口圆滑〕.以免枪头损伤基因组！抽干时最好是风干！