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miR-155在过氧化氢诱导晶状体上皮细胞氧化应激损伤中的作用及靶向SIRT1调控机制

牛艳桃 张丽 谢文芳

山西省人民医院眼科，太原030012

白内障是临床常见致盲眼病，以晶状体进行性混浊为主要特征，是导致老年人视力降低及盲的主要原因。动物模型及体外细胞实验均证实，氧化应激与白内障发生和发展密切相关。晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)凋亡是白内障发生的细胞学基础，氧化应激状态下细胞代谢产生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)异常积累，诱发LECs凋亡，导致晶状体混浊。目前白内障主要通过手术进行治疗，尚缺乏预防或延缓白内障进展的有效手段。因此，寻找安全、有效的干预手段延缓白内障进展具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)能特异性调控靶基因，在眼部组织生长、功能维持及蛋白表达方面具有重要调控作用。miR-155是一种多功能miRNA，在炎症、肿瘤及免疫过程中发挥关键作用。既往研究显示，miR-155参与视网膜变性、葡萄膜炎等多种眼部疾病的发生和发展过程。抑制miR-155的表达可减轻脑缺血后海马炎症反应和氧化应激损伤，改善神经功能。但miR-155在LECs氧化应激损伤中的作用尚不清楚。本研究拟探讨miR-155在过氧化氢(hydrogen peroxide，HO)诱导人LECs HLE-B3氧化应激损伤中的作用及其可能的机制，为临床治疗白内障提供一定实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

细胞来源 HLE-B3细胞株购于美国ATCC公司。

1.1.2

主要试剂及仪器 体积分数30% HO(10011218)(上海国药集团化学试剂有限公司)；miR-155拟似物(miR-155 mimics)及其对照(miR-155 mimics-NC)、miR-155抑制剂(miR-155 inhibitor)及其对照(miR-155 inhibitor-NC)(上海吉玛制药技术有限公司)；二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2'，7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)ROS荧光探针(CA1410)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(BC0170)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA试剂盒(BC0025)(北京索莱宝科技有限公司)；双荧光素酶报告基因 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 试剂盒(GM-040502A，美国Genomeditech公司)；兔抗人沉默信息调节因子相关酶1(silment information regulator factor related enzymes 1，SIRT1)单抗(sc-74465，美国SantaCruz公司)；兔抗人B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2 gene，bcl-2)单抗(ab32124)、bcl-2相关X蛋白(bcl-2 assaciated X protein，bax)单抗(ab104156)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-cysteine aspartase 3，cleaved-Caspase-3)多抗(ab2302)、αA晶状体蛋白多抗(ab4632)、HRP标记的山羊抗兔二抗(ab150077)(英国Abcam公司)。IX53倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国FALS CALIBAR BD公司)；ABI7500实时荧光定量PCR系统(美国ABI公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1

细胞复苏、培养及鉴定 将液氮中冻存的HLE-B3细胞取出，37 ℃水浴解冻，离心半径8 cm，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞，加入含有体积分数10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基，于体积分数5% CO培养箱中37 ℃培养，待细胞融合达80%～90%时进行传代，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于后续实验。取传代后的细胞，提取总蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白变性后上样进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、孵育αA晶状体蛋白一抗(1∶ 1 000)、二抗(1∶ 5 000)，增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)显影，检测αA晶状体蛋白表达以鉴定LECs。

1.2.2

MTT法检测细胞存活率 取对数生长期HLE-B3细胞，调整细胞密度为1×10个/ml，接种于96孔板，培养24 h后，分别加入不同浓度(50、100、200、400、800 μmol/L)的HO，培养24 h，每孔加入20 μl MTT(5%)溶液，继续培养4 h，加入DMSO 150 μl/孔，充分振荡10 min，使用酶标仪在490 nm处检测各孔吸光度(

A

)值，另设不含HO的空白组，计算细胞存活率，细胞存活率=不同浓度HO组

A

值/空白组

A

值×100%。根据细胞存活率筛选出最适HO浓度。每组设置5个复孔。

1.2.3

细胞转染及分组 取对数生长期细胞，调整浓度为1×10个/ml，接种于6孔板，将细胞分为6个组，其中空白对照组细胞不作处理，模型对照组细胞于100 μmol/L HO条件下培养，miR-155拟似物组、miR-155拟似物对照组、miR-155抑制剂组、miR-155抑制剂对照组细胞分别进行相应转染后于100 μmol/L HO条件下培养。转染步骤为:分别将1 μg miR-155拟似物、miR-155拟似物对照、miR-155抑制剂或miR-155抑制剂对照与50 μl Opti-MEM混合；将2.5 μl Lipofectamine2000与50 μl Opti-MEM混合；再将2种混合物充分混合，室温孵育20 min，加至6孔板中，转染24 h后，荧光显微镜下观察细胞转染效果。倒置显微镜下观察细胞形态学变化并拍照。

1.2.4

实时荧光定量PCR法检测细胞中miR-155和SIRT1 mRNA相对表达量 收集各组细胞，Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，将RNA逆转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系：cDNA 2.0 μl，正向、反向引物各0.5 μl，SYBR Select Master Mix 10 μl，加ddHO至总体积20.0 μl。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸5 s，进行40个循环。miR-155正向引物序列为5'-AGCTAGCTAGCG ATCGCAG-3'，反向为5'-CGTAGCATCGATCGATATG-3'；U6正向引物序列为5'-ACGATCGATGCGATATGCATC G-3'，反向为5'-AAGCTAGCGCTACGACGTAGCG-3'；SIRT1正向引物序列为5'-ATCTATCGAGCTCGGATCG AC-3'，反向为5'-AGGCAGCAGCTGCAGATCGAT-3'；β-actin正向引物序列为5'-AAGCTAGCGATTATAG CTAGA-3'，反向为5'-ATCGATGCTAGGCAAGATTA-3'。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。miR-155以U6为内参，SIRT1以β-actin为内参，采用2法计算miR-155和SIRT1 mRNA相对表达量。

1.2.5

流式细胞术检测细胞凋亡率 取各组细胞，以1×10个/ml密度接种至6孔板，培养24 h，每孔加入500 μl质量分数0.25%胰蛋白酶消化3 min，离心半径8 cm，1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入500 μl结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexin和PI染色液，避光4 ℃染色15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算凋亡率。细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数/细胞总数×100%。每组设5个复孔。

1.2.6

DCFH-DA荧光探针法检测细胞ROS含量 各组细胞于6孔板培养24 h，每孔加入200 μl DCFH-DA，培养箱中静置30 min，使探针和细胞充分混匀，磷酸盐缓冲液洗涤，收集各组细胞，酶标仪检测

A

值(激发波长为488 nm、发射波长为525 nm)；倒置荧光显微镜下观察二氯荧光素(dichlorofluorescein，DCF)荧光强度并拍照，荧光越强代表ROS含量越高。每组设5个复孔。

1.2.7

ELISA法检测细胞培养上清液SOD活性和MDA浓度 各组细胞于6孔板培养24 h，离心半径8 cm，1 000 r/min离心5 min，收集上清，参照试剂盒 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 步骤，加入SOD、MDA抗体及酶标抗体，洗涤后加入底物显色液避光染色10 min，终止反应后，使用酶标仪于450 nm处测量

A

值，根据 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线计算样品中SOD活性和MDA浓度。每组设5个复孔。

1.2.8

双荧光素酶报告基因系统检测miR-155靶基因表达 采用PicTar以及TargetScan生物信息软件预测 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 miR-155与SIRT1序列之间结合位点，以SIRT1的3'非翻译区(untranslated region，UTR)插入双荧光素酶报告基因psiCHECK2中，构建野生型(wild type，WT)psiCHECK2-SIRT1 WT和突变型(mutant type，MUT)psiCHECK2-SIRT1 MUT重组质粒，分别将miR-155拟似物、miR-155拟似物对照、miR-155抑制剂及miR-155抑制剂对照与psiCHECK2-SIRT1 WT、psiCHECK2-SIRT1 MUT共转染至HLE-B3细胞，检测相对荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶活性与内参海肾荧光素酶活性的比值表示。实验重复3次。

1.2.9

Western blot法检测细胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量 取各组细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，BCA法对蛋白进行定量，100 ℃水浴变性，蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完毕后，将蛋白转印至PVDF膜，质量分数5%脱脂奶粉室温条件下封闭2 h，加入SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3及β-actin一抗(均1∶ 800稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗膜，加入HRP标记的相应二抗(1∶ 2 000稀释)，室温孵育2 h，TBST溶液洗膜，加入ECL溶液，显影、定影，采用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参β-actin灰度比值表示目的蛋白相对表达量。每组设5个复孔。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行统计分析。本研究中计量资料经Shapiro-Wilk检验证实符合正态分布，以表示，采用Levene进行组间方差齐性检验。采用均衡分组单因素干预多水平研究设计，空白对照组、模型对照组、miR-155拟似物组、miR-155拟似物对照组、miR-155抑制剂组、miR-155抑制剂对照组组间各测量值差异比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-

t

检验。miR-155拟似物对照组与miR-155拟似物组、miR-155抑制剂对照组与miR-155抑制剂组相对荧光素酶活性比较均采用独立样本

t

检验。

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LECs的鉴定

培养的HLE-B3细胞高表达αA晶状体蛋白(图1)。

图1 HLE-B3细胞中αA晶状体蛋白表达 可见细胞中αA晶状体蛋白高表达 M：蛋白分子标记Figure 1 Expression of αA-crystallin in HLE-B3 cells αA-crystallin was highly expressed in cells M:protein marker

2.2 不同浓度H2O2干预后细胞存活率比较

MTT检测结果显示，不同浓度HO处理细胞存活率总体比较，差异有统计学意义(

F

=289.475，

P

<0.05)。随着HO浓度增加，细胞存活率逐渐降低，各不同浓度间细胞存活率比较差异均有统计学意义(均

P

2.3 各组细胞形态学变化比较

倒置显微镜下观察结果显示，空白对照组细胞呈长梭形或不 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 椭圆形，贴壁生长良好；模型对照组细胞数量减少，死亡细胞悬浮于培养基中，呈圆形，存活细胞部分形态发生改变，细胞边界模糊不清；miR-155拟似物组细胞数量少于模型对照组，细胞固有形态发生改变；miR-155抑制剂组细胞数量多于模型对照组，细胞生长状态良好，但仍可见少量死亡细胞；miR-155拟似物对照组和miR-155抑制剂对照组细胞形态与模型对照组相似(图2)。

图2 各组细胞形态变化(×200，标尺=100 μm) 空白对照组可见细胞呈长梭形或不规则椭圆形，贴壁生长良好;模型对照组可见细胞数量减少，部分存活细胞形态发生改变，边界模糊不清;miR-155拟似物组可见细胞数量较模型对照组少，细胞形态发生改变;miR-155抑制剂组可见中等数量细胞及少量死亡细胞;miR-155拟似物对照组和miR-155抑制剂对照组可见细胞形态与模型对照组相似 白箭头示死亡细胞，黑箭头示变形细胞 A：空白对照组 B：模型对照组 C:miR-155拟似物对照组 D：miR-155拟似物组 E：miR-155抑制剂对照组 F：miR-155抑制剂组 miR：微小RNAFigure 2 Cell morphology changes in various groups(×200,bar=100 μm) In blank control group,the cells showed long fusiform or irregular elliptical shape,and they grew well adherently.In model control group,the number of cells was reduced,and some surviving cells were deformed with unclear boundary.Fewer cells were seen in miR-155 mimics group compared with model control group and they were deformed.Medium number of cells and a few dead cells were seen in miR-155 inhibitor group.Cell morphology in miR-155 mimics negative control group and miR-155 inhibitor negative control group was similar to model control group White arrows indicated dead cells,and black arrows showed deformed cells A:blank control group B:model control group C:miR-155 mimics negative control group D:miR-155 mimics group E:miR-155 inhibitor negative control group F:miR-155 inhibitor group miR:microRNA

表1 不同浓度H2O2细胞存活率比较(x±s,%)Table 1 Comparison of cell survival rate at different concentrations of H2O2 (x±s,%)H2O2浓度样本量细胞存活率0 μmol/L5100.00±1.0050 μmol/L566.15±3.56a100 μmol/L555.38±3.15ab200 μmol/L541.54±2.95abc400 μmol/L527.69±2.58abcd800 μmol/L520.00±2.37abcdeF值289.475P值<0.001 注:与0 μmol/L H2O2比较,aP<0.05;与50 μmol/L H2O2比较,bP<0.05;与100 μmol/L H2O2比较,cP<0.05;与200 μmol/L H2O2比较,dP<0.05;与400 μmol/L H2O2比较,eP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) H2O2:过氧化氢 Note:Compared with 0 μmol/L H2O2,aP<0.05;compared with 50 μmol/L H2O2,bP<0.05;compared with 100 μmol/L H2O2,cP<0.05;compared with 200 μmol/L H2O2,dP<0.05;compared with 400 μmol/L H2O2,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) H2O2:hy-drogen peroxide

2.4 各组细胞miR-155和SIRT1 mRNA相对表达量比较

空白对照组、模型对照组、miR-155拟似物组、miR-155抑制剂组、miR-155拟似物对照组和miR-155抑制剂对照组细胞miR-155和SIRT1 mRNA相对表达量总体比较，差异均有统计学意义(

F

=386.952、356.158，均

P

P

P

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