用噬菌体展示六肽库筛选与G—CSF具有结合活性的小分子多肽

用噬菌体展示六肽库筛选与G—CSF具有结合活性的小分子多肽 用噬菌体展示六肽库筛选与G—CSF具有 结合活性的小分子多肽 ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(JCellMolImmuno1)2001:17(3 研究原着文章编号:1007.8738(2001)03—287—02 用噬菌体展示六肽库筛选与G-CSF具有结合活性的小分子多肽 武婕,陈惠鹏,王清明(军事医学科学院放射医学研究所,北京1O0850) 关键词:牡细胞集落刺激因子:胜库:筛选 中图分类号:Q78文献标识码:A 摘要:目的筛选与人重组G-CSF分子有结台恬性的小分 子多肽.方法将靶分子C~CSF固定在塑料平皿上,对随 机噬菌体六肽库进行3轮筛选.经孵育,洗脱,扩大培养 和ELISA分析.随机挑取出第3轮得到的4个阳性克隆测 序,然后进行同源性比较.结果找到1个保守性肽段序 列模式"SXXRVX",此模式在人和小鼠的受体中都未见到其 同源序列.结论此小肽可与G.CSF结台,故在一定程度 上有可能抑制G-CSF与受体的结台,为临床治疗炎症反应 和研究G.CSF与受体相互作用的机制提供了一定的帮助. ScreeningofpqJlidelindofGCsF瞪 pI翰IispIIpepadelibraries 眦,.1ie,CHENHui-peng,WANGQing-ming InstituteofRadiationMe~eine,Ac~emyofMilitaryMedical Science,Beijlag100850,CMna Keywords:nul0cecolony?stimulatingfactor; peptidelibrary;ser~ning Abdrad:AimToisolatesinai1molecularpolypeptidesthatbind torecombinanthumanG-CSFmol~debyrandomph_djgpl yinghexapeptidelibrariesM目岫Affinity~eloetivemethod WaSusedto~feenthelibrary.CoatingrhG?CSFdirectlyon p/ates.hpep!ide/ibrazJesa腮thenapplied,fallowedbyvj oroLl~washingsindetergent?supplementedbufferstoi'emov~most non--specificallyboundphageandtoselect.pecm.phagepani desbytheu8eofelationsin丑cidbuffers.R曙ul伍Mterthire@ w~shes.fourpositivephagedorieswereselectedbyEUSAand sea1J.ei~cedOfthem.aconservedpeptidemotifSXXRVXw船 foundTheaminoacidsequencesofthepeptidesWelI~not foundintheprima1. seaueI1ceofhumanand功州seC-CSF5|e? eeptOUSConclusionThepeptidecanbindtoG?CSFandmay inhibittheinteractionbetweenC-CSFanditsreceptor1H3 findingishelpfultop~videtheoreticbasiscliniealtreatment ofjnfiammationandforfurtherresearchonmechanismd-intes- actionbetweenC-CSFanditsreceptor, 噬菌体 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面呈现技术从最初建立到现在,已经 在生命科学研究的许多领域得到广泛应用,如寻找 细胞因子拮抗剂和激动剂,筛选酶抑制剂,分析未 知抗原表位,疫苗研制和导向肽的发现等".粒细 胞集落刺激因子(G-CSF)是调控人体内正常血细胞 收稿151期:2000—09—11;俸回El期:2000—1l一03 作者简介:武/de(1975一).士,陵西桁转市,博士生 通讯地址:广州市流花路l1l号,广州军区总医院医学宾鞋科,510010 Tel(020)36224950 的一类造血生长因子.通过其与细胞表面的特异性 受体结合,可诱导受体二聚化,触发一系列信号传 递过程,而发挥生物学作用]0基于Geysen[6提出 的大分子蛋白质问的相互作用,结合主要由少数几 个关键性氨基酸残基所贡献的观点,我们尝试了以 G.CSF分子为靶蛋白,对随机噬菌体六肽库进行3 轮筛选.经结合性分析实验后,挑选了4个阳性克 隆测序,得到1个保守性的肽段序列.此模式在人 和小鼠的G.CSF受体分子中未找到同源序列. 1材料和方法 1.1材料噬菌体展示六肽库,由吉林大学大分子 实验室李惟教授惠赠.六肽表达在丝状噬菌fUSE5 的外壳蛋白P?的N末端:NI-h.Ala.Asp.Gly.Ala— xGly-Ala..…..重组人G—CSF由本单位自行制 备.HRP一抗M13噬菌体抗体,由军事医学科学院 微生物学流行病学研究所王海涛教授惠赠.其它试 剂均为国产分析纯.DNA测序电泳仪为PE公司产 品.酶标仪为Bio.Rad产品. 1.2方法 1.2.1G-CSF分子亲和性配体的筛选筛选过程参 其中G-CSF分子的 照文献(7],共进行了3轮筛选. 浓度由第1轮的555nmol/L降到第2,3轮的100 nmol/L和10nmol/L.靶分子和噬菌体作用的时间 也随着筛选次数的增多而缩短,以此增大筛选的压 力,获取特异性和结合活性较强的噬菌体克隆. 1_2.2制备铺板细胞(starvedcel1)用K91抗卡那 霉素细菌为扩增的宿主菌,将其培养至对数生长 期,缓摇,使F菌毛伸展,离心,收集细菌,用 80mmol/LNaCI悬浮细菌,缓摇,离心,收集细 菌,将其悬浮于80ramol/LNaC1中,4?保存.用此 法制各的细菌3—5d内都有活性,但以新鲜制备的 细菌活性为最好. 1.2.3特异性噬菌体的扩增以筛选到的洗脱液 侵染已铺板的细胞,加入1mLLH培养液(含0.2 mg/LTc).37%剧摇40min.再将其转到20mL LB(内含20g/LTc)中,过夜培养扩增.离心,取上 清,用15瞻/L的PEG/NaCI沉淀;再离心,用TBS 悬浮噬菌体,即得扩增的噬菌体. 1.2.4噬菌体滴度的刹定将1O经适当稀释 的噬菌体,加入到20制各好的K91kan~Eeo/i 中,侵染10rain,再加入1mLLB(含0.2mg/L Tc),于37剧摇30rain.吸取100L培养液铺 288ISSl007.873 板,37~C培养过夜后,计算其克隆数及噬菌体滴度 (TU).TU/L=克隆个数×1030/100×10×稀释 倍数.在每轮筛选中,都需测定投入噬菌体的Tu 和产出噬菌体的Tu. 1.2.5阳性克隆的检测用1.0100mmol/L的 放于保湿盒中4.c G-CSF,直接包被96孔酶标板, 过夜,用30g/LBSA37.c封闭1h,PBST洗板6次. 然后,依次加入筛选到的噬菌体克隆和HRP一抗N13 噬菌体的单抗.以邻苯二胺显色后,用2mol/L 鼢终止反应.实验中设以噬菌体展示六肽库为 阴'眭对照,未包被G—CSF分子的孔为空白对照. 1.2.6阳性噬茵体克隆插入片段的序列分析将得 到的4个阳性噬菌体克隆,制各其单链DNA,并 以自动测序仪测序 2结果 2.1投入的噬菌体展示六肽库的滴度测定将噬 菌体展示六肽库,用TBS/明胶稀释l0倍,所得 克隆数为212个,Tu/L=2.18×10TU/k肽库 的滴度达到l0时,说明此肽库已包括了足够多 的肽段种类,可用来投入筛选. 2.2G-C$F分子亲和性配体的筛选经过3轮的筛 选,回收率有了明显提高,阳性克隆得到富集,筛选 到能与G-CSF分子结合的噬菌体(表1). 表1筛选过程中噬茵体的回收率(%) TablRecoveryrate(%)ofphageclonesduringbiopanning N~te:Recoveryrate=ouqmtphagetiter/inp咀phagetitcr. 2.3噬菌体克隆的特异性鉴定随机挑取第3轮筛 选中得到的l0个噬菌体克隆,做EtJSA检测.其中有 4个克隆呈阳性,证明此4个克隆能与G.CSF相结合 (表2). 表2阳?陆噬茁体克隆的ELISA法测定 Tab2ThedetecfionofpositivephageclonesbyELISA elone3A"?5) 0.352?0.055 O.475?0022 0019 0296? 0.510?0048 坐翌!:!: N.Theva|uesrepresentthemeoftriplieateexperiments 2.4序列测定制备上述4个阳性克隆子的单链 DNA.经自动测序仪测序,肽段的序列如下: Clone1:SREY;Clone2:HIERPL; Clone3:SSL— F;Clone4:VRHRML. 其中第4位的氨基酸相当保守,均为Arg,说明 — Ce— llMOfImmuno1)2001;17(3 Arg在二者的结台中起很重要的作用.前3个氨基 酸基本为亲水性氨基酸,后两个氨基酸基本为疏水 性氨基酸,其中克隆i,3的序列找到了 "SXXRVX"的共同模式. 3讨论 近年兴起的噬菌体表面呈现技术,使人们有可 能将各种各样的小分子多肽片段像基因那样聚集在 一 起,构建成1个文库,从而便可在其中寻找人们 所需要,自然界中存在或不存在的小分子多肽片段. G—CSF在体内能特异性地调控粒细胞的生成, 聚集和分化,激活粒细胞发挥正常的生理功能和分 泌特定的细胞因子.但大量的中性粒细胞在组织内 聚集和激活后,可通过"呼吸爆发"效应,释放出一 系列对组织有害的物质,而引起组织损伤.如大量 的对器官有损伤的氧化代谢物一OH,H2O:和.: 对细胞有直接毒效应的血小板激活因子;降解组织 的弹性蛋白酶和髓过氧化物酶等多种酶类.因此 中性粒细胞与人体的炎症反应密切相关,是多器官 功能衰竭,成人呼吸窘迫综合症及全身性炎症反应 综合症发病的主要原因之一.虽然中性粒细胞在体 内受多种因素的调节,但如果用筛选的小分子多肽拮 抗G—CSF的活性,调节中性粒细胞在体内达到动态 平衡,即可为治疗上述炎症反应提供了一定的帮助. 以重组的人C~CSF分子为靶蛋白,对随机噬菌 体展示六肽库进行筛选,得到1个较保守的序列模 式"SXXRVX",经计算机分析,在人和小鼠的 G—CSF受体上都未找到其同源序列.为了进一步验 证实验的结果,我们根据此序列模式合成了小分子 多肽,并准备傲结台分析实验即将小分子多肽直接 挂柱,检验是否能利用二者的亲和性来分离纯化 G-CSF等一系列工作.~-A/",对所获阳性噬菌体克隆 也正在做竞争结合实验等,并取得了部分数据.总 之,希望此小分子多肽的发现,对研究G—CSF与 受体相互作用的机制,了解和拓展G--CSF在临床 上的应用和开发导向药物提供一定的帮助. 参考文献: 【I】D~ber】.Wi~lercIs0lalion.peplid~BbL&m目?o1thereinr愧e uphage日【J】Biol,1994.2"(4)361369 [2)I'5"o0kMsel?af…cycli~BpeideLnhibitor【0alc_nnmiag .phadisplaypeptid~libre~[J]胁惭.1998t3(3l:149159 n]cBSE,EJimbetkAP,n?HRW.Peptld~_?pI1B…?【Itk-~ p?d幅foridcntifyinELigands[J)n?c胁SciUSA,1990,87 (16lt6378—6382 )Es~aqtuerj,utm0c,Ge噼6B,a/.Acorjr?onp叩teImq …d…rili…nhehLBlli~unodeftc:ieneyrims(HTV-LJV3d0…leads distinctT}-e】rcell瑚p0n日6(J】PeptNed.iqq6,2(3)165一i75 [sJ?S.FukRcmneobn~一slimulafit~andits~elptor ‰mFsetor,I99i.3【I]i:L3l_l4L 【6】cs?nH.Redd日,M—TIApriordelia~tionpcpridewhi~h ……dhr?BBn口…determinantfJj,14olm,l986,23 c7)L709一I5 [7]YuJ.StmchcAffinity?ofphage—displayedpepfid~"t F眦m.1996267:3—35 【8】Fuji6l…SAik~aKNeulmphilmediatedssI】Einjut7trodilsm0dH_岫L I…CareMed.199521277一5