谷胱甘肽（GSH）含量测定
一、实验目的
1.了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程;
2.学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
二、实验原理
谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸(Gly)组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。
谷胱甘肽能和2-硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
三、实验材料
小麦幼嫩叶片
四、实验方法及步骤
1.制作标准曲线
取7只干净的试管编号，按如下
表格
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加入各试剂，反应20分钟后在412nm下用分光光度计测其吸光度，制作标准曲线；
试管号
1
2
3
4
5
6
7
GSH标准液（10ug/ml）
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1
补水到2ml
2
1.9
1.8
1.6
1.4
1.2
1
磷酸缓冲液（PH=7）
4
4
4
4
4
4
4
DTNB试剂
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
GSH浓度（ug/2ml）
0
1
2
4
6
8
10
2.样品测定
a、称取小麦叶片0.2g，加入少量5%偏磷酸缓冲液研磨提取，并用5%偏磷酸缓冲液定容至6ml，8000rpm离心10min,取上清液；
b、取上述上清液2ml显色，操作同标准曲线。
3.结果计算：GSH含量（ug/Gfw）= (Cx*Vt)/(Fw*Vs)
注：Cx---2ml样品中GSH含量（ug），即每管中GSH的含量
Vt---样品提取液总体积(ml)；
Vs----显色时所取样的体积(ml)；
FW---样品鲜重（g）。
五、实验结果
1.标准曲线
1. 样品测定结果
试管号
1
2
3
吸光度
0.048
0.05
0.046
GSH浓度（ug /2ml）
0.724
0.754
0.694
GSH含量（ug/g）
10.86
11.31
10.41
GSH平均含量（ug/g）
10.86
6、注意事项
1.使用移液管吸取试剂时，视线要垂直于移液管且与液面凹面水平，不能斜视，以免量取试剂不准确。
2.在提取样品时，最好沉淀出去蛋白质，以防止蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。
3.在研磨叶片时，为方便研磨，刚开始时加入少量的提取液。
浙公网安备 33021202002483