细胞松弛素B对牛卵母细胞体外成熟过程中微管_微丝及染色体的影响

细胞松弛素B对牛卵母细胞体外成熟过程中微管_微丝及染色体的影响 2011,13( 6) : 54 , 60,中国农业科技导报 Journal of Agricultural Science and Technology B 细 胞 松 弛 素 对 牛 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 过 程 中 、微 管 微 丝 及 染 色 体 的 影 响 * * ， ， ， ， ， ， 磊郜宇刘扬李光鹏刘欣胡晓明白春玲程 ( ,010021)内蒙古大学生殖生物学及生物技术教育部重点实验室呼和浩特 : B( Cytochaasn B,CB) ,li摘 要细胞松弛素 是一种抑制微丝聚合的药物能抑制微丝的组装从而阻止胞质分 ,。裂和 极 体 排 放是 研 究 细 胞 分 裂 器 形 成 与 变 化 的 重 要 药 物在 牛 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 培 养 过 程 中 加 入 7, 5 g / mLCB CB 、。,μ的 进行处理分析 对减数分裂过程中细胞骨架形态染色体的排列与分离等方面的影响结果 ,CB ,,显示处理后卵母细胞第一极体的排放受到了抑制染色体的排列和分离受到了影响出现了同源染色体 ,; 分离不完全或分离不均匀及分离后又聚在一起等异常情况形成许多二倍体卵母细胞纺锤体微管的形态发 ,、; ,生了变化出现了两个纺锤体巨大纺锤体和多极纺锤体等异常结构微丝的正常分布受到了影响染色体周 ,; 围没有或少有微丝分布皮质下的微丝分布也变得少而不均匀这说明微丝与微管在减数分裂过程中是协同 ,CB ,,。作用的通过影响微丝的动态变化改变了纺锤体微管的形态结构最终抑制了极体的排放 : ; B; ; ; ; 关键词牛卵母细胞细胞松弛素 减数分裂微丝微管染色体 doi: 10, 3969 / Qj81, i3,ssSn85, 1008, 238-0864, 2011, 06, 09A1008-0864( 2011) 06-0054-07: : : 中图分类号 文献标识码文章编号 Effect ofCy tochalasin B on Microtubules,Microfilaments and Chomosomes Dung vto auaon of Bovine Oocyesrriin irMtrtit * * LIU Xin,HU Xiao-ming,BAI Chun-ling,CHENG Lei,GAO Yu, LIU Yang,LI Guang-peng ( Key Laboratory of Reproductive Biology and Biotechnology,Ministry of Education,Inner Mongolia University, Hohhot 01002,1Chna)i Abstact: Cytochalasin B ( CB) ,a reagenti nhibiting actin polymerization,can inhibit the assebmly of actin r and preventc ytokinesis and polar body ( PB1 ) emission,and it is usually used to study tfhoer mation and dynamic alignment and spearation was investigated after the oocytes weirenc ubated at the presence o, f5 7g / mL Theμ changeCB,s of moetc ( mtotc) apparatus, In ths study,the effect oCfB on meotc spnde confguraton,iiiiiiiilii results showed that CB inhibited the eimssion of PB1 and urletsed in the formation of abnormal chromosomepatterns o f chromosoma agnment and spearaton such as the ncompete separaton of homoogous chromosomes, CB treatmentlliiilil caused mieotic arrest at anaphase stage andi nduced the formation of 2 groups ocfh romosomes,which then omved? toward in proximity or merged nteirely to yield the formation of diploid oocytes, Meanwhile,CB treatmentl ed to the disfiguration of spindle microtubules and induced 2 spindles,a large spindle,and multiple-poles spindles, CB also affected thei cmrofilament distribution, Almost no or less microfilaments were observed around cthhreom osomes,and their distribution in the sub-cortical areas wasl ess and uneven, These reuslts suggested that imoseis require synergetic action of microtubules and microfilaments, CB caused thedi sfigurations of meiotic spindles by interfering the 收稿日期: 2011-03-01; 接受日期: 2011-06-09 dynamic : 863 2008AA10Z15) 9; 。( 基金项目国家 计划项目教育部科技创新团队基金资助 patternf ormation of microtubules and microfilaments,and ultimately inhibited the eimssion of polar bodies, : * mail: 。 ,,、。 E-作者简介刘 欣 与 胡 晓 明 为 本 文 共 同 第 一 作 者刘 欣硕 士 研 究 生主 要 从 事 卵 子 成 熟牛 体 外 受 精 研 究Key words: bovine oocyte; cytochalasin B; meiosis; microfilament; microtubule; chromosome liux- in12345,6 happy@16 3, com。,,、。 Email: huxiaomingthink @ 163,-胡晓 明硕 士 研 究 生主 要 从 事 卵 子 成 熟孤 雌 发 育 研 究 com。: ,,,。Tel: 0471-499432;9通讯作者李光鹏教授博 士 生 导 师主 要 从 事 哺 乳 动 物 生 殖 生 物 学 与 胚 胎 生 物 技 术 研 究 E-mail: guangpengli@ yahoo, com 7, 5 g / mL CB,CB 卵母细胞的成熟和受精过程须经历一系列细过程中添加 μ的 研究 对牛卵母 ,、胞核和细胞质的变化主要包括生发泡破裂极体 、 细胞减数分裂过程中微管微丝和染色体排列与、、、排放精子穿入雌雄原核形成迁移及雌雄原核 24 h、30 h、36、 h。分离的影响本 试 验 还 设 计 了 。48 h ,CB 的融合在这一复杂的减数分裂过程中细胞骨架 几个不同的时间段目的是研究延长 处 ,的组装与去组装起到关键的作用微丝是细胞骨 , 理时间对卵母细胞染色体倍性的影响以便更好 ,、架系统的重要组成部分与纺锤体旋转皮质颗粒 CB 的了解延长培养时间 对微丝的作用以及卵母 、、释放极体排放精子入卵及原核的形成和迁移等 。 细胞内部细胞骨架的动态变化,1 : 4,。,过程密切相 关此 外还 需 要 许 多 分 子 参 与 ,5,,6。 卵母细胞成熟的调控过程如白细胞介素 等 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ,卵母细胞的成熟是受精和胚胎发育的必要条 件通 ,过对其成熟机制的深入了解和掌握卵母细 胞的体 1, 1试剂 ,、外成熟体系将更加完善这必将推动体外 受精动: E、LH、FSH 体外培养主要试剂和无机盐类 2 、物克隆转基因动物生产及人类辅助生殖 等的迅速( Sigma) ,TCM199、FCS、PB( S GIBCO) 。 。发展因此微丝在卵母细胞成熟过程中 的作用也: ( -蛋白 检 测 主 要 试 剂一 抗 抗 小 鼠 α 。越来越受到关注关于减数分裂过程中 微管和微tubu- 丝组装的动态变化的研究在果蝇及低等 脊椎动物lin) 、( FITC FITCgoat,--二抗偶联的山羊抗鼠抗体 ,6 : 8,,爪蟾 中 较 为 广 泛而 对 于 哺 乳 动 物 的研究则anti-mouse IgG,sigma) ,( 透明质酸酶 日本和光制 ,9,10,,,主要集中于啮齿动物尤其是小鼠 ) ,TritonX-100 ( Armesco ) ,药株 式 会 社 多 聚 甲 醛 ,4,11,12,,13, 、也 有 一 些 关 于 大 动 物 如 猪马及 ( Merck) ,PI ( P4170) 。-染色液 ,14 : 16,,15, 。Li ,牛等的研 究等的 研 究 结 果 证 实牛 : 0, 8% 染色体倍 性 分 析 主 要 试 剂的 柠 檬 酸 ,( the 卵母细胞在正 常 培 养 条 件 下随 着 第 一 极 体 ,。 钠吉姆萨染液 first polar body,PB1) PB2) ( 和第二极体的排出几 B( cytochaasn B,CB)li细胞松弛素 。乎所有的可见细胞骨架成分都跟随极体排出其 , 除特别标明外本试验所用试剂均购 自 美 国,17,布日等对牛 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 过 程 中 染 色 体 Sigma 。公司 ,,的动态变化作了系统观察研究结果显示成熟培 1, 2 卵母细胞的采集和体外成熟 8 : 12 h 养 处于前中期的卵母细胞比率逐渐减少 将采自本地屠宰场的成年荷尔斯坦奶牛卵巢 I( metaphase,M) ,12 h 并进入中期 ??到 时达到 最25 : 30? 4 : 6 h 置于 生理盐水中于 内运回实验 。高峰 。2 : 3 10 mL ,室灭菌生理盐水清洗 次后用 注射 ,纺锤体是一种动态变化的细胞器其 形 成 和 ,器吸取卵巢 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的可见卵泡将得到的卵泡液倒 、形态 变 化 依 赖 于 微 管微 丝 及 相 关 蛋 白 的 变 6 cm ,入直径为 的塑料平皿内在实体显微镜下挑 ,18,。化胞内或胞 外 因 子 的 干 扰 都 能 改 变 纺 锤 体 , 选带有数层致密卵丘细胞的卵丘 卵母细胞复合 ,。的完整性进而影响卵母细胞减数分裂目前主 ( cumulus-oocyte complexes,COCs ) ,体 用 洗 卵 液 要是通过运用抑制微丝聚合或解聚的药物改变其 ( : M199 + 10 mmol / L Hepes+ 0, 026 mol / L成分为 ,在细胞中的原有形态从而研究其对细胞功能的 NaHCO+ 0, 1% ,M199 GIBICO 双抗其中 为 公司 3 。B( cytochalasin B,CB) 影响细胞松弛素 和细胞 ) 2 : 3 500 ,: 560 m L ,,平生产的商品液衡的成熟培养液的四孔板清洗 次后转入中每孔含 个预 D( CD) 。松弛素 都是抑制 微 丝 聚 合 的 药 物在 小 38, 5? 、5% CO在 和 饱 和 湿 度 条 件 的 培 养 箱 中2 ,CB 鼠中作用于卵母细胞后不影响染色体分离和 。 : M199+ 10培养正 常 成 熟 培 养液 的 成 分 为 ,,核分裂但是抑制纺锤体的旋转和胞质分裂最终 mmol / L Hepes + 0, 1 g / mL,1,+ 0, 01 IU / mL雌二醇μ 。,CB 导致极体 不 能 排 出因 而也 成 为 重 要 的 ,19,20,FSH + 1 IU / mL LH + 10% FBS。 。多倍体细 胞 和 胚 胎 产 生 的 诱 导 者而 且 在 ,CB 体细胞克隆研究中常用来破坏细胞质内微丝 1, 3试验分组 ,。系统的完整性提高卵母细胞的抗操作能力本 : COCs 7, 5 g / mL CB 试验组一部分 在含 μ的 ,试验以牛卵母细胞为研究对象在体外成熟培养 24 h; COCs 成熟培养液中培养 另一部分 先 在 正 13 56卷中 国 农 业 科 技 导 报 10 h,7, 5 g / mL CB常培养液中培养 然后转入含 μ,,后一些卵母细胞的同源染色体已经分离但并没 ,24 h、30 h、36 h 48 h。60 ,,的培养液中分别培养至 和 条有向末期发育而是停滞在后期形成包含 : COCs 24 h。,对照组在正常培养液中培养 染色 体 的 巨 大 纺 锤 体微 管 位 于 染 色 体 周 围3 。每组试验重复 次 ( 1-E) 。图 还有一些卵母细胞发育停止在后期?,100 L 培养结束后先用 μ移液器轻轻吹吸若 ( anaphaseortel ophase/ T),A或末期 ?? ?? ? , 干次以去除大多数的卵丘细胞然后将卵母细胞 ( 1-F :H ) ,图 其纺锤体微管不 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 散布于两组染0, 1% 1500 ,透 明 质 酸 酶 的 成 熟 液 中转入 含 ; T,,色体中间到达 ?期时纺锤体不呈锥形而 是r / min2 : 3 min 。 振荡 彻底去除卵丘细胞将脱 掉, 对称分布于两组染色体之间这将导致极体无法 PB1卵丘细胞的卵母细胞置于实体显微镜下检查 ; ,排出或形成了两个纺锤体微管分别位于两组染 ,。 的排放情况计算成熟率( 1-I) 。色体周围图 还有少数卵母细胞的染色体 ,,出现异常分离染色体之间有微管分布出现多极 1, 4 免疫荧光染色观察微管及微丝形态 ( 1-J :L ) 。纺锤体结构图 4% 分别将各试验组和对照组的卵母细胞经 多 ( PBS 1 h 4 ? , ) 聚甲醛配制室温固定 或 过夜固 PBS + 0, 3% BSA 。定后于 中保存 : 0, 3% BSA PBS 微管染色用含 的 将一抗稀 500 4? ,。 释 倍 后样 品 置 于 其 中 并 于 过 夜用 0. 3% BSA+ PBS 1 ? 500 清 洗 后 移 入 稀 释 的 二 抗 ,80 mn,10 g / mL i中室温避光孵育 清洗后在 μ碘 ( PI) 5 min 化丙啶中 避 光 孵 育 进 行 核 酸 荧 光 染 。( PBS ? = 1 ? 1 ) ,色加封 片 液 甘 油 封 片在 Nikon 80 、。i荧光显微镜下观察计数并照相 : 1?300 FITC 微丝染色样品于 稀释的 标记的 37? 80 min,10鬼笔环 肽 中 避 光 孵 育 清 洗 后 于 CB 1 图 处理对牛卵母细胞纺锤体微管的影响 g / mL 5 min。( PI) 碘化丙啶 中孵育 加封片液μFig, 1 Dynamic changes of imoetic spindles of bovine oocytesi ncubated in CB-containing media,封 绿色: 微管 蛋 白; 红 色: 染 色 体; A :D : 对 照 组。E :L : CB 处 理 组。 ,、。 片在荧光显微镜下观察计数并照相 A: M?期; B,F: A?期; C,G,H: T?期; D: M?期。E: 巨 大 纺 锤 体; 1, 5 卵母细胞染色体倍性分析 I: ; J :K : ; L: 两个纺锤体三 极 或 四 极 纺 锤 体染 色 体 扩 散 形 成 长 0, 8% × )将去除卵丘细胞的卵母细胞在 的柠檬不规则的纺锤体。型 ( 400 Microtubules appearin green and chromosinome resd , A :D : The con- 10 mn,? i酸钠溶液中 低 渗 然 后 用 甲 醇 冰 乙 酸 trol group, E :L : CBtreated na-B,F: A-Metaphase? ; = group, A: phase? ; C,G,H: Telophase ?; D: Metaphase? , E: A large spin- dle; I: Two psindles; J :K : Three and fopurola r spindles; L: 2. 5?1 。的液体固定在载玻片上在无尘的地方 2实验结果 Chro- 放 mosomla spread andlo ng irregular spindle formed, ( 400 ×) 24 h 1?100 25 min,置 后用 稀释的吉姆萨染液染 2, 1CB 对 牛卵母细胞成熟过程 中 纺 锤 体 微 管 10如果将卵母 细 胞 先 在 正 常 成 熟 液 中 培 养 ,,。 水冲洗晾干显微镜下观察并照相 和染色体分离的影响h,CB 24 h ,再转入含 的培养液中继续培养至 后 , 不同条件下培养的卵母细胞通过免 疫 荧 光卵母细胞 的 成 熟 状 态 及 其 纺 锤 体 形 成 状 态 与 经 染色的化学方法观察纺锤体微管的形态及染色体 CB 24 h ,处理 组的卵母细胞相似绝大多数 卵 未 。CB ,核相在未经 处 理 的 对 照 组 中卵 母 细 胞 成 PB1,( 1) 。能排出 纺锤体出现异常表 24 h PB1 ,M后绝大多数的卵排出 到达 ?熟培养 CB 30 h、36 h延长 对卵母细胞的处理时间至 ( metaphase ) 。?期各个阶段呈现出典型的纺锤 48 h ,和 时几乎所有处理组的卵母细胞均不能排 ( 1-A :D ) 。 ,CB 24h体相图 然 而在 经 过 处 理 PB1( 2) ,CB 出 表 而 未 经 处 理 的 卵 的 成 熟 率 为 7, 5 g / mL CB 1 表 牛卵母细胞经 μ处理不同时间的发育情况 Nuclear state ofb ovine oocytesi ncubated in 7, 5 g / mL media containing CB for different Table 1μ time, Irregular pattern of spindles 异常纺锤体 卵总数 / TMAM??? ?组别 Total * % )( % )2-( % )% )( ( 其他总数纺锤体巨大纺锤体 oocytes ( % )( % )( % )Groups *Total( % )Two psindles( % )Large spindle( % )Other(s % ) Control4738( 80, 9) A1( 2, 1) a8( 17, 0)a0000对照 662( 3, 0) B22( 33, 3) b25( 37, 9)8( 12, 1)13( 19, 7)4( 6, 1)24 hC B17( 25, 8) b 10 h + 14 hC B 13( 19, 4) b 24( 35, 8) b67 3( 4, 5) B 27( 40, 3) 14( 20, 9) 10( 14, 9) 3( 4, 5) 注: 同一列中不同大小写字母表示极显著( P ， 0, 01) 和显著( P ， 0, 05) 差异。* : 包括三极、四极纺锤体或染色体分离不均匀。 Note: Different capital and small letters mean very igsnificant and significant differences at P ， 0, 01 and P ， 0, 05 levels,respeectvey,il * : including triple and tetra-polar spindles,or chromosomeun equal separation, 7, 5 g / mL CB 30 h、36 h 48 h 2 表 在 μ的 培养液中延迟培养至 和 牛卵母细胞的发育情况 Table 2 Nuclear state of the oocytiensc ubated in CBcontaining media up to 30 ,h36 h and 48 h,- CB 在 中卵母细胞 Irregular pattern of 异常纺锤体 总数 / TMMA???? 培养时间 spndesil *Total % )2-( % )% )( ( % ) ( 总数纺锤体巨大纺锤体其他 Time in CB( % )( % )( % ) oocytes *Total( % )Two psindles ( % )A large spindle( % ) Other(s % ) media 0 h( )对照 10085( 85) A13( 13) a2( 2) b0000 Control 24 h905( 5, 6) B28( 31, 1) b13( 15, 3) a44( 48, 9)15( 16, 7)22( 24, 4)7( 7, 8) 30 h622( 3, 2) B21( 33, 9) b3( 4, 8) b36( 58, 1)8( 13, 0)24( 38, 7)4( 6, 5) 36 h552( 3, 6) B19( 34, 5) b1( 1, 8) b33( 60, 0)8( 14, 5)21( 38, 2)4( 7, 3) 48 h 47 0 16( 33, 3) b 3( 6, 3) b 28( 58, 3) 4( 8, 3) 17( 35, 4) 7( 14, 6) 注: 同一列中不同大小写字母表示极显著( P ， 0, 01) 和显著( P ， 0, 05) 差异。* : 包括三极、四极纺锤体或染色体分离不均匀。 Note: Different capital and small letters mean very igsnificant and significant differences at P ， 0, 01 and P ， 0, 05 levels,respeectively, * : including triple and tetra-polar spindles,or chromosomeun equal separation, 85% ,。 CB M,差 异 极 显 著对 这 些 经 处 理 的 未 排?期时 微 丝 均 匀 分 布 于 质 膜 下 方 皮 质 区胞在 PB1 31% :3 5% ( 2-A) ,M,,的卵母细胞进行分析表明停 止染色体周围没有分布图 ?期时随着极 M,49% : 60% ,, 在 ?期而有 的卵呈现异常纺锤体体的排出几乎所有的微丝都分配到极体中质膜 ( 2-B,C ) 。 CB 下方皮质 区 也 有 分 布 图 经 处 理 ,2 结构其中绝大多数为 个纺锤体或形成巨大纺 ,,后两组染色体周围没有微丝分布且皮质区微丝 ,3 、4 锤 体还 存 在 极极 纺 锤 体 等 异 常 形 态 ,的分布也变得不均匀或两组染色体周围虽然有 ( 2) 。30 h、36 h 48 h 表 延迟培养至 和 的卵母细 ,,微丝分布但是皮质区的微丝分布明显减少两组 24 h 。胞的纺锤体异常率高于 处理组而对照组 。M染色体中间出现微丝分布处于 ?期的卵母细 PB1 M。未排 的卵多数处于 ?期 ,( 2-D :J ) 。 胞皮 质 区 只 有 少 量 微 丝 分 布 图 经 2, 2 CB 处 理 对 牛 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 过 程 中 微 CB 24 h ,处理 后微丝在皮质区的分布与对 照 组 丝分布的影响 ,,差异不大但是染色体周围的微丝分布出现异常 ( germinal vesicle,GV) 、卵母细 胞 在 生 发 泡 两组染色体中间出现微丝分布或者微丝整个围绕 ( GV breakdown, GVBD ) 、生 发 泡 破 裂 前 中 期 ( 2D :F ) 。CB -在两堆染色 体 周 围 图 在 中 延 迟 ( PreM) M ,-?及 ? 期 时微 丝 主 要 分 布 在 质 膜 下 30 h ,,处理至 时染色体周围均没有微丝分布皮 ,; A的皮质区染色体周围没有微丝分布直到 ?和 ( 2G :H ) 。CB -质区也只有少量分 布 图 至 处 理 T; M?期两组染色体区可见有大量微丝围绕到? 36 h ,后染色体周围及皮质区都很少见到微丝分 ,PB1 ,期时随 着 的 排 出大 部 分 微 丝 随 极 体 排 ,15,。,CB ,( 2-I :J ) ,出本实验中观察到未经 处理的卵母细布胞质中有少许不集中的微丝分布图 13 58卷中 国 农 业 科 技 导 报 2-K) 。( 而且还有染色体分离异常的情况出现 图 PB1 的 卵 母 细 胞 进 行 染 色 体 分 析 表对这 些 未 排 CB 48 h ,70%3 )到 处理 后卵母细胞的形态遭到严重破,( 明约 的 卵 母 细 胞 为 二 倍 体 表 ( 3-D :F ) ,M3A-( ,( 2L) 。图 部分 卵 母 细 胞 处 于 ?期 图 -坏且细胞中鲜有微丝分布图 B) 。40% : 59% 60处理组中有 的卵母细胞形成 ( 3 ) 。80%条染色体 表 对 照 组 的 卵 母 细 胞 中 有 M ,30 ,发育到? 期染 色 体 为 条数 目 清 晰 可 数 ( 3-C) 。图 CB 2 图 处理对牛卵母细胞体外成熟过程中 微丝分布的影响 Fig, 2 The effect oCfB on microfilament organization during in vitro maturation of bovine CB 3 图 处理牛卵母细胞染色体倍性 G、oocytes, Fig, 3 Chromosomal analysis of bovine oocytes 30 h 处理组; IK 36 h 处理组。A: M?期,B、C: M?期; D: M?H: -: :C : ; D :F : 24 h : ; : ; A 绿色微丝红色染 色 体对 照 组处 理 incubated in CBcontaining media,- ; E、F: A; G: M ; H: 2 M ; J: 2 ; I: 期? 期? 期个 纺 锤 体? 期个 纺 锤 ;组 ; K: ; L: 48 h 2 。( 400 ×) ,A: M; B: M,; C: M; D :F : 60 体染色体异常分裂处理组个纺锤体?期?期四分体?期有 条染色体的 Microfilaments appearin green and chromosinome rse d, A :C : The 2 n , ( 1 000 )× 卵母细胞 contro group D :F : CBtreated for 24h ; G :H : CBtreated for 30h l;--;A: Mchromosome; s B: Tetrad aMt ; C: n = 30,M; D :F :? ?? I :K : CB-treated for 36h , A: M; B and C: M; D: M; E and??? 2n = 60, ( 1 000 )× , F: A; G: M ; H: Two psindles; I: M ; J: Two psindles; K:??? Chromosomerr eguar separaton L: CBtreated for 48 ,htwo spndes,ili;-il 3( 400 ×) 讨论 CB、CD 微丝组装和聚合的抑制剂如 等 通 常 2, 3染色体倍性分析 ,。被用于细胞骨架的研究尤其是微丝的形成在 10 h,7, 5在正 常 培 养 液 中 培 养 再 转 入 含 ,CB GVBD 、小鼠中处理不影响 的发生染色体凝 g / mL CB 24 h、30 h、36 hμ的 培养液分别培养至 ,、 集及纺锤体的形成但会抑制纺锤体的旋转胞质48 h 95% PB1。,和后以上的卵母细胞均未能排出 3 CB 表 处理不同时间的牛卵母细胞染色体倍性分析 Table 3 Chromosomal analysis of bovine oocytesi ncubated in CB-containing media for different time, PB1 无 卵母细胞染色体倍性分析PB1 卵母有 卵总数 Chromosomal analysis of oocytes without PB1 ( % )细胞组别 Total *oocytes OocytesGroups % )2n ( 2n = 602n = 2 × 30卵总数( % ) 四分体总数 其他 *with PB1 Tetrad( % )2n oocytes( ( % )% )TotalOther(s % ) Control4435( 79, 5)98( 88, 9) a1 ( 11, 1) a01( 11, 1) a0对照 24 h483( 6, 3)458( 17, 8) b18 ( 40, 0) b14( 31, 1) a32( 71, 1) b5( 10, 4) 30 h432( 4, 7)419( 22, 0) b24 ( 58, 5) b5( 12, 2) b29( 70, 7) b3( 7, 0) 36 h562( 3, 6)5411( 20, 4) b31 ( 57, 4) b7( 13, 0) b38( 70, 4) b5( 8, 9) 48 h542( 3, 7)528( 15, 4) b26 ( 50, 0) b11( 21, 2) ab37( 71, 2) b7( 13, 0) 注: 同一列中不同小写字母表示差异显著( P ， 0, 05) 。* 包括同源染色体分离不完全或染色体分离不均匀,染色体成凝集状。 Note: Different small letters mean isgnificant differences at P ， 0, 05 level, * : including chromosomune equal or incomplete separation,chro- mosomes became condeinns ecldu mps, ,1,,21, 。Longo Chen,分裂及极 体 排 出和 也 发 现 用母细胞激活后极体的正常形成与微丝富集区覆 。B GVBD盖纺锤体密切相关动物细胞在分裂时会出现收 细胞松弛 素 处 理 不 影 响 小 鼠 卵 母 细 胞 ,。,。 缩环以形成分裂沟收缩环由微丝组成人卵母 的发 生但 纺 锤 体 和 染 色 体 不 能 迁 移 到 皮 层 区 Jasplakinolide 是一种促进微丝的聚合和稳定的细胞晚末期时在卵母细胞与第二极体形成的分裂 ,26,,CB ,药 物与 的作用相反同样能阻止纺锤体向卵。当 肌 动 蛋 白 沟处可观 察 到 肌 动 蛋 白 收 缩 环,22,,3,。母 细胞皮质 的 的 迁 移用 抑 制 微 管 组 装 的 药 ,。微 丝 被 破 坏 时小 鼠 的 极 体 排 放 将 受 抑 制 ,1,,物 处理小鼠卵母细胞时则不影响染色体向皮层Zhu 等在小鼠卵母细胞体外受精和孤雌激活过 ,GVBD 的 迁移表明 的发生及减数分裂纺锤体的CB ,程中用 处 理影 响 了 纺 锤 体 的 旋 转 和 极 体 的 ,形 成不受微丝的调节然而染色体的迁移依赖于, 排放卵母细胞形成了另外一个雌原核而未排出,21,,14, 。Kim CB 微 丝等用 处 理 牛 卵 母 细 胞 的 研 。第二极体通过在猪卵母细胞体外成熟培养过程 ,23, 。究 中也有相似 的 研 究 结 果类 似 的 结 果 在 人CB ,中用 处理 来 抑 制 第 一 极 体 的 排 放也 可 得 到 的 ,20,。二倍体孤雌胚胎 。,27,研究中也有体现, 在本课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 组最近的报道中发现用浓度为CB 本实验结果说明 处理没有影响卵母细胞 0, 1 g / mL、0, 2 g / mL、0, 5 g / mL 1, 0 g μμμ和 μ,CB 同源染色体的分离的抑制作用主要体现在减 / mL CB 24 h 处理卵母细胞 后的成熟率与对照组数分裂进入后期及随后的纺锤体和染色体向皮层 ; 10 h CB ,著无差异显 正常培养 后用 处理卵母细胞时 。GVBD 迁移的过 程 中这 进 一 步 证 实 及 减 数 分 1, 0 g / mL、3, 0 g / mL、5, 0 g / mL 在 μμμ和 ,裂纺锤体的形成不受微丝的调节但染色体的移 7, 5 。动依赖于微丝 g / mL; μ浓度时均 降 低 了 卵 母 细 胞 的 成 熟 率对 ,20,Somfai CB ,等用 处 理 猪 卵 母 细 胞 发 现同 未 ,源染色体先分离为两组后来又聚在一起形成类 排 极 体 的 卵 母 细 胞 进 行 染 色 体 倍 性 分 析 发 现M。似 ?期的纺锤体结构表明同源染色体分离后 50% ,30 以上是二倍体染色体或是分为两组各 条 ,,进入 后 期但 未 能 迁 移 至 皮 层 区而 后 又 逐 渐 靠 60 。或是 条聚在一起 ,,近最终会聚在一起而形成巨大纺锤体结构这与 ,CB 本实验 中 观 察 到在 经 处 理 后 未 排 极 体 。CB 本实验结果一致本实验中还观察到 处理并 ,70% ( 3 ) ,60的卵母 细 胞 中约 形 成 了 二 倍 体 表 ,没有影响微管的形成而是通过破坏微丝聚合与 30 条染色体或分为两组各 条或是聚到一起呈规 80% M,30 ,。发育到 ?期染色体为 条形成单倍体 ,解聚的动态平衡导致纺锤体形态的改变从而阻 。CB 则或分散排列而未经 处理的卵母细胞中有 PB1 处理 组 还 有 少 数 未 排 的 卵 母 细 胞 同 源 染 色 。碍了纺锤体正常功能的运行 ,24, ,。 体分离不完全或染色体分成几堆由染色体倍Hewitson nocodazole 等用微管聚合抑制剂 ,CB 24 h 2 30 性分析数据可看出处理 组的 组 条 ,处理仓鼠卵母细胞导致纺锤体的破坏染色体分 ,CB 30 h 36 h 染色体的卵的比率高于 处理 组和 ,,离不能发生即核分裂被抑制表明微管在染色体 3) ,CB ( 组表 这 可 能 是 因 为 随 着 处 理 时 间 的 延 、。 分离运 动 和 核 分 裂 中 也 具 有 调 节 作 用经 ,长受到抑制的两组染色体形成的两个纺锤体或 nocodazole,处理的卵部分会出现多极纺锤体可能 。48 h 是迁移至很 近 或 是 又 聚 到 一 起而 培 养 到 是因为纺锤体微管的解聚导致了染色体行为的异 2 30 ,,后含 组 条染色体的卵数又减少可能是因 ,常重新组装的纺锤体和染色体的异常导致非整 ,CB 为继续延长处理时间到一定限度后的抑制作 。,倍体的产生这些研究结果表明减数分裂过程 ,用有所减弱微丝又部分组装重新引起染色体的 ,,20, 中微丝和微管是协同作用的但其协同作用的详 。CB 分离相似 的 现 象 在 处 理 猪 卵 母 细 胞及 ,16,,。细机制还不是很清楚需要进一步地研究 nicotine 。处理牛卵母细胞中也能观察到 减数分裂过程中染色体的正常分离对卵母细 牛卵母细胞成熟培养过程中加入抑制微丝聚 ,胞的正常发育至关重要纺锤体微管促使染色体 CB,,合的药物 抑制了微丝的动态组装改变了微 ,。,丝的正常分布出现多种异常分布情况这不仅 向相反的方向移动其分离受到抑制会导致极体 ,25, ,。Webb 不能排出从 而 产 生 二 倍 体等发 现 卵 13 60卷中 国 农 业 科 技 导 报 ,14, Kim N H,Cho SK ,Choi S H,et al, ,T he di stribution and ,影响了微丝的功能也影响了纺锤体微管的正常 requrements of mcrotubues and mcrofaments in iiliil,形态及其功能的行使从而抑制了染色体的正常 bovine ,分离与迁移和极体的排放最终导致多倍体细胞 oocytesd uring in vitro maturation,J,, Zygot,e2000,8: 25 , 32, ,。的产生影响了卵母细胞的成熟和受精 ,15, Li G P,Liu Y,Bunch T D,et al, ,A symmertic division of spnde mcrotubues and mcrofaments durng bovne meossililiiliiii 参 考 文 献 from mepthaase? to metaphas?e , J,, Mol, Reprod, Dev, , 1,Zhu Z Y,Chen D Y, Li J S, et a, , Rotaton of ,li 2005,71: 220 , 226, meiotic spindle is controlled by microfilaments in mouse ,16, Liu Y,Li G P,Whte K L,et a, , Ncot ne aters iliil oocyte,sJ,,Bi ol, Reprod, ,2003,68: 943 , 946, bovine ,2,Dmaggo A J, Lonergan T A, StewratSavag e J, Cortcaii-il oocyte imoesis and affects subsequberntyon iecm development granule exocytosis in hamster eggrseq uires microfilaments,J,, Mol, Reprod, Dev, ,2007,74: 1473 , 1482, ,J,,Mo l, Reprod, Dev, ,1997,47: 334 , 340, ,17, 其布日,白春玲,程 磊,等, 牛体外成熟卵母细胞染色体形 ,3,Maro B,JohnsonM H,Pickering S J,et al, , Change sin actin 态学研究,J,, 中国牛业科学,2009,35( 4) : 1 , 5, distribution during fertilization of the mouse egg,18, BartonN R,Goldstein L S B, Going mobile: Microtubule ,J,, J,Em bryol, Exp, Morphol, ,1984,81: 211 , 237, motors and chromosomre eg atseong,J,, Proc, Nat, Acad,il Sun Q Y,Lai L,Park K W,et al, ,D ynam ic events ardei ffer- ,4, Sci, USA,1996,93: 1735 , 1742, ently mediated by microfilaments,microtubules,and mitogen- ,19, Tarkowsk A K,Wtkowska A,Opas J, Deveopment of cytochiil- activated protein kinase during porcine oocyte muartation and alasin B-induced tetraploid and diploid / tetraploid mosaic fertilization in vitro,J,, Biol, Reprod, ,2001,64: 879 , mouse, 6 ,,,889,杨美玲 赵锡安刘东军等白细胞介素 及其受体在绵,5, embryo,sJ,, J, Embryo, Exp, Morpho, ,1977,41: 47 , 64,ll,J,, 羊 卵母细胞成 熟 过 程 中 的 表 达中国农业科技导 ,报 ,20, Somfai T,Ozawa M,Noguchi J,et al, ,D iploid porcine par- thenotes produced i nhby ibi tion of first polar body 2009,11( 5) : 71 , 76, ,6, Endow SA , Microtubule motors in spindle and chromosomeextrusion motility,J,, Eur, J, Biochem, ,1999,262: 12 , 18,durng in vtro maturaton of focuar oocytesiiillil ,7, Tavosnais G,Llamazraes S,Goulielmos G,et al, ,E ssent ial,J,, Reproduc- tion,2006,132: 559 , 570,roe for γtubun in the acentroar femae meotc l-liillii ,21, Longo F J,Chen D , Deveopment of c ortca poarty Ylillispindle of ,8, Drosophila,J,, EMBO J, ,1997,16: 1809 , 1819,in assebmly of imcrotubules and motors,J,,Nat, Cell Wittmann T,Hyman A,Desai A, The spindle: a dynamicmouse egg: s involvemnet of the imoetic apparatus,J,, Dev, Bo, ,il 2001,3: E28 ,E 34, Biol, ,1985,107: 382 , 394, ,9,Brunet S,Maria A S,Guillaud P,et al, ,Kinetochore fibers ,22, TeradaY ,Simerly C ,SchattenG , Mcrofament stabzatoniililii are not nvoved in the formaton of thef rst meotc iliiiiby jasplakinolide arrests oocyte u ramtaiton, cortical spindle in granule mouse oocyt,esbut control the xeit from the fi rst meiotic exocytoss,sperm ncorporaton coner esorpton,and cecyceiiiill-l M progression,but not DN A replication,during fertilization phas,eJ,, J, Cell Biol, ,1999,146: 1 , 11, ni ,10, Sanfns A,Lee G Y,Plancha C E,et a, , Dstn ctons niliiii mice,J,, Mol, Reprod, Dev, ,2000,56: 89 , 98, meiotic spindle structure and balssy edmuring in vitro and in ,23, Kim N H,Chung H M,Cha K Y,et al, , Microtubule and vivo maturation of mouse cyoote,sJ,, Biol, Reprod, ,2003, microfilament organization in maturing human cooytes ,J,, 69 2059 , 2067,: Hum, Reprod, ,1998,13: 2217 , 2222, ,11, Kim N H,Funahashi H,Prather R S,et al, ,M icr otubule and ,24, Hewitson L, Haavisto A, Simerly C, et al, , Microtub ule microfilament dynamics in porcine oocytes du ring organization and chromatin configurations in hamster cooytes meiotic durng fertzaton and aprthenogenetc actvaton, and iiliiiiimaturation,J,, Mol, Reprod, Dev, ,1996,43: 248 , 255, after ,12, Wang W H,AbeydeeraL R,Prather R S,et al, ,P olym eriza- insemination with human pesrm,J,, Biol, Reprod, ,1997, tion of nonfilamentous actin into microfilaments is an 57: 967 , 975, important ,25, Webb M,Howletts K,Maro B, Parthenogenesis and cytoskele- process foporr cine oocyte muartation and early embryod evelop- ton roganization in aging mouse egg,sJ,, Embryol, Exp, ment,J,, Biol, Reprod, ,2000,62: 1177 , 1183, Morph, ,1986,95: 131 , 145, ,13, Tremoleda J L,SchoeversE J,StoutT A,et al, ,O rgan ization ,26, Pickering S J,JohnsonM H,Braude P R,et al, ,C yto skeletal of thec ytoskeleton during in vitro maturation of horse cyootes organization in fresh,aged ands pontaneously activated human ,J,, Mol, Reprod, Dev, ,2001,60: 260 , 269, oocyte,sJ,, Hum, Reprod, ,1998,3: 978 , 989, ,27, Bai C L,Liu H,Liu Y,et al, ,D iplo id oocytef ormation and