一种用于快速评价防腐体系效果的半定量挑战性试验方法及试验结果分析

一种用于快速评价防腐体系效果的半定量挑战性试验方法及试验结果 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 一种用于快速评价防腐体系效果的半定量 挑战性试验方法及试验结果分析 一 ' 种用于快速评价防腐体系效果的半定量挑战性 试验方法及试验结果分析 苏州贝侬生化(工业园区)有限公司丁家宜生化研究中心,苏 州215000 …………………………………… 马立伟谢祯壑许至安 介绍了一种半定量微生物挑战性试验方法(kok0test),该方法选取了7株细菌.1株酵母菌?2株霉菌作为试验菌株,对防 腐剂组成为:0.0095甲基异噻唑啉酮(MIT),0.2对羟基苯甲酸甲酯(MP),1%对羟基苯甲酸丙酯(PP)的3款产品进 行防腐效能检测,同时采用美国药典方法(USP方法)和国际化妆品,香精和洗涤剂协会方法(CTFA方法)进行验证,通过28 天的试验,我们发现该挑战性试验方法试验结论可靠,可行性好,操作更为便捷. 微生物挑战性试验化妆品防腐USP防腐效能试验CTFA防腐效能试验 ASemi-quantitativelyTestMethodforthePreservativeEfficacyandtheAnalysisofTestRes ults MALiweXIEZhenheXUZhiaN (ResearchCenterofBanon—GanonBiochemistryCo.,Ltd..Suzhou21500,China) AbstractAsemi—quantitativelymicrobialchallengetestmethod(kokotest)isintroducedinthisarticle.7strain sofbacteria,1 strainofyeast.2strainsofmouldarechosenasrepresentativechallengingmicroorganisms.th epreservativeefficacyof3cose— meticproductsareestimatedbythismethod.thepreservativesystemis:0.(/095methyothiazo "none(MIT).0.2meth— ylparaben(MP),0.1propylparaben(PP).ConfirmingwiththetestmethodofUSPandCTFA.t hekokotestmethodshowed theadvantageofcredibleresultsandconvenientoperationwithin28dexperiments. Keywords:microbialchallengetestcosmeticpreservationUSPchallengetestCTFAchallen getest 挑战性试验(microbialchallengetesting)也称 "防腐效能试验",是根据化妆品生产和消费者使用 中可能存在的污染(一次污染和二次污染).人为地 将一定量的微生物加到产品中,然后间隔一定时间 分析该产品中防腐剂对微生物的作用,按检测期间 的含菌量来评判防腐剂的防腐效果.目前常见的 挑战性试验方法有USP(美国药典)方法,CTFA(国 际化妆品,香精和洗涤协会)方法,另外还有快速 检测法,如线性回归法.目前我国现行的《化妆品 卫生 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 》(2(/07年版)中只针对化妆品中微生物检 测方法做了说明,并未就挑战性试验细则进行规 收稿日期:2010—07—2O ——— 24———WWW.ffc—journa1.com 定.USP方法同CTFA方法微生物接种方式采取 纯培养或混合培养,结果观察采用倾注平板计数 法.两种方法都给出了明确的判定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,相比而言, CTFA方法更为严格和实用.线性回归法微生物 接种方式采取纯培养,分析各微生物的D值,操作 较为苛刻,有较高的研究参考价值. 本文介绍一种半定量微生物挑战性试验方法 (kokotest),该方法源于德国舒美公司,该方法在进 行产品防腐体系筛选及评判时具有较高的应用价 值,本文就该方法的实施及合理性进行了阐述. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1试验菌株 测试用细菌和霉菌均购自广东省微生物菌种 保藏中心. 细菌包括:大肠杆菌,克雷伯氏肺炎杆菌,绿 脓杆菌,金黄色葡萄球菌,荧光假单胞菌,恶臭 假单胞菌,藤黄微球菌.酵母菌包括:白色念珠 菌.霉菌包括:绳状青霉菌,黑曲霉. 1.2样品及防腐体系 选择了一种化妆品中常用的防腐体系进行研 究,组成为:甲基异噻唑啉酮(MIT),对羟基苯甲 酸甲酯(MP),对羟基苯甲酸丙酯(PP),见表1. 表l样品名称及防腐剂组成 样品名称产品类型防腐体系 样品1面膜类MIT:0.0095,MP:0.2,PP:0.1 样品2防晒类MIT:0.0095,MP:0.2,PP:0.1% —— 样品3膏霜类MIT:0.0(}95,MP:0.2,PP:0.1 样品4 膏霜类无 (对照) 1.3半定量挑战性试验(kokotest) 本方法由德国舒美公司(Schuelke)公司提供. 称取各测试样品25g,加入混合细菌酵母及霉 菌悬液,细菌加菌量为10.cfu/g样品,酵母及霉菌 加菌量为10,10spore/g样品,每7d加入混合菌 悬液一次,充分混匀,置于30|C,7d后(下一次加菌 前)通过棉签混匀样品并进行平板涂布, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 平板 上微生物生长情况,样品涂布顺序见图1.微生物 生长情况评判标准见表2. 防腐能力评判标准:通过平板涂布法观察微生 物生长情况来评估防腐效果.第一次出现微生物 菌落所需的时间越长,防腐效果越好.经验表明, 防腐措施充分的产品应在6个加菌循环后仍无微生 物生长,以确保其在保质期内的微生物安全期达30 个月),称之为防腐效果优异.在本文研究中,为了 便于同USP及CTFA方法进行比较,我们选取了4 个接种循环(28d). 图1样品涂布顺序 表2微生物生长情况评判 符号说明 无生长 +少量生长 ++中度生长 大量生氐 ++++严重生长 C覆盖表面 1.4一次加菌的28d微生物挑战试验(USP方法) 参照美国药典(USP)方法l1],称取各受试样品 30g,2份,分别加入混合细菌或混合霉菌悬液,细 菌加菌量为1×10cfu/g样品,酵母及霉菌加菌量 为10,10spore/g样品,充分混匀,置于3O?,在 接菌的0d,7d,14d,21d和28d取样分析: 准确称取1g样品,加到含有玻璃珠的锥形瓶内,加 入9mID/E中和肉汤培养基,震荡混匀,此悬液为 1:10的稀释液;然后再用灭菌生理盐水按10倍依 次稀释.倾注平板法_2进行微生物计数.评判标准 为:当每克样品一次加菌后,在14d存活菌量减少 至不高于起始浓度的0.1,以后逐步减少,在28d 为0.符合此标准为防腐剂有效,不符合为防腐剂 无效. 1.5重复加菌的微生物挑战性试验方法(CTFA 方法)[ 称取受试样品30g,每隔7d加菌一次(即试验 的第0d,7d,14d,21d),细菌加菌量为10cfu/g样 品,酵母及霉菌加菌量为10,10spore/g样品. 在加菌后的7天(下一次加菌前)取样分析样品中的 含菌量,方法同前,评判标准如下: (1)防腐效果优良(W:wellpreservative),即四 次加菌后,每次加菌后的第7天时,存活菌量减少至 不高于起始浓度的0.01.(2)防腐效果尚可(M: marginalpreservative),每次加菌后的第7天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0.1%.(3)防 腐效果差(p),每次加菌后的第7天时,存活菌量> 1000,卺 1.6防腐剂含量的检测l3 1.6.1试剂与仪器 甲基异噻唑啉酮(MIT),对羟基苯甲酸甲酯 (MP),对羟基苯甲酸丙酯(PP),由美国DOW公 司提供.甲醇,色谱纯,德国Merck公司.岛津快 速液相色谱UFLC系统,PromineneceUFLC 1.6.2色谱条件 色谱柱:Shim—PackVP—ODS(250X4.6mm. www.fro—journa1.com——25—— 5m),柱温:30.C,流动相:V(甲醇):V(水):55 :45,添加0.4乙酸,流速:1mL/min,检测波长: 275nm,进样量:10"L. 1.6.3储备溶液和样品溶液的配制 称取MT,MP,PP,用甲醇定容至刻度,摇匀, 配制成储备液.称取化妆品样品0.5g置于锥形瓶 中,准确加入甲醇50mL,超声30rain,高速离心 10rain,经0.45/,m滤膜过滤,滤液作为待测溶液. 2结果与讨论 2.1半定量挑战性试验方法(kokotest)的建立 首先通过光电比浊计数法确立各实验菌株 OD同菌落数的线性关系,见表3;在挑战性试验 进行过程中,通过这一线性关系调节细菌浓度至 10cfu/mL;通过血球计数法来确定酵母菌及霉菌 菌悬液的浓度,调节孢子浓度至10spore/mL;取 上述菌液各1mL制成混合菌液,挑战性试验过程 中,首先(0d)称取25g试验样品加入上述混合菌液 0.1mL,7d后进行平板涂布观察,细菌检测培养基 为营养琼脂(NA),酵母及霉菌检测培养基为沙保 弱右旋糖琼脂(SDA);试验周期为28d;细菌培养条 件是37?下2d,酵母及霉菌培养条件为28?下3d. 表3挑战性试验菌株菌落数同OD关系 革兰氏阴性菌细菌类型线性方程相关系数 大肠杆菌(Escherichiacoli)G'Y=14.825×一1.6940.9852 绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)G=30.968×z0.5010.9993 恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)GY=2.0054X一0.29790.9863 克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)G—v=22.991x_丁一4.70140.9809 荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)G—v=18.401x+0.09350.9988 金黄色葡萄球菌(Snp^zof0ff"saureus)Gv=15.877X一1.06590.9947 藤黄微球菌(Micrococcusluteus)Gv=28.694x,27—3.5970.9875 2.2挑战性试验结果 通过28d的实验,可以对上述4个样品防腐能 力进行同步快速筛选,试验结果显示,其中样品1和 样品3能够符合该挑战性试验标准,即在4个加菌 循环(28d)后,平板涂布结果均未出现菌落生长. 样品2未能通过的原因是细菌生长超标,主要是藤 黄微球菌(Micrococcusluteus),同时,对此试验结 果,我们按照USP方法及CTFA方法进行同步验 证,结果见图2及图3,发现样品1,样品2及样品 3均符合各自挑战性试验标准,三种挑战性试验方 法结果比较见表5.从中可以看出三种挑战性试验 方法的评判结果基本一致,由于本文所介绍的挑战 性试验方法(kokotest)只设有4周循环内均未出现 平板菌落的这一评判标准,故显得更为苛刻,同时, 由于其采取的是平板涂布的观察方式,故认为该方 法是半定量评测方法,CTFA评判标准显得更有实 际意义,因为其对防腐体系优良程度作了区分且列 出了量化指标,这对kokotest的评判标准是一很好 的补充.如:样品2在kokotest中对细菌的防腐能 力受到质疑,这时可对样品中微生物进行计数,对 照CTFA方法评判标准进行评判. —— 26——WWW.ffc—iOUrna1.corn 表4半定量挑战性试验结果 检测时间(加菌后天数) 样品名称 0d7d14d21d28d +++ 样品1 B.Y.M +++++B(藤 样品2 B,Y.M黄微球菌) +++ 样品3 B,Y,M +++++++++ 样品4 B.Y.MB,Y,MB,Y.MB.Y.MB.Y.M 注:B=细菌,Y=酵母菌,M=霉菌 表5三种微生物挑战性试验结果比较 kokotestUSP挑战性试验CTFA挑战性试验 样品名称抗酵母抗酵母抗酵母 抗细菌抗细菌抗细菌 /霉菌/霉菌/霉菌 样品1有效有效有效有效WW 样品2无效有效有效有效WW 样品3有效有效有效有效WW 样品4无效无效无效无效PP 一...堡篁l 詈 嚣三 垂 巷 2l28 天 图228天微生物挑战性试验结果 (A:细菌;B:酵母&霉菌) 21 图3重复加茵微生物挑战性试验结果 (A:细菌;B:酵母&霉菌) 2.3防腐体系中防腐剂含量的变化 在本文的研究中,为了更好地探究挑战性试验 结果,我们对这一防腐体系稳定性同样作了考察, 见图4及图5,我们发现试验过程中(28d),防腐剂 在种类和数量上都未发生变化,MIT,MP,PP的含 量分别维持在0.0(i)95,0.2,0.1,MIT为不含 氯的甲基异噻唑啉酮,有多作用靶点,有极佳的稳 定和对抗细菌效果.尼泊金酯类(MP,PP)对革兰 氏阳性菌,霉菌和酵母菌的抑制作用较强,pH4, 8范围内抗菌效果较好.结合防腐挑战试验结果来 看,我们可以认为该防腐体系是一组较为优异的组 合.防腐体系防腐能力的发挥l6取决于防腐剂同 配方组分的化学相容性,以及防腐剂在油水相的分 配,由于配方组分的复杂性,我们不能简单地认为 防腐剂的组合配比及数量变化就能决定体系的防 腐能力,配方的任何变化,都会对产品抗菌活性产 生影响.因此,通过挑战性试验来评估样品中防腐 体系实际效果,显得尤为重要. 表63种防腐剂校正曲线和检出限 保留时相关检出 化合物线性方程 间/min系数限/r'g 甲基异噻唑啉酮3.54v=0.(10()1_r0.0967().99940.2 4一羟基苯甲酸甲酯7.39v=(2E()5)+0.4452().99760.18 4羟基苯甲酸丙酯19.43Y=(2E_05)0.63640.9996().18 图43种防腐剂标准色谱图 2.4讨论 本文探讨的半定量挑战性试验方法(kokotest) 选取了7株细菌,1株酵母菌,2株霉菌,选取了较为 全面的微生物,基本上考虑到了生产环节,货架期, 消费者使用环节可能存在的微生物风险,在测试的 过程中采用的接菌方式为混合培养,同纯培养方式 相比,混合培养可以更准确地反映经消费者使用产 品后的污染情况,显得更为实用和便捷.由于其在 结果判定的方法上是采取平板涂布这种定性方法, 因此本文采用USP和CTFA方法对该挑战性方法 (kokotest)的科学性进行验证,结果显示,kokotest 的方法结论可靠,由于其在微生物计数过程中采用 www.ffc—lOUrna1.corn——27—— 的是平板涂布法,同倾注平板法相比,省时省力,是一种高效快捷的防腐能力测试 方法. 05 04 03 02 O1 00 O5 O4 03 世 02 01 00 0.5 04 0.3 0.2 01 O0 防腐剂种类防腐剂种类防腐剂种类 图5样品中防腐剂含量前后(28d)的变化 D.S.ORTH_4等人在研究香波中防腐体系稳较大的产品防腐能力评估;USP法是一种较为温和 定性时指出,不同微生物对于配方中的防腐剂并不的挑战性试验方法,一般应用于原始未开封的,以 表现出一致性,通过D值大小反映,这也就是防腐水为基质或载体的,用于耳,鼻,眼部的产品及真 体系测试的过程中必须选取具有不同生理性状微菌的检测;CTFA方法是大多数企业防腐性能测试 生物的必要性,并且防腐体系效力的发挥是一个物中使用的方法,特别是将化妆品分为劣,中,优等 理与化学的共同过程,必须同产品配方一同考虑.保藏时,CTFA的方法具有较强的可操作性. 由于化妆品配方的复杂性,挑战性试验正是检验化….... 妆品中防腐能力最为直观和有效的手段.丐x陬 微生物挑战性试验是一项实践性较强的试[1]林惠芬,李斌,方慧英.用微生物挑战性试验评价化妆品防腐 验引,一般在挑战性试验设计的过程中,会考虑到:效果_J_?日用化学212业,.,':.一? 检测所需时间,方法可靠性,数据处理可靠性,E2]辜拿量'化妆舳生规S.?北京'军事医 被测产品类型,测试微生物种类,微生物接种方[3]陈黎明,田玉平,胡国胜,等.高效液相色谱法定量分析化妆 式.这里需要重点强调的是,由于在挑战性试验过品中对羟基苯甲酸酯[J].上海计 7. 量测试,2009,(6):6— 程中,一些残留微生物对防腐体系具有适应性,以[4]D.SORTH,C.MLUTES,eta1.Determinationofshampoo 致有可能在产品中繁殖而出现反复,即便是菌落总 P"stabilityndapparent""energiesby 数计数小于10cfu/g,但在一定条件下,容易使残留Jli . ne … arr 1 e . g f rm . e f th c o . dofp i. re c s h er . va i t . iv . e , ;y38te:s3t.ing引EJ.]. . 的微生物复发大量繁殖(phoenix现象),尤其是[5]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版)[M],北京: 球菌和微球菌],因此,对有疑问的试验结果需要进高等教育出版社, 行必要的验证及全面地分析试验数据,且相关人员须[6]王艳萍,赵虎山.化妆品微生物学[Mj.北京:中国轻工业出 具备一定专业判断能力,以避免对实验结果的误判.版社,2002:?? 3结论E73誓技术大全?1北帽轻工 通过本文的研究,我们认为,本文介绍的半定[8]孙静,刘正,等.微生物群体的合作行为与社会微生物学 量挑战性试验方法(kokotest)是一种高效快捷的防EJ].国际口腔医学杂志,2009,(4):444—447. 腐能力测试方法,适用于配方组分复杂(如提取物[9]陈邵斌,张朝武,等.使用中消毒剂污染调查及耐药性研究 组分较多),货架期及实际使用过程中微生物风险??中华医院感染学杂志,2001,'':? l国内行业简讯l ?主要加工生产洋茉莉醛,桉叶油等系列产品的四川宜宾天原集团股份有限公司林产化工厂,根据宜 宾市政府三江口区域整体开发规划,已被纳人改造范围,公司决定林产化工厂在2010年12月31日前停产, 12月31日开始拆除. ?陕西省镇坪县林麝养殖场饲养的国家一级珍稀保护动物林麝(香獐),2010年成活数和存栏数创历史 新高,分泌的动物香料麝香年产量超500克. ?天津瀛洋(中国)香精香料集团将在天津滨海开发区推进总投资160亿元的瀛洋香精香料项目建设. (本刊讯) —— 28——WWW.ffc—iOUrna1.com