动物细胞培养

动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞工程常用技术其它动物细胞工程的基础学习目标动物细胞培养定义、过程、条件、应用动物体细胞核移植技术定义、过程、应用、存在问题一、动物细胞培养1.概念：细胞增殖动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。2.原理：3.过程取出组织胚胎或幼龄动物的器官组织剪碎组织胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶内（培养液）置于适宜环境中培养加培养液稀释动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液细胞贴壁接触抑制转入培养瓶内（培养液）置于适宜环境中培养思考：转入培养瓶内培养会发生哪些现象？■细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于帖附。细胞进行有丝分裂，数量不断增多。接触抑制■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。取出组织胚胎或幼龄动物的器官组织剪碎组织胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理单个细胞制成细胞悬液加培养液转入培养瓶内培养（细胞贴壁；接触抑制）原代培养定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养动物组织块细胞悬液原代培养（细胞贴壁；接触抑制）传代培养胰蛋白酶处理分散成单个细胞幼龄动物的器官组织；动物胚胎加入培养液用胰蛋白酶等处理贴壁细胞；分瓶继续培养。适宜条件让学生思考如下问题：1、从个体发育的角度看，选取什么样的组织作为培养对象？2、怎样将动物活体组织分散成单个细胞？可以用胃蛋白酶处理吗？为什么？蛋白酶处理组织会不会破坏细胞的结构？3、培养基是用液体的还是固体的？培养基中应加入哪些营养物质？4、培养动物细胞时放在什么样的温度下，对培养液的PH值有什么要求？培养瓶中的气体由要求吗？5、怎样防止培养液当中混入细胞菌或病毒？6、动物细胞能无限增殖下去吗？——一般10代以内可以保持正常核型不断增殖，从10代到50代细胞增殖会逐渐减慢直至完全停止。少数细胞由于传代过程中细胞核型发生改变突破了接触抑制可无限增殖下去成为不死性的细胞。当原代培养的细胞处于接触抑制后，用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱离下来，然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，这个过程称传代培养（分瓶培养的过程）。传代培养10代细胞传代培养无限传代遗传物质未改变动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液胰蛋白酶处理转入培养瓶单个细胞加培养液稀释分瓶原代培养原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液胰蛋白酶处理10代细胞转入培养瓶40-50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液稀释传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。分瓶继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。细胞株：一般说遗传物质未改变细胞系：遗传物质已改变原代培养动物细胞培养的原理：细胞增殖为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。液体合成培养基：（葡萄糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加血浆、血清等天然成分。4.动物细胞培养的条件1）无菌、无毒的环境：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.5±0.5℃适宜的酸碱度：PH：7.2-7.44）气体环境：2）营养：3）温度和pH：“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的；CO2维持培养液的pH。对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？主要成分：葡萄糖、氨基酸、水、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1.液体培养基2.成分中有动物血清等加入动物血清原因：提供一个类似生物体内的环境；含营养物质（如生长因子）促进细胞发育。用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间物质主要成分是什么？用胃蛋白酶行吗？在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。5.动物细胞培养技术的应用1.蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2.应用于基因工程 主要用于作为受体细胞 3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.培养正常或各种病变的细胞，用于细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物植物组织培养和动物细胞培养的比较 比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 原理 细胞的全能性 细胞增殖 培养基性质 固体培养基 液体培养基 培养基特有成分 蔗糖植物激素 葡萄糖动物血清 培养结果 植物体 细胞株、细胞系 培养目的 快速繁殖、培育无病毒植株 获得细胞或细胞分泌蛋白 取材 植物幼嫩部分或花药 胚胎或幼龄动物的器官或组织 其他条件 无菌无毒，适宜条件 无菌无毒，适宜条件在动物细胞培养过程中，下列哪种现象是不可能的（　）A．细胞一直在细胞悬液中分裂生长B．有少部分细胞可能在培养条件下无限地传代下去C．有部分细胞核型会发生变化D.个别细胞会发生基因突变A既然动物体细胞核仍具有全能性，为什么不能直接利用动物体细胞培育动物体？利用动物体细胞核移植技术动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。怎样才能使动物体细胞表现出全能性呢？1.定义：3.分类：2.原理：二、动物体细胞核移植技术和克隆动物动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中。使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物动物细胞核具有全能性胚胎细胞核移植、体细胞核移植胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难4.体细胞核移植的过程供体：优质高产奶牛◆为何取供体细胞传代培养10代以内的细胞？10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变。受体：普通奶牛（卵母细胞采集与培养）◆受体细胞为什么选用卵母细胞？卵母细胞体积大，易操作；含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。◆为什么必须先去掉卵母细胞的核?◆为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。◆为什么使用去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）？减数第二次分裂中期的卵母细胞才具有受精的能力，其内含有生物生长发育的全部信息及营养，且有助于动物细胞核全能性的表达。因为在这个时候去核的话对卵细胞损伤最小，距离很近，便于去核。◆为什么不是取供体细胞核进行核移植操作，而是直接将供体细胞整个注入去核卵母细胞中？保证供核不被破坏，使所得个体的性状更符合供体。◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：电刺激构建重组胚胎◆胚胎移植至代孕受体内妊娠、分娩◆体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？◆不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞◆遗传物质基本相同供体细胞（供核）细胞培养体细胞卵巢卵母细胞（MⅡ中期：供质）去核去核卵母细胞注入细胞融合重组细胞构建重组胚胎胚胎移植代孕母体生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛体细胞核移植的过程共分成两大阶段：核移植和胚胎移植受精卵体细胞核移植的原理：动物细胞核具有全能性细胞核移植多莉羊的培育过程1.写出ab所代表细胞工程名称：a表示：b表示：2.实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。核移植胚胎移植3.多利面部毛色是：根据遗传学原理说明判断依据：4.若黑面绵羊的基因型为AA，白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为：白色多利全部的核基因都来自白面绵羊aa细胞核具有全能性；细胞质具有调控细胞核发育的作用。5.多莉羊的成功证明了什么？胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程受精卵体细胞核移植流程：1.供体细胞的采集与培养（10代以内）。5.用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程。6.电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。4.将供体细胞注入去核卵母细胞。3.显微操作去除卵母细胞中的核。2.受体卵母细胞的采集与体外培养。7.胚胎移植入代孕母牛体内。8.妊娠分娩与供体遗传物质基本相同的犊牛。5.体细胞核移植技术的应用前景1.在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程。2.保护濒危物种。3.医药卫生领域：克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白；治疗人类疾病，作为组织器官移植的供体。治疗人类疾病，作为组织器官移植的供体主要的优点是？不发生免疫排斥反应◆研究克隆动物和克隆细胞更了解胚胎发育及细胞衰老过程；克隆动物做疾病模型，更好追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病。6.体细胞核移植技术存在的问题（1）成功率仍然非常低，产下的活克隆动物比率平均不到10%。（2）绝大多数克隆动物还存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。（3）对克隆动物食品的安全性问题也存有争议。用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞A.容易产生各种变异B.具有更强的全能性C.取材十分方便　　D.分裂增殖的能力强D动物细胞培养要经过脱分化？为什么？一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是A．细胞系B．细胞株C．原代细胞D．传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是　A.动物细胞融合B.单克隆抗体　C.胚胎移植D.动物细胞培养AD4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于A.培养基不同；B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。A知识结构动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养动物体细胞核移植技术和克隆动物核移植技术和克隆动物的概念体细胞核移植技术的过程体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术存在的问题卵母细胞去核体细胞取核电刺激使两细胞融合重组细胞重组胚胎新个体定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养（贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。①原代培养3.过程原代培养3、总结：动物细胞培养过程动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理10代细胞转入培养瓶40-50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液稀释传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。为什么用胰蛋白酶处理？分瓶传代培养原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。细胞株：一般说遗传物质未改变细胞系：遗传物质已改变原代培养1.动物细胞的培养过程幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？遗传物质改变贴壁生长细胞分裂生长到相互接触时就停止分裂增殖的现象叫接触抑制核移植技术分类核移植胚胎细胞核移植(易)体细胞核移植（难）细胞分化程度低，恢复全能性容易受体细胞：MⅡ期的卵母细胞注意：严格来说新个体有卵母细胞的细胞质，所以有两个亲本的性状。◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内妊娠、分娩2.）核移植流程供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲，对吗？让学生思考如下问题：1、从个体发育的角度看，选取什么样的组织作为培养对象？2、怎样将动物活体组织分散成单个细胞？可以用胃蛋白酶处理吗？为什么？蛋白酶处理组织会不会破坏细胞的结构？3、培养基是用液体的还是固体的？培养基中应加入哪些营养物质？4、培养动物细胞时放在什么样的温度下，对培养液的PH值有什么要求？培养瓶中的气体由要求吗？5、怎样防止培养液当中混入细胞菌或病毒？6、动物细胞能无限增殖下去吗？——一般10代以内可以保持正常核型不断增殖，从10代到50代细胞增殖会逐渐减慢直至完全停止。少数细胞由于传代过程中细胞核型发生改变突破了接触抑制可无限增殖下去成为不死性的细胞。