园艺植物生物论文

《园艺植物生物技术》课程论文 植物抗病基因克隆方法的研究与应用 摘要:随着分子生物学的发展,基因克隆技术已普及。本文介绍了定位克隆技术、转座子标签技术等植物基因克隆的方法,揭示了植物基因克隆技术的特点并在其中介绍了植物抗病基因克隆技术的应用。最后,对植物抗病基因克隆技术进行展望。 关键字:抗病基因定位克隆技术转座子标签技术 在农业生产上,由真菌、病毒、线虫、细菌以及昆虫等引起的植物病虫害已对农作物造成严重危害,导致作物减产减收。长期以来,主要依靠喷洒农药等方法防治作物病虫害,但是随着时间的推移,危害植物的细菌昆虫等逐渐产生了抗药性,导致农药的失效。同时,农药的大面积使用严重污染生态环境,给人们的生活健康带来了很大的威胁。但是,经过科学家的研究发现,部分植物具有对某些特定害虫的抗性,经过分析知道这些植物具有抗病基因,并且这些抗病基因具有独立的遗传特性,这一发现为抗植物病害提供了一条有效的途径,这也是目前国内外的研究热点之一。目前研究主要集中在植物抗病基因克隆上,克隆植物抗病基因不仅具有重要的农业经济意义和生态保护意义,同时还可以丰富宝贵的遗传资源库。 植物抗病基因克隆的方法是基于Flor于1971年提出的基因对基因假说,这一假说构成了现在克隆植物抗病基因的理论础。在此基础上发展起来的抗病基因克隆方法有:功能克隆、序列克隆、表型克隆和定位克隆等。抗病基因的克隆还采用以下技术:产物导向法、鸟枪射击法、扣除杂交法、酵母双杂交系统、外显子捕获法和 RNA指纹法等。随着植物抗病基因研究的不断发展,其中的表型克隆和定位克隆已发展成为最主要的两种植物抗病基因克隆技术。 一.表型基因克隆法 表型克隆是与定位克隆相对的一种克表型克隆是与定位克隆相对的一种克隆基因的策略。它可对因突变而导致的某一特殊表型的来了希望。目前,有很多植物既不了解它的基因产物,也没有对它们进行基因定位,但已知植物在表现型上存在着差异,利用表现型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。常见的表型克隆有:消减杂交、DNA 转染法、代表性差异分析技术、mRNA 差异显示、阻抑扣除杂交法、转座子标签技术等。与定位克隆相比,此法省去用大量遗传标记进行定位分析的繁琐程序,较易检测基因组之间差异或相同区域,加快基因克隆速度。下面将重点介绍取得较大成功的转座子标签技术和mRNA差异显示。 1. 转座子标签技术 转座子是由 McClintock 通过对玉米遗传现象 10 多年的研究,于 1951 年首次发现的。转座子标签技术是将转座子或T-DNA插入到欲分离基因的内部或附近,基因发生突变而被标识,然后利用插入DNA片段作探针,克隆到该它是染色体上一段可以移动的 DNA序列,可以从一个基因座位转移到另一个基因座位。 当转座子插入到某个功能基因内部或邻近位点时,就会使目标功能基因发生突变而失活,转座子标签技术就是根据转座子随机插入引起突变的特性发展起来的一种研究基因功能的新方法,即将转座子(或T- DNA)插入到欲分离基因的内部或附近,基因发生突变而被标识,然后利用插入 DNA片段做探针克隆到该基因。该技术运用的前提条件为:被操作的植物有现成的操作系统或有成熟的根癌农杆菌转化系统,以及有效的大规模突变体筛选策略。 转座子标签法具有以下优点:(1)分离基因时不需事先了解被标签产物的结构、性质;(2)转座子插入引起的突变会由于转座子的切离而回复;(3)转座子在染色体上定位后很易确定与其连锁的突变基因的相对位置;(4)转座子导入目标植物可通过自交、杂交、回交等方法得到一个大的含不同插入位点的转座子群体;(5)将转座子导入异缘植物不受转化条件的限制。此外,该技术快捷、准确、简单,能够 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 地找到与某一表型相捷、准确、简单,能够规范地找到与某一表型相关的基因。但是,筛选鉴定转座子突变个体比较困难。这是因为:转座子在不同植物中的转座频率和活性相差较大,需筛选大量个体来鉴定转座子突变个体。另外,在植物基因组中,多拷贝基因的存在也限制了该技术的应用。不过这些不足已得到很好的弥补,比如对转座子进行修饰。对转座子进行修饰一般采用 Ac/Ds 系统。其基本环节为:(1)去掉 Ac 两端 200 bp 的任一端,使 Ac 转座子成为稳定型;(2)把 Ac 转座子基因的启动子去掉,换成 35S 启动子;(3)构建非自主转座子,将 Ds 与特异重组系统 Cre/lox成功地结合,把 Cre/lox重组系统的一个 lox位点放在 Ds 内部;(4)将另一个 lox克隆在T- DNA区,Ds 转座到 T-DNA附近后,这两个 lox 位点再经 Cre 的反式作用而重组,使 T- DNA和 Ds 间的 DNA产生重排。这样可提高突变,还可引起位点特异突变。 2.mRNA差异显示法 高等植物所有的发育和生理变化技术过程,不论是单基因还是多基因控制,都是通过基因表达的质或量的差异而体现出来 ) 方法如下:(1)提取两种细胞的mRNA反转录后成为两种 cRNA(2)以一定的引物作随机聚合酶链式反应;(3)通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样品间的差异条带;(4)将差异DNA做成探针;(5) 在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析,现在已被成功地应用到玉米、小麦、拟南芥等作物中)如:玉米的 M 个雌雄花序中差异表达的MAD-box基因;小麦的热激蛋白基因;水稻蔗糖调节基因以及拟南芥的HSP 家族基因 )由于该技术本身存在诸多缺陷,在引物设计、Northrern杂交和凝胶测序等方面对基因技术进行了改进和优化,已发展了许多衍生的新技术,如:用随机引物 PCR 扩增RNA指纹分析、顺次差异显示法、基因组差异显示法等。 二.定位克隆技术 基因的定位克隆又称为图位克隆,是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法。植物抗病基因的定位克隆包括以下基本步骤:(1)建立一个目标性状的分离群体;(2)利用分子标记技术在目标基因两侧寻找与之紧密连锁的标记;(3)采用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置上,同时构建大片段基因组文库,如细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库; (4)用目标基因两侧紧密连锁的标记筛选含有大的插入片段的基因组文库,通过染色体步查筛选到含有目标基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。 定位克隆首先要寻找与目标基因紧密连锁的分子标记。近等基因系和分离群体分组分析方法的建立促进了分子标记的发展,已建立的 DNA标记技术主要有:限制性片段长度多态性随机扩增多态性、扩增片段长度多态性和简单序列重复等。随着 DNA标记技术的发展,遗传图谱和物理图谱研究的深入,重要植物抗病基因的定位克隆也将有所突破。定位克隆技术的核心任务是染色体步行。若能找到与目标基因很近的标记,以至于二者之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小,就可以直接筛选到含有目标基因的克隆,最终得到候选基因,这种策略称为染色体登陆。定位克隆的另一个关键是高密度的分子标记图谱。随着分子生物学技术的飞速发展,人们已获得了许多高密度的遗传图谱。物理图谱的构建也是定位克隆技术的一个至关重要的环节,目前利用稀有切点内切酶结合脉冲电场凝胶电泳技术已成功用于植物基因组的大规模物理作图,从而可以确定连锁标记与目标基因间实际物理距离的大小。 定位克隆理论上适应于一切植物抗病基因,但也存在应用上的一些不足:如,构建叠跨克隆群可能存在困难;精细作图成本很高;定位克隆不能提供基因功能的相关信息,需借助其他手段。 除以上技术外,根据抗病基因保守区域合成引物,通过 PCR 已从大豆、马铃薯、水稻、小麦、玉米、番茄、莴苣和拟南芥等不同植物中分离到许多结构上与抗病基因类似的序列。利用 RGA,大麦的 30 多个不同的 NBS- LRR 抗病相似序列被定位。可见,植物抗病基因的克隆技术已日趋成熟,特别是表型克隆技术中的转座子标签技术,以及传统的定位克隆技术。利用这两种主要方法已发现并克隆了多种植物的抗病基因,为抗植物病害和生态环境的保护做出了一定贡献。但是鉴于上述两种技术的不足,分子生物学工作者正在努力研究更完善的植物抗病基因的克隆技术,其中的RGA技术由于其自身的优势,并与 cDNA克隆、定位克隆 及转基因技术组合将在抗病基因克隆方面发挥更大作用。可见,RGA技术将成为另一种主要的植物抗病基因克隆技术,这将会为揭示抗病基因、农作物改良和生态保护等方面提供又一条有效可行的途径。 现在,基因克隆的抗病基因用于抗病育种中,用不同的基因克隆方法找出抗病基因并导入植物中去有3个明显的优势:首先是不会受植物不良农艺性状的影响;其次是避免了远缘杂交的不亲和性;最后是缩短了育种时间但是也存在着一些问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,分离出来的一些基因片段,很多还不能确定其为抗病基因;真核表达系统的复杂性,抗病基因最终是否成功表达并表达其原有抗性,还取决于基因的改造、基因表达时空调控等问题的解决针对转移基因的抗性持久性及在植物中的表达时期,已有人将抗病基因和相应的无病毒基因共同导入植物体内,并将它们置于病原物诱导的启动子之下的转基因策略,但是现在还没有成功的报道从培育出抗病植株到应用于田间病害的控制,还有很多理论、技术上的问题待解决。基因克隆无论是在技术上还是在应用上都取得了很大进展我们相信将来会有越来越多的优良基因不断被克隆并应用到实践中去。 随着植物抗病基因克隆技术的发展,更多的抗病基因将被运用到我们的生产和生活中并将会对我们的生活产生巨大的影响:首先,大量抗病基因的运用将会大幅度减少农药的使用量,进而减少食物中的药物残留,为人们提供更放心的食物:其次,农药的使用量减少对环境的污染会减少,有利于环境的改善;最后,抗病基因的运用将会降低农作物的成本投入,有利于经济的发展。 参考文献: [1]舒群芳,植物基因克隆的方法和策略[j],植物学通报,1999,16[1]:80-85 [2]贾建航,植物抗病基因克隆研究进展[j] ,生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 进展,2000,20[1]:21-26 [3]胡天华 & 植物基因克隆技术及进展[j] 科学通报,1989,21:1652-1655 [4]Multani DSetal.Proc Natl Acad Sci USA , 1998, 95: 1686—1691 [5]Borhan MHetal.MolPant Microbe Interact ,2004,17 (7):711—719 [6]王永军等. 遗传学报, 2004, 31(1): 87—90