Waters液相分析方法开发

©2011WatersCorporation2内容内容内容内容�介绍—进行 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 开发的途径—系统性方法开发�影响选择性的主要因素—固定相—有机溶剂—流动相pH值—流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法�系统性方法开发策略—雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方法开发实例�沃特世HPLC色谱柱产品©2011WatersCorporation3内容内容内容内容�介绍—进行方法开发的途径—系统性方法开发�影响选择性的主要因素—固定相—有机溶剂—流动相pH值—流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法�系统性方法开发策略—雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方法开发实例�沃特世HPLC色谱柱产品©2011WatersCorporation4方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性�质量研究方法开发工作贯穿于整个药物开发项目过程中—样品的复杂程度各异—工作繁复冗余�方法开发耗时耗力、成本不菲—加速流程才能尽早将产品带入市场—提速色谱方法将提高项目收益率©2011WatersCorporation5方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤©2011WatersCorporation6�根据分析物的化学性质选配色谱条件—基于既往经验及思考进行合理猜测—通常辅以资料参考—询问同事�“步进式”测试开发—基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行�系统性筛选策略—先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试o评估结果，选择最有效的条件组合—再进行方法优化o梯度/温度色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路©2011WatersCorporation7色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱流动相溶剂流动相溶剂流动相溶剂流动相溶剂流动相流动相流动相流动相pHααααSelectivity液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段αααα分离选择性分离选择性分离选择性分离选择性©2011WatersCorporation8内容内容内容内容�介绍—进行方法开发的途径—系统性方法开发�影响选择性的主要因素—固定相—有机溶剂—流动相pH值—流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法�系统性方法开发策略—雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方法开发实例�沃特世HPLC色谱柱产品©2011WatersCorporation9影响分离度的因素影响分离度的因素影响分离度的因素影响分离度的因素选择性最为重要选择性最为重要选择性最为重要选择性最为重要11+−kkαα4N=RsMaximizedinUPLCSeparationsby:�Rangeofcolumnchemistries�Multipleparticlesubstrates�WideusablepHrange[BEH]�Highretentivity[HSS]�Widerangeinselectivity[CSH]MaximizedinUPLCSeparationsby:�Ultra-lowdispersionsystem�Small[<2µm]particles�Higherpressurecapability�Well-designedcolumnsPhysicalChemicalImpactonResolutionDoubleNDoublekDoubleαααα%Improvement20–40%15–20%>400%©2011WatersCorporation10©2011WatersCorporation11直观图 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 显示直观图表显示直观图表显示直观图表显示pH7pH7pH7pH7选择性选择性选择性选择性（（（（RPRPRPRP））））(ln[k]acenaphthene)YMC-Pack™ODS-A™YMCJ'sphere™ODS–H80ACQUITYUPLC®BEHXBridge™C18Hydrophobicity062010SunFire™C18YMC-Pack™PolymerC18™Hypersil®CPSCyanoYMC-Pack™CNWatersSpherisorb®S5PACQUITYCSH™XSelectCSH™Fluoro-PhenylNova-Pak®PhenylYMC-Pack™PhenylHypersil®PhenylInertsil®Ph-3YMC-Pack™ProC4™YMCbasic™Symmetry®C8YMC-Pack™ProC8™Nova-Pak®C8XTerra®MSC18Symmetry®C18YMC-Pack™ProC18™Inertsil®ODS-3Nova-Pak®C18YMCJ'sphere™ODS–L80Nucleosil®C18WatersSpherisorb®ODS2WatersSpherisorb®ODS1Resolve®C18µBondapak™C18YMC-Pack™ODS–AQ™YMCJ'sphere™ODS–M80Inertsil®CN-3WatersSpherisorb®S5CNNova-Pak®CNHPSymmetryShield™RP8SymmetryShield™RP18XTerra®RP8XTerra®RP18-0.6-0.300.30.60.91.21.51.82.12.42.733.33.6-1.5-0.50.51.52.53.5(ln[α]amitriptyline/acenaphthene)XTerra®MSC8Luna®C18(2)XTerra®PhenylLuna™PhenylHexylChromolithTMRP-18Atlantis®dC18Zorbax®XDBC18ACTAce®C18Zorbax®SBC18SunFire™C8Luna®C8(2)ACQUITYUPLC®BEHXBridge™ShieldRP18ACQUITYUPLC®BEHXBridge™C8ACQUITYUPLC®BEHXBridge™PhenylAtlantis®T3ACQUITYUPLC®HSST3HSSHPLCT3ACQUITYUPLC®HSSC18HSSHPLCC18ACQUITYUPLC®HSSC18SBHSSHPLCC18SB沃特世提供10种不同反相UPLC/HPLC柱固定相，覆盖广泛范围下的选择性和疏水性SelectivityACQUITYCSH™XSelectCSH™C18ACQUITYCSH™XSelectCSH™Phenyl-HexylHypersil®BDSPhenylSilanolActivity©2011WatersCorporation12沃特世色谱柱选择性图表工具沃特世色谱柱选择性图表工具沃特世色谱柱选择性图表工具沃特世色谱柱选择性图表工具©2011WatersCorporation13考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型�利用一组性质不同的参考化合物在不同色谱柱上进行实验,以找出不同实验因素(色谱柱、溶剂和pH)对分离选择性影响的一般规律—4.6x100mm,3.5µm色谱柱—AmmoniumFormate(甲酸铵缓冲液),pH3—AmmoniumBicarbonate(碳酸氢铵缓冲液),pH10—Methanol—Acetronitrile—使用10至90%溶剂的15分钟梯度—柱流速1.4mL/min—仪器为WatersAlliance®2695HPLC连接2996PDA和Micromass®Quattromicro™©2011WatersCorporation1412.Octanophenone(N)MW204.35.1-Pyrenesulfonicacid(A)MW304.3参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构::I.I.有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质10.Diclofenac(WA)MW318.1NHO-OClClNa+11.Dinoseb(A)MW240.2N+N+O-O-OOOHCH3CH31.GentisicAcid(A)MW154.1OOHOHOH8.Flavone(N)MW222.2OO©2011WatersCorporation15NCH3CH3NHOHOHOHCH33.Ritodrine(B)MW287.4NNCH3OCH3OHH4.Hydroquinidine(B)MW204.37.Amitriptyline(B)MW277.46.Imipramine(B)MW280.42.Caffeine(WB)MW194.2NNNNOOCH3CH3CH3NNCH3CH3ON9.4-Dimethylamino-benzophenone(WB)MW225.3参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构:II.碱性物质碱性物质碱性物质碱性物质©2011WatersCorporation16SunFire™C8SunFire™C182135476981110122,1354769,1081112分离选择性差异分离选择性差异分离选择性差异分离选择性差异SunFire™C8与与与与SunFire™C18相同基质颗粒上的C8和C18间分离选择性的差异微小.C8对某些化合物的保留比C18小些.1.GentisicAcid(A)2.Caffeine(WB)3.Ritodrine(B)4.Hydroquinidine(B)5.1-Pyrenesulfonicacid(A)6.Imipramine(B)7.Amitriptyline(B)8.Flavone(N)9.4-Dimethylaminobenzophenone(WB)10.Diclofenac(WA)11.Dinoseb(A)12.Octanophenone(N)低低低低pH,乙腈乙腈乙腈乙腈©2011WatersCorporation17相同基体不同键合相的分离选择性差异相同基体不同键合相的分离选择性差异相同基体不同键合相的分离选择性差异相同基体不同键合相的分离选择性差异:XBridge™Phenyl与与与与C18和和和和ShieldRP18间的比较间的比较间的比较间的比较XBridge™ShieldRP18XBridge™C18XBridge™Phenyl我们可以观察到当固定相配基类型发生改变时，分离选择性有显著变化。苯基柱对三环类抗忧郁剂（峰6和7）的保留能力比在C18柱上还要强。Jenkins,Diehl低低低低pH,乙腈乙腈乙腈乙腈135672489,10111210986451171321213674,5821091112©2011WatersCorporation182,1354769,10811122354769,10811121不同基体不同基体不同基体不同基体C18柱间的分离选择性差异柱间的分离选择性差异柱间的分离选择性差异柱间的分离选择性差异:硅胶柱与杂化颗粒柱硅胶柱与杂化颗粒柱硅胶柱与杂化颗粒柱硅胶柱与杂化颗粒柱SunFire™C18XBridge™C18硅胶颗粒与杂化颗粒基体材料的不同亦会带来些许的分离选择性的差异pH3,乙腈乙腈乙腈乙腈©2011WatersCorporation19色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱流动相流动相流动相流动相pHααααSelectivity液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段αααα分离选择性分离选择性分离选择性分离选择性流动相溶剂流动相溶剂流动相溶剂流动相溶剂©2011WatersCorporation20不同溶剂的特性不同溶剂的特性不同溶剂的特性不同溶剂的特性不同溶剂的特性不同溶剂的特性不同溶剂的特性不同溶剂的特性�甲醇—氢键作用中的质子供给者—较低的洗脱强度—相对较高的柱压�乙腈—氢键作用中的质子接受者—中等洗脱强度—粘度最低（柱反压最低）©2011WatersCorporation21甲醇甲醇甲醇甲醇、、、、乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异甲醇甲醇甲醇甲醇、、、、乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异切换溶剂时可观察到明显的分离选择性移动；乙腈表现为更强的洗脱溶剂；将乙腈和甲醇混合可进行分离选择性的微调.XBridge™ShieldRP18100%甲醇甲醇甲醇甲醇100%乙腈乙腈乙腈乙腈低pH1:1乙腈乙腈乙腈乙腈:甲醇甲醇甲醇甲醇1243562879610121189101110,1112128,91672344315,75©2011WatersCorporation22色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱ααααSelectivity液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段αααα分离选择性分离选择性分离选择性分离选择性流动相溶剂流动相溶剂流动相溶剂流动相溶剂流动相流动相流动相流动相pH©2011WatersCorporation23流动相流动相流动相流动相pHpHpHpH对保留与选择性的影响对保留与选择性的影响对保留与选择性的影响对保留与选择性的影响�影响带有可离子化官能团的分析物—胺—羧基—酚�有些化合物含有一个以上的可离子化官能团�改变流动相pH将使选择性发生极大改变©2011WatersCorporation24流动相流动相流动相流动相pH3和和和和pH10条件下分离选择性比较条件下分离选择性比较条件下分离选择性比较条件下分离选择性比较pH3pH10235476,98111211023547698,1112101,对有机酸碱混合物,流动相缓冲pH改变所带来的分离选择性变化最为强烈!Jenkins,DiehlXBridge™ShieldRP18中性物质(峰8和12)完全未见移动©2011WatersCorporation25酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大中性化合物的保留不受pH影响SilicapHRangeHybridParticlepHRangeNeueet.al.AmericanLaboratory1999(22)36-39.pHpHpHpH对保留的影响对保留的影响对保留的影响对保留的影响::::反相保留图反相保留图反相保留图反相保留图pH0510152025303540024681012RetentionFactor(k)酸性碱性中性化合物碱性保留增强[B]酸性保留增强[HA]©2011WatersCorporation26012345678910111213140123456789101112pHCapacityFactor(k)AcidBaseNeutral反相保留图0123pH2BAN将保留图关联至色谱分离效果图将保留图关联至色谱分离效果图将保留图关联至色谱分离效果图将保留图关联至色谱分离效果图©2011WatersCorporation27012345678910111213140123456789101112pHCapacityFactor(k)Neutral01230123pH5pH2BA,BANNAcidBase反相保留图将保留图关联至色谱分离效果图将保留图关联至色谱分离效果图将保留图关联至色谱分离效果图将保留图关联至色谱分离效果图©2011WatersCorporation28012345678910111213140123456789101112pHCapacityFactor(k)Neutral012301230123pH10pH5pH2BBA,BAANNNMinutesNote:pHisapowerfulselectivitytoolAcidBase反相保留图将保留图关联至色谱分离效果图将保留图关联至色谱分离效果图将保留图关联至色谱分离效果图将保留图关联至色谱分离效果图©2011WatersCorporation29ByvaryingpH,basesarenowseparated–pHisapowerfultoolinmethodsdevelopmentforselectivitypH2pH10B1,B2NApH0.111010002468101214(Logk)Acid[HA]NeutralBase1[B1]Bases1+2[BH1+,BH2+]Acid[A-]Base2[B2]ANB1B2调节调节调节调节pHpHpHpH使分离最大化使分离最大化使分离最大化使分离最大化©2011WatersCorporation30pH0.111010002468101214(Logk)Acid[HA]NeutralBase1[B1]Bases1+2[BH1+,BH2+]Acid[A-]Base2[B2]趋近趋近趋近趋近pKapKapKapKa值时方法耐受性较差值时方法耐受性较差值时方法耐受性较差值时方法耐受性较差此范围内保留重现性变得较差，原因在于靠近pKa时的“坡度”较陡（小的pH改变�保留时间改变大）©2011WatersCorporation31pH0.111010002468101214(Logk)Acid[HA]NeutralBase1[B1]Bases1+2[BH1+,BH2+]Acid[A-]Base2[B2]在方法开发中寻找合适选择性时pH是极为有利的工具，但是，一旦趋近分析物pKa时，pH的精确控制就变得十分重要B1NAB2pH5.5NA,B1B2pH6.0趋近趋近趋近趋近pKa值时方法耐受性较差值时方法耐受性较差值时方法耐受性较差值时方法耐受性较差©2011WatersCorporation320.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH5.01230.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH5.4312pH5.20.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00132pH5.61320.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00Grumbach,DiehlConditionsColumn:XTerra®RP184.6x100mm,5µmMobilePhaseA:20mMAmmoniumAcetate(pH5.0to5.8)or20mMAmmoniumBicarbonate(pH6.8to7.0)MobilePhaseB:ACNFlowRate:0.5mL/minIsocraticMobilePhaseComposition:40%A;60%BInjectionvolume:10µLTemperature:30oCDetection:UV@230nmInstrument:AllianceTM2690,996PDACompounds1.p-Toluamide-neutral2.Lidocaine–base(pKa=7.9)3.Ibuprofen-acid(pKa=4.4)如方法开发时设定于pH=5.0则方法重现会存在较高风险—要求严格的pH控制以维持分离不变实例实例实例实例::::随随随随pHpHpHpH改变导致保留选择性的严重改变改变导致保留选择性的严重改变改变导致保留选择性的严重改变改变导致保留选择性的严重改变©2011WatersCorporation330.111010002468101214(Logk)Acid[HA]NeutralBase1[B1]Bases1+2[BH1+,BH2+]Acid[A-]Base2[B2]要获得好的重现性要获得好的重现性要获得好的重现性要获得好的重现性pHpHpHpH条件条件条件条件：：：：偏离分析物偏离分析物偏离分析物偏离分析物pKapKapKapKa值值值值±±±±2222进入保留曲线平台区，保留的重现性得以增强（即使pH改变较大–保留时间改变仍较小）-2+2-2+2pH在分析物pKa±2以外的pH范围内，方法重现性/耐受性较好©2011WatersCorporation34�林可霉素盐酸盐Lincomycinhydrochloride(pKa7.6)—是多年来广泛使用的人、畜用抗生素，高效杀灭革兰阳式病菌�美国药典USP方法–存在峰形不佳/杂质检测灵敏度不足的情况—使用C8柱,4.6x250mm,5µm—流动相缓冲液为H3PO4用氨水调至pH6，流动相溶剂为乙腈加甲醇（混合溶剂）—UV检测波长为210nm(因缺乏生色基团)方法开发中选择流动相缓冲方法开发中选择流动相缓冲方法开发中选择流动相缓冲方法开发中选择流动相缓冲方法开发中选择流动相缓冲方法开发中选择流动相缓冲方法开发中选择流动相缓冲方法开发中选择流动相缓冲pHpH值的重要性值的重要性值的重要性值的重要性值的重要性值的重要性值的重要性值的重要性::实例实例实例实例实例实例实例实例OHOHAdmin高亮©2011WatersCorporation35用用用用用用用用USPUSP方法分析林可霉素样品的效果方法分析林可霉素样品的效果方法分析林可霉素样品的效果方法分析林可霉素样品的效果方法分析林可霉素样品的效果方法分析林可霉素样品的效果方法分析林可霉素样品的效果方法分析林可霉素样品的效果色谱条件色谱条件色谱条件色谱条件:色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱:Symmetry®C84.6x250mm,5µm流动相流动相流动相流动相A:100mMPhosphoricacid/ammoniumhydroxide,pH6流动相流动相流动相流动相B:Acetonitrile流动相流动相流动相流动相C:Methanol流动相流动相流动相流动相D:Water等度分离条件等度分离条件等度分离条件等度分离条件:20%A:13.9%B:13.9%C:52.2%D柱流速柱流速柱流速柱流速:1mL/min进样量进样量进样量进样量:20µL@20mg/mLinwater柱温柱温柱温柱温:46oC检测检测检测检测:UV@215nmLincomycin分析：由于林可霉素在较低的波长下才有紫外吸收，而甲醇的截止波长为210nm，选用混合溶剂的流动相会产生较大的本底吸收；另一方面，从图谱分析，林可霉素的峰形不好。©2011WatersCorporation36在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离pHpH色谱条件分析柱:XBridge™C183.0x100mm,3.5µm流动相A1:100mM磷酸钾缓冲液pH2流动相A2:100mM磷酸钾缓冲液pH7流动相A3:100mM磷酸钾缓冲液pH12流动相B:Acetonitrile流动相C:Water流速:0.6mL/min梯度程序:时间梯度组成(min)%A%B%C0.02057515.0205030柱温:30oC进样体积:20µL@30mg/mLinwater检测波长:UV@215nm仪器:WatersAlliance®2695with2996PDA新方法以取得对杂质的低检测限为宗旨注：磷酸盐系列缓冲液挥发性差，故不适合用于LC/MS联机的场合在低UV检测波长下使用甲醇做流动相不合适©2011WatersCorporation37pHpH探索性实验结果一览探索性实验结果一览探索性实验结果一览探索性实验结果一览探索性实验结果一览探索性实验结果一览探索性实验结果一览探索性实验结果一览pH2pH7pH12峰形差柱超载低保留–分析物已完全离子化对杂质的分离效果很差最佳峰形最佳保留–分析物呈完全电中性状态最佳分离峰形有所改善保留较好–50%离子化状态仍存在杂质分离不完全的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 方法优化的方法优化的方法优化的方法优化的最佳选择最佳选择最佳选择最佳选择！！！！Jenkins,Diehl©2011WatersCorporation38经优化后的梯度分离情况经优化后的梯度分离情况经优化后的梯度分离情况经优化后的梯度分离情况经优化后的梯度分离情况经优化后的梯度分离情况经优化后的梯度分离情况经优化后的梯度分离情况绝佳的柱容量绝佳的柱容量绝佳的柱容量绝佳的柱容量大大改善的分离度大大改善的分离度大大改善的分离度大大改善的分离度优异的峰形优异的峰形优异的峰形优异的峰形Lincomycin7.3%1.1%0.25%色谱条件色谱条件色谱条件色谱条件分析柱分析柱分析柱分析柱:XBridge™C183.0x100mm,3.5µm流动相流动相流动相流动相A:100mM磷酸钾缓冲液磷酸钾缓冲液磷酸钾缓冲液磷酸钾缓冲液pH12流动相流动相流动相流动相B:Acetonitrile流动相流动相流动相流动相C:Water流速流速流速流速:0.6mL/min梯度程序梯度程序梯度程序梯度程序:时间时间时间时间梯度组成梯度组成梯度组成梯度组成(min)%A%B%C0.020156515.0203545柱温柱温柱温柱温:30oC进样体积进样体积进样体积进样体积:20µL@30mg/mLinwater检测波长检测波长检测波长检测波长:UV@215nm©2011WatersCorporation39XBridgeXBridge™™CC1818高高高高高高高高pHpH值柱寿命测试值柱寿命测试值柱寿命测试值柱寿命测试值柱寿命测试值柱寿命测试值柱寿命测试值柱寿命测试pH12pH12磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液//柱温为柱温为柱温为柱温为柱温为柱温为柱温为柱温为3030ooCC进样进样进样进样2次后次后次后次后进样进样进样进样400次后次后次后次后进样进样进样进样650次后次后次后次后出峰顺序出峰顺序出峰顺序出峰顺序:PropranololDiphenhydramineNortriptylineAcenaphthene色谱条件色谱条件色谱条件色谱条件分析柱分析柱分析柱分析柱:4.6x150mm,5µm等度流动相组成等度流动相组成等度流动相组成等度流动相组成:10%A;37%B;53%CA:200mMK3PO4(pH12)in80:20H2O:ACNB:H2OC:ACN柱流速柱流速柱流速柱流速:1.0mL/min分析分析时间分析分析时间分析分析时间分析分析时间:20min进样体积进样体积进样体积进样体积:10µL温度温度温度温度:30oC检测器检测器检测器检测器:UV@254nm仪器仪器仪器仪器:WatersAlliance®2695唯有在第二代杂化颗粒柱上才可享受仅用磷酸缓冲系统就可在低、中、高pH下完成方法开发的灵活性！©2011WatersCorporation40AU-Minutes051520AUMinutes051520第第第第2针针针针第第第第40针针针针某某某某C18色谱柱高色谱柱高色谱柱高色谱柱高pH柱寿命测试柱寿命测试柱寿命测试柱寿命测试pH12磷酸盐缓冲溶液磷酸盐缓冲溶液磷酸盐缓冲溶液磷酸盐缓冲溶液,30oC色谱条件色谱条件色谱条件色谱条件分析柱分析柱分析柱分析柱:4.6x150mm,5µm等度流动相组成等度流动相组成等度流动相组成等度流动相组成:10%A;37%B;53%CA:200mMK3PO4(pH12)in80:20H2O:ACNB:H2OC:ACN柱流速柱流速柱流速柱流速:1.0mL/min分析分析时间分析分析时间分析分析时间分析分析时间:20min进样体积进样体积进样体积进样体积:10µL温度温度温度温度:30oC检测器检测器检测器检测器:UV@254nm仪器仪器仪器仪器:WatersAlliance®2695该C18色谱柱号称能耐受pH1-12©2011WatersCorporation41使用使用使用使用使用使用使用使用pH12pH12的磷酸盐缓冲体系的磷酸盐缓冲体系的磷酸盐缓冲体系的磷酸盐缓冲体系的磷酸盐缓冲体系的磷酸盐缓冲体系的磷酸盐缓冲体系的磷酸盐缓冲体系进行方法开发时的注意事项进行方法开发时的注意事项进行方法开发时的注意事项进行方法开发时的注意事项进行方法开发时的注意事项进行方法开发时的注意事项进行方法开发时的注意事项进行方法开发时的注意事项�中等pH尤其是高pH磷酸盐缓冲盐会腐蚀柱填料颗粒。pH12的磷酸盐缓冲液只有在绝对需要时，例如在进行低UV波长检测或者有机碱分析物的pKa大于10时，方才 建议 关于小区增设电动车充电建议给教师的建议PDF智慧城市建议书pdf给教师的36条建议下载税则修订调整建议表下载 使用。�在通常的UV检测波长范围内（例254nm)，有许多对填料颗粒腐蚀性很小的高pH缓冲系统可供使用，包括碳酸氢铵、三乙胺、氨水等都可方便地提供pH在9-11之间的良好缓冲能力�在绝对需要使用到pH12的磷酸盐缓冲液的场合，需要注意如下事项：—柱温务必保持在30oC以下—保持柱上缓冲液浓度在5to10mM之间—注意当流动相中含有高组份的有机溶剂时，磷酸盐可能会在柱上和仪器管线内析出。可预先在烧杯内做流动相混合试验观察有无沉淀生成。—缓冲液一定要预先过滤—使用保护柱可增加分析柱的寿命Admin高亮Admin高亮©2011WatersCorporation42实用实用实用实用pHpHpHpH范围指导范围指导范围指导范围指导用于方法开发用于方法开发用于方法开发用于方法开发�对于新的方法开发，使用水相pH值为：—pH2-3用于酸性分析物—pH9-10用于碱性分析物�在这些pH条件下，当于有机相混合时，大多数分析物都会处于未电离状态—因此能获得更好更重现的保留�还要考虑：—未电离分析物的疏水性—固定相对pH的耐受性©2011WatersCorporation43内容内容内容内容�介绍—进行方法开发的途径—系统性方法开发�影响选择性的主要因素—固定相—有机溶剂—流动相pH值—流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法�系统性方法开发策略—雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方法开发实例�沃特世HPLC色谱柱产品©2011WatersCorporation44进行进行进行进行进行进行进行进行LCLC方法开发前需要了解的信息方法开发前需要了解的信息方法开发前需要了解的信息方法开发前需要了解的信息方法开发前需要了解的信息方法开发前需要了解的信息方法开发前需要了解的信息方法开发前需要了解的信息�样品的溶解度�样品中待分析物的数目—您需要分开多少个峰？�官能团;待分析物有怎样的差别？—是否有可离子化的官能团？流动相pH值对色谱行为会有怎样的影响?�检测条件—需要什么样的检测技术？什么检测器类型？�待分析物在样品中的浓度范围，定量要求�是否有基质干扰？Admin高亮©2011WatersCorporation45使用系统性方法开发策略使用系统性方法开发策略使用系统性方法开发策略使用系统性方法开发策略使用系统性方法开发策略使用系统性方法开发策略使用系统性方法开发策略使用系统性方法开发策略T3Admin高亮©2011WatersCorporation46实验条件一览实验条件一览实验条件一览实验条件一览实验条件一览实验条件一览实验条件一览实验条件一览实验条件分析柱:4.6x100mm,3.5µmXBridge™C18XBridge™ShieldRP18XBridge™PhenylSunFire™C18Atlantis®T3流动相A1:200mMAmmoniumBicarbonate,pH10流动相A2:200mMAmmoniumFormate,pH3流动相B1:Methanol流动相B2:Acetonitrile流动相C:Water柱流速:1.4mL/min梯度:时间组成(min)%A%B%C0.01058515.010900柱温:30oC检测:210-400nmUV或质谱(扫描100-500amu)仪器系统:WatersAlliance®2695配置2996PDA和Micromass®Quattromicro™在保留曲线的平滑区开发方法可在保留曲线的平滑区开发方法可在保留曲线的平滑区开发方法可在保留曲线的平滑区开发方法可得到最佳的方法重现性和耐用性得到最佳的方法重现性和耐用性得到最佳的方法重现性和耐用性得到最佳的方法重现性和耐用性柱温需恒定柱温需恒定柱温需恒定柱温需恒定使用质谱可迅速鉴定得到的色谱峰及其纯度使用质谱可迅速鉴定得到的色谱峰及其纯度使用质谱可迅速鉴定得到的色谱峰及其纯度使用质谱可迅速鉴定得到的色谱峰及其纯度；；；；液相系统需要控制至少四路流体的能力液相系统需要控制至少四路流体的能力液相系统需要控制至少四路流体的能力液相系统需要控制至少四路流体的能力。。。。©2011WatersCorporation47影响柱效影响柱效影响柱效影响柱效影响柱效影响柱效影响柱效影响柱效((塔板数塔板数塔板数塔板数塔板数塔板数塔板数塔板数))的因素的因素的因素的因素的因素的因素的因素的因素dpLN∝柱效柱效柱效柱效(N)与柱长与柱长与柱长与柱长L呈正比呈正比呈正比呈正比,与填料粒径与填料粒径与填料粒径与填料粒径dp呈反比呈反比呈反比呈反比选择柱长选择柱长选择柱长选择柱长L与填料粒径与填料粒径与填料粒径与填料粒径dp的指导原则的指导原则的指导原则的指导原则分离难易程度分离难易程度分离难易程度分离难易程度L/dp困难困难困难困难30,000(150mm/5um,100mm/3.5um,75mm/2.5um)中等中等中等中等20,000(100mm/5um,75mm/3.5um,50mm/2.5um)简单简单简单简单10,000(50mm/5um,30mm/3.5um,20mm/2.5um)注注注注:具体选择哪一个具体选择哪一个具体选择哪一个具体选择哪一个L/dp的组合的组合的组合的组合，，，，主要看对样品通量的要求如何主要看对样品通量的要求如何主要看对样品通量的要求如何主要看对样品通量的要求如何。。。。方法开方法开方法开方法开发的终极原则是在最短的色谱柱上完成最快的分离发的终极原则是在最短的色谱柱上完成最快的分离发的终极原则是在最短的色谱柱上完成最快的分离发的终极原则是在最短的色谱柱上完成最快的分离,以达致最高的样品通以达致最高的样品通以达致最高的样品通以达致最高的样品通量和最省的流动相耗量量和最省的流动相耗量量和最省的流动相耗量量和最省的流动相耗量。。。。©2011WatersCorporation48评估选择时的考虑与步骤评估选择时的考虑与步骤评估选择时的考虑与步骤评估选择时的考虑与步骤�浏览所得谱图，选择最佳组合。考虑：—分离所有的色谱峰还是主要分析成分而已?—对分离度的要求?—对峰拖尾因子的要求？—对色谱保留的要求？对峰流出方式的要求？（如希望杂质峰在前、主峰在后）—梯度分离还是等度分离方法?�步骤1:选择流动相pH�步骤2:选择色谱柱和流动相溶剂�步骤3:对选定的最佳条件组合下的分离进行优化或微调©2011WatersCorporation49应用实例应用实例应用实例应用实例应用实例应用实例应用实例应用实例::ZantacZantac®®((雷尼替丁雷尼替丁雷尼替丁雷尼替丁雷尼替丁雷尼替丁雷尼替丁雷尼替丁))强迫降解样品的分析强迫降解样品的分析强迫降解样品的分析强迫降解样品的分析强迫降解样品的分析强迫降解样品的分析强迫降解样品的分析强迫降解样品的分析�Zantac®(ranitidine–pKa值为8.2和2.7)—被广泛使用于治疗和预防胃部和肠道溃疡,亦被用于治疗胃食管反流病(英文简称‘GERD’)—药物的强化降解研究需符合医药法规‘Stabilityindicatingassay’的要求�实验的目标—开发适用于雷尼替丁强化降解样品分析的LC/MS方法o利用质谱的强大功能进行色谱峰的示踪和峰纯度检验—将雷尼替丁主峰与其他所有强迫降解物完全分离—确认已知降解物的存在N+OO-ONHNHNSCH3CH3CH3Admin高亮©2011WatersCorporation50雷尼替丁及其已有文献记载的降解物质的化学结构雷尼替丁及其已有文献记载的降解物质的化学结构雷尼替丁及其已有文献记载的降解物质的化学结构雷尼替丁及其已有文献记载的降解物质的化学结构雷尼替丁及其已有文献记载的降解物质的化学结构雷尼替丁及其已有文献记载的降解物质的化学结构雷尼替丁及其已有文献记载的降解物质的化学结构雷尼替丁及其已有文献记载的降解物质的化学结构1.Ranitidine(MW314)(CH3)2NCH2CH2SCH2CH2NHNCH3CCHNO2O(CH3)2NCH2CH2OHO3.DegradationProduct(MW155)7.DegradationProduct4.Degr./Synth.Product(MW159)NSH3CHNHON(CH3)2NCH2CH2SCH2CH2NH-C=CNO2O2.SynthesisProduct(MW497)2CH2CH2NO2H3CHN5.DegradationProduct(MW301)(CH3)2NCH2CH2SCH2CH2NHCH2NO2COOO6.DegradationProduct(MW330)(CH3)2NCH2CH2SCH2CH2NHCH2NO2COOReferences:M.Kelly,K.Altria,C.Grace,B.Clark,J.Chrom.A.198(1998)297-306.M.Evans,P.Haywood,D.Johnson,M.Martin-Smith,G.Munro,J.Wahlich,J.Pharm.&Biomed.Anal.7(1989)1-22.©2011WatersCorporation51步骤步骤步骤步骤步骤步骤步骤步骤1:1:选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相pHpHUV254nmUV254nm下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果pH10pH3MeOHXBridge™ShieldRP18XBridge™C18XBridge™C18XBridge™ShieldRP18XBridge™PhenylXBridge™PhenylSunFire™C18Atlantis®T3*********Ranitidine©2011WatersCorporation52pH10pH3MeOHXBridge™ShieldRP18XBridge™C18XBridge™C18XBridge™ShieldRP18XBridge™PhenylXBridge™PhenylSunFire™C18Atlantis®T3高pH获得:最好的色谱保留最好的柱载荷最好的峰形最好的分离度最好的峰容量*Ranitidine***步骤步骤步骤步骤步骤步骤步骤步骤1:1:选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相pHpHUV254nmUV254nm下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果©2011WatersCorporation53XBridge™ShieldRP18XBridge™C18XBridge™C18XBridge™ShieldRP18XBridge™PhenylXBridge™Phenyl******ACNMeOH*Ranitidine步骤步骤步骤步骤2:选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂高高高高pH条件条件条件条件,UV254nm下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果©2011WatersCorporation54XBridge™ShieldRP18XBridge™C18XBridge™C18XBridge™ShieldRP18XBridge™PhenylXBridge™Phenyl******ACNMeOH*Ranitidine?步骤步骤步骤步骤2:选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂高高高高pH条件条件条件条件,UV254nm下的检测结果下的检测结果下的检测结果下的检测结果©2011WatersCorporation55XBridge™PhenylMeOHM+H??步骤步骤步骤步骤2:选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂高高高高pH条件条件条件条件,ESI+数据数据数据数据©2011WatersCorporation56XBridge™PhenylMeOHACNM+HM+H??步骤步骤步骤步骤2:选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂选择色谱柱和流动相溶剂高高高高pH条件条件条件条件,ESI+数据数据数据数据©2011WatersCorporation57143765未知降解物未知降解物未知降解物未知降解物m/z315and284未知降解物未知降解物未知降解物未知降解物m/z452and3152色铺条件:流动相A:200mM碳酸氢铵pH10流动相B:Acetonitrile流动相C:Water梯度条件:时间流动相组成(min)%A%B%C0.01058520.0104050流速:1.4mL/min进样体积:50µL@10mg/mL水溶液柱温:30oC检测:UV@254nm样品处理:制备10mg/mLratinidine水溶液，将其放置在85oC的烘箱中72小时。分析分析分析分析Zantac®(雷尼替丁雷尼替丁雷尼替丁雷尼替丁)强迫降解样品的最终方法强迫降解样品的最终方法强迫降解样品的最终方法强迫降解样品的最终方法XBridge™Phenyl柱柱柱柱,高高高高pH,ACN©2011WatersCorporation58内容内容内容内容�介绍—进行方法开发的途径—系统性方法开发�影响选择性的主要因素—固定相—有机溶剂—流动相pH值—流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法�系统性方法开发策略—雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方