【doc】以魔芋葡甘聚糖凝胶为载体亲和层析分离纯化猪血SOD
以魔芋葡甘聚糖凝胶为载体亲和层析分离
纯化猪血SOD
.;一)Lf,7
第l2卷第3期
1996~6月
生物化学杂志
Chi.
neseBiochemicalJournal
仁
Vo1.12.No.3
Jun.,1996
以魔芋葡甘聚糖凝胶为载体亲和层析分离纯化猪血SOD' 周立郑远旗
t四川大学生糟南
李建吾蒋磊
成都6D)0643l…610~)41(中国科学晓或都生物所,或)
摘要以魔芋葡甘聚糖(KGM)凝胶作为铜金属螫合亲和层析的载体一步亲和纯化猪
,了7
血SOD,得到电泳均一.比活为8622U/rag,纯化倍数为77.8倍的SOD,其回收率为 85.4
关键擢,,
琼脂糖凝胶(Sepharose)和葡聚糖凝胶(Sephadex)是两种优良的分离纯化大分子蛋白质的
亲和载体.在长期的科学研究中已得到证实,但因价格昂贵给一些研究工作造成困难,因此开
发新的价格低廉,效果良好的分离介质是非常必要的,而魔芋葡甘聚糖
(KonjacGlucomannan,
简称KGM)凝胶具有成为这类载体的可能.
KGM凝胶是来源于在我国分布广泛,品种繁多的天南星科植物魔芋的一类复合多糖,是
葡萄糖与甘露糖以1,4一糖苷键连结而成的分子量为10的大分子糖类,在一定条件下交联形
成的网状结构,多孔网状的KGM凝胶具有机械强度高,化学惰性,理化性质稳定,流速好等亲
和载体的基本属性u'.
超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,简称SOD)是生物体内的具有歧化超氧化物阴离
子自由基成为o和HO:的一类金属蛋白酶,对机体具有保护,抗炎,止血和防止细胞老化等
功能,我们已用SephadexG一200作载体亲和纯化出高纯度,高比活SOD].本文报道用KGM
凝胶作为亲和载体分离纯化SOD,与SephadexG一200作载体分离SOD作比较,探讨KGM凝
胶作为亲和载体的可能性.
1
材料
关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料
和
方法
快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载
11材料
KGM凝胶(中科院成都生物所提供),硼氢化钠(Merck产),丙烯酰胺和考马斯亮蓝R一
250(Fluka产),其余试剂均为国产分析纯.
1.2KGM凝胶特性检测
KGM凝胶稳定性,膨胀度及机械强度[:取KGM凝胶加等体积的含0.5硼氢化钠的2
mol/L氢氧化钠溶液,在沸水浴中加热4h,观测其稳定性;取KGM凝胶25ml,乙醇脱水烘干,
祢重,以m1湿胶每g干胶值为膨胀度,即柱床体积;将KGM凝胶装1×40cm柱,
在恒压作用
?国家自然科学基金资助项目
收稿日期:19999321.修匠日期:199506g9
344
下,用蒸馏水洗柱,观测在连续运转过程中流出液的流速,以评价KGM凝胶的机械强度,即流
速的稳定程度.
KGM凝胶排阻分子量范围:将蓝色葡聚糖2000分别与胰蛋白酶,牛血清白蛋白和铁蛋白
等量混合,用pH7.o的0.05mol/L磷酸缓冲液溶解使每种物质为10mg/ml,取0.25,0.3ml
上1×40cm的KGM凝胶柱,以同种缓冲液在10.2滴每分每厘米的泵压下进行洗脱以检测
KGM凝胶的排阻限度,确定应用范围.
1.3SOD的分离纯化
屠宰猪血经抗凝离心得红细胞,血红蛋白按Yasuda方法除去,Cu一金属螯合柱以KGM
凝胶为基质,按Hemdan和Porath方法制备,SOD活性测定用邻苯三酚自氧化法.,蛋白质
测定按Lowry法,PAGE按莽克强等:的方法,SOD紫外光谱测定在岛津uV一240记录式紫外
分光光度计上进行.
2结果
2.1KGM亲和层析凝胶载体性能
稳定性,膨胀体积及流速:以下凝胶的湿态粒径均为l1O,220um,按前述方法对不含和
含琼脂糖的KGM凝胶进行稳定性实验,均未见软化和溶解变形现象,表明KGM凝胶抗碱耐
温性能好.膨胀度和机械强度实验结果如Table1,
Table1Bedvolumesandflowrateso/theKGMgelcarriers
由Table1可见各种不同的KGM凝胶都有一定的膨胀度,即一定的柱床体积,随琼脂糖
量的增加而增加,其变化范围为14,41,1ml湿胶每克干胶,相当于SephadexG--7550G一200的
床体积;各种不同的KGM凝胶都有一定的机械强度,但随琼脂糖量的增加而变小. Table1所述的未含琼脂糖的KGM凝胶能将蓝色葡聚糖(>10)与胰蛋白酶(为2.4
×10)完全分开,表明后者进入了多孔的KGM凝胶孔穴;用KGM/Agarose=2.5:1.O
的凝胶
能完全分离蓝色葡聚糖与牛血清白蛋白(BSAM为6.7×104),显示BSA进入了多孔的KGM
凝胶,此凝胶同样能完全分离蓝色葡聚糖与铁蛋白(M为4.8×10)的混合物,表明铁蛋白也
进入了此凝胶的网孔,由此可推断对于高于KGM/Agarose一2.5:1.0中琼脂糖浓度的KGM
凝胶,铁蛋白或比铁蛋白还要大的蛋白分子可进入多孔的KGM凝胶孔穴. 根据文献[8],SephadexG一200X~球蛋白的工作范围为分子量5×10,5×10,而铁蛋白的
分子量为4.8×10可进入含琼脂糖大于28.6的KGM凝胶,说明本法制备的多孔性KGM凝
胶的排阻限度?SephadexG一200的排阻界限,可用于分子量小于10的生物高分子物质的分离
345
纯化.
2.2用KGM/Agarose=2.0:1.0的KGM凝胶分离SOD
去除血红蛋白的SOD粗酶液,用0.2mol/L
Na2HPO}调pH至8.3,上用pH8.3的0.05mol/L
PB,0.2mol/LNaC1平衡的Cu—KGM亲和层析
柱(1.2×8cm)分离纯化SOD,用平衡液洗去杂
蛋白后.用pH6.0的0.05mol/LPB,0.5mol/L
NaC1洗脱SOD,3.5ml/管收集,流速为
16ml/h.洗脱曲线见Fig.1,由Fig.1可见洗下单
一
的具SOD活力的蛋白峰.
上柱SOD总活力为82392U,KGM亲和层
析后可得总活力70359U,活力回收为85.4,
SOD比活为8622U/mg,纯化结果见Table2.
Fig.1CopperchelateMfinitychro~tographyof porcineSODonKGMgelcolumn
Theflowratentednedttt16ml/h.Colu田n:12
×8till
?—?A2?C—CSODactivity
Table2ThepurificationofporcineredcellsSOD 所得SOD经PAGE为一条带(上样量60g,Fig.2),其紫外吸收光谱为特征图谱 (Fig.3).
垂rig.2Thepictureelectrophoresisofporcine redcellsSODinpolyacrylamldegel
用本文报道的KGM凝胶作为亲和载体纯化SOD,在亲和柱的SOD饱和吸附量,回收率,纯化
倍数方面与SephadexG一200作载体金属螫台亲和层析SOD比较结果见Table3. 346
F.3TheuVsp~trumofSOD
Table3SODpurificationcomparisonintwosubstrate
3讨论
用KGM凝胶为载体,金属螯合亲和层析分离纯化猪血SOD,得到电泳均一,比活高达
8622U/mg,纯化倍数为77.8的SOD,由此可见KGM凝胶为载体亲和纯化SOD是可行的.
由TabM3可见,KGM凝胶作为Cu一金属螫合亲和层析的载体与SephadexG-200作为载
体分离纯化SOD比较每毫克湿凝胶对SOD的吸附单位相近,SOD的活力回收稍低于
SephadexG200,且对SOD的纯化倍数高于SephadexG一200,这样看来KGM凝胶作为载体纯
化SOD基本能达到或近似SephadexG一200的效果,所以从金属螯合亲和纯化SOD的角度,
KGM凝腔是可以替代SephadexG一200的.不同KGM/Agarose比例的KGM凝胶与Sepharose
4B性能比较分离sOD及其它生物大分子工作正在进行(另文发表).由于KGM凝胶的价格
大大低于Sephadex@200,所以在生物大分子的研究中,KGM凝皎是一种具有发展前途的载
体.
从实验中发现,KGM凝胶的抗碱性比SephadexG一200稍差,在其制备过程中需加以改
进.
参考文献
1贾成禹,等.生物化学杂志,1988.4;4O7—413
2周立,等生物化学杂志,1989,5;265—269
3贾成禹,等生物化学杂志,1991,3:359--364 4YasudaFrDernaMe.FR}1980.2:485,203 5HemdanES,Por毗hJ.JC一,,1985,323:247
6邹国林,等.生物化学与生物物理进展,1986.(4)一71
7莽克强,等.聚丙烯酰胺凝腔电诛.北京:科学出版社,1975
8林卓坤主编,色谱法(--),第一版.北京:科学出版杜,1982:67
PurificationofPorcineSoDhyMetalChelateAffinity
ChromatographyUsingKGMGelasSnbstrate
ZhouLiZhengYuan—QiLiJian—WuJiangLei
(BiologyDeparlmenlofSichuanVnlvers~ty,Chengdu610064)
JiaCheng—Yu
(ChengduInstituteofBiology,AcodemiaSinica,Chengdu610041)
AbstractKGMgelwasusedassubstrateforchromatography,epichlorohydrinasactivitorand
iminodiaceticacidasligands,thenCuwaschelatedtoformCu—metalchelateanntychro—
matographiccolumn.TheSODinprocineredcellswaspurifiedtohomogeneousinonestepaffini—
tychromatography.Itsspecficactivityis8622U/mg,yieldis85.4andthepurificationfactoris 77.8.ItwasdiscussedthatitispossiblethatSephadexG一
200couldbesubstitutedbyKGMgelin
biologicalmacromoleculeinvestigation.
Keywords{KGMge1.Superoxidedismutase,Metalchelateaffinitychromatograph 347