野葛根饲喂奶牛的适宜性评价

野葛根饲喂奶牛的适宜性评价 A thesissubmittedto University Zhengzhou for ofMaster the degree of inCow withtheWild TheAssessment SuitabilityFeeding KudzuRoot Qian By Zhang Han Supervisor:Prof(Ping ofNutritionandFood Department Hygiene ofPublicHealth College June2011 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者: 日期:甲11年b月廖日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关 部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文懈咱 吼训年6月『了日 摘要 摘要 葛根属于中国卫生部收录的药食两用食物，含有多种酚类化合物、黄酮类 化合物、淀粉、纤维、蛋白质和矿物质等，具有良好的食用和药用价值。但一 直以来，葛根都处于开发的初级阶段，只单一的利用葛根中一种或几种成分， 其余部分作为废弃物丢弃，造成资源的浪费。 目的 探讨饲喂野葛根对奶牛采食行为、消化功能、产奶量及乳成分的影响，为 把奶牛作为野葛根生态转化器提供依据。 方法 1(选取18头健康同龄泌乳期中国荷斯坦奶牛，随机等分为实验组和对照 组，每组9头并逐一编号;实验组奶牛每头饲喂混合精料和野葛根15009,d，对 照组奶牛每头饲喂混合精料和等能量玉米13859,d，粗饲料自由采食，实验周期 4周;每天记录产奶量，每周取奶样测乳成分;观察粪便色泽、形状、质地，每 周记录粪便量。 2(牛奶的营养成分分析评价:凯式定氮法测定蛋白质的含量:哥特里(罗紫 法测定脂肪的含量，火焰原子吸收分光光度法测定铜、锌、铁、钙和镁的含量。 3(采用单因素实验和响应面分析法优化牛奶中总黄酮的提取工艺，比色法 测定牛奶中总黄酮含量。 结果 1(实验组产奶量24(7+3(8 kg,d，较对照组产奶量提高了2(Okg,d，差异有 统计学意义 氏0(05 。乳成分中蛋白质、乳脂肪含量均高于对照组，差异有统 计学意义 尸 O(05 。 2(实验组牛奶中钙、镁、铁、锌、铜含量均高于对照组，差异有统计学意 义 p o(05 。 3(本实验中牛奶总黄酮提取最佳工艺条件为微波时间2(2min，料液比 1:33(3，乙醇体积分数31(3,。 1(409__(0(515 4(实验组第一周总黄酮含量为30(598?O(975mg,L，第二周为3 4(044-+0(400mg,L，总黄酮含量显著增加。随着时间的增加前三周总黄酮含量逐 摘要 渐增加，差异有统计学意义 氏0(05 ，但是第四周相对于第三周总黄酮含量虽 然增加，但差异并无统计学意义 尸 O(05 。 结论 1(野葛根对奶牛适口性良好，并可提高采食量、产奶量。 2(饲喂野葛根可改善奶牛乳成分，提高牛奶中蛋白质和脂肪的含量，钙、 镁、铁、锌、铜的含量以及总黄酮的含量。 3(响应面分析法优化牛奶中总黄酮的提取工艺，建立了一种快速有效 的提 取牛奶中总黄酮的方法 综上所述，奶牛可以作为野葛根的一种生态转化器。 关键词 野葛根奶牛生态转化适口性牛奶成分 11 Abstract Abstract Pueraria is listedinthe”foodand lobata Willd(’ Ohwiformally drug” itemsby Chinese ofHealth(Pueraria Ohwicontainskindsof Ministry lobata Willd(1 many andnutrientssuchas phenolcomponents isoflavones(starch,dietaryfiber，protein and its valuein nutritional minerals，which impliesgreat developing supplement( to ofPuerariaisstillatthe date，the However,up comprehensiveapplication early afew inPuerariaareextractedandtherestisdiscardedas stage，onlycomponents waste(Iftheside couldbeusedasfeedstuffof become COWS，Pucraria product might valuableresourcesofcow 。 feeding( Objeetives ( To theinfluenceofPueraria oncow behavior， investigate feeding feeding tract and fmdwether be function,milk Kudzucoulda digestive yieldcomposition(To new of StUffresourcesfor and v,pc COW anew forthe feeding dairy provideway utilizationofPueraria( comprehensive Methods HolsteincOWSin haveresemble 1(Eighteen dairy mid-lactation,which healthy milk and divided intotwo yield，lactation parity,Wgl"erandomly period group: controland groupexperimentalgroup( 2(The andevaluationofthenutrientcontentofmilk: TheKieldahl analysis methodwasusedtodeterminethecontentof inthemilk(nleRose(Gottlieb protein methodWasusedtodeterminethefatcontent(Flameatomic absorption wasusedtodeterminethecontentsof spectrophotometry and magnesium( surface wereintroducedinthe 3(Single-factorexperiments，responseanalysis oftheextractionofthemill【(nle methodWasused optimization process colorimetry todeterminecontentsofflavonoidsinthemilk( Results 1(Kudzu addedinthefccd increasedmiIk powder significantly yield(milk increased withthecontrolincreased9(02,(Milk yield 2(0kg,day,comparedgroup by andmi墩fatof were thanthecontrol experiment protein group significantlyhigher group俨 o(05 ( 2(m血1l【contentof inthe were thanthatinthecontrol experimentgroupsignificantlyhigher group妒 O(05 ( extractionofthe were 3(n圮optimum mill conditionsasfollowing: the microwavetreatmenttime Was solidto materialratioWas 2(2min，the liquid 1: 33(3， theethanolconcentrationWas31(3,( 4(，n舱totalflavonoidcontentofthe was experimentgroup30(598士 0(975mg,L III atthefirst 31(4094-0(51 week,followed by the fourth thecontrol weeks，while 32(7334-0(740mg,L，forsecond，third，and group first was time threeweeksof only4(044+0(400mg,L(Wimfeedingincreasing，the totalflavonoidcontentwasincreased WCFO gradually，thechanges significant( third fourthweektotalflavonoidcontentinInj墩was week,the Comparing、 l，i也the thedifferenceWasnot increased，but significant( Conclusion 1(The ofPuerariaas ofCOWSWas palatability feedingstaff good， adding Puerariaintofeedstaffcanincreasethefeedintakeofcowsandmilk production( PuerariatoCOWSCall milk asthelevelsof 2(Feeding quanlity,such fa_t， improve andtotalflavonoids( protein,calcium，magnesium，iron,zinc，copper all surface Waseffectivemethodto 3(Responseanalysis RSA methodology extractflavone frommilk( compounds Fromthe couldbeall transformatorofPueraria above，COW ecotypic Keywords WildKudzuroot COW transformationNutrient DairyEcotypic Palatability IV 目录 目 录 摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„I Abstract(„(„„„„„((„(„„((„(((((„„„„„„„„(„„„„„„„(„(„„III 图表索 引„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((VII 英文缩略词 表„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(VIII 1弓f言„„„„„„„„„„„„(„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((1 2饲喂野葛根对奶牛产奶性能的影响„„„„„„„„„„„„„„„3 2(1材料与方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3 2(1(1实验材料„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。3 2(1(2实验动物选择与分 组„„„„„(((„„„„„„„„„„„„„„„„„3 2(1(3 实验处理„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(((„„3 2(1(4饲养管 理„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。3 2(1(5样品采集与实验测 定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 2(1(6数据分析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 2(2 结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 2(2(1饲喂野葛根对奶牛产奶量的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„。5 2(2(2饲喂野葛根对乳成分的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。5 2(2(3饲喂野葛根对奶牛粪便量的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 2(3讨 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 2(4结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 O 3牛奶营养成分分 析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 3(1材料与方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„10 3(1(1材料„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(((„„(((((((((„„„„„„„(((„„„lO V 目录 3(1(2方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。11 3(2结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(17 3(2(1牛奶中蛋白质含量的测 定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„17 8 3(2(2牛奶中脂肪含量的测 定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 3(2(3牛奶中矿物质元素含量的测 定„„„„„„„„„„„(((„„„„„„((18 3(2(4真空冷冻干 燥„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(19 3(2(5响应面法优化微波辅助提取牛奶中总黄酮的工艺研究„„„„„„„„19 3(2(6牛奶中总黄酮含量的测 定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((27 3(3讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(28 3(4结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(32 3(5本课题的创新之 处„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(32 参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(33 综 述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(35 参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(47 个人简 历„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(51 致 谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。52 VI 图表索引 图表索引 表2(1混合精料配 方„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((4 表2(2饲喂野葛根对奶牛产奶量的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((5 表2(3饲喂野葛根对牛奶中蛋白质含量的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„((5 表2(4饲喂野葛根对牛奶中脂肪含量的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„((6 表2(5饲喂野葛根对牛奶密度的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一6 表2(6饲喂野葛根对奶牛粪便量的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((7 表3(1标准系列„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(13 表3(2 Z-5000仪器工作条件„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((14 表3(3两种实验方法测定的牛奶中蛋白质含量„„„„„„„„„„„„„„„„„(17 表3(4两种实验方法测定的牛奶中脂肪含量„„„„„„„„„„„„„„„„„„((18 表3(5 Cu、Zn、Ca、Mg、Fe的线性回归方程„„„„„„„„„„„„„„„„„((18 表3(6牛奶样品中主要矿物质含 量„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(19 表3(7实验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 因素与水平 表„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((22 表3(8 Box(Behnken设计方案及实验结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。23 表3(9回归模型方差分析结 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(24 表3(10去掉交互项BC、AC后的回归模型方差分析„„„„„„„„„„„„„„„25 表3(11牛奶中总黄酮含 量„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„27 图3(1芦丁标准曲 线„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(20 图3(2料液比对总黄酮提取效果的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((20 图3(3 乙醇体积分数对总黄酮提取效果的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„((21 图3(4微波时间对总黄酮提取效果的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(22 图3(5微波时间和乙醇浓度对牛奶总黄酮量提取影响的响应面曲线图及等高线图„„((26 VII 厂_ 英文缩略词表 英文缩略词表 缩略语 英文全称 中文全称 B加 Bonemineral 骨密度 density CEE3 NilestriolTablets 尼尔雌醇 CMC-NaSodium cellulose 羧甲基纤维素钠 carboxylmethyl COR Cortisol 皮质醇 E2 Estradiol 雌二醇 ER Estrogen 雌激素受体 Receptor FSH hormone 促卵泡激素 Follicle-stimulating HPLC Performance 高效液相色谱 High LiquidChromatography LH hormone 促黄体生成激素 Luteinizing PRL Prolactin 催乳素 Revolutionsminute 每分钟转数 rpm per RSA Surface 响应面分析 ReSpomeAnalysis SPSS Statisticalandservicesolutions 统计产品与服务解决方案 product 1飞琅一a Tumornecrosisfactor俚 肿瘤坏死因子a T? TotalIsoflavonesofPuerariaDC( 葛根总异黄酮 ? 引言 1 引言 Benth( 的干燥根。性味甘、辛，凉;有解肌退热、 Ohwi(】或甘葛藤 P(Thomsonii 生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒之功效。用于外感发热头痛、 项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、眩晕头痛、中风偏瘫、胸痹 心痛、酒毒伤中II]。1998年3月我国卫生部将其正式列入“既是食品又是药品" 的名录之中。 我国葛根资源丰富，大约总面积 野生及栽培 为40万公顷，年产总量在 150万吨以上，其中小部分被用来制作中药材饮片 基本上为野葛 及淀粉加工， 还有相当多的资源没有被开发和利用。目前，对葛根的利用主要有以下途径【2】: 1(水提法制作葛根淀粉:除了淀粉之外的其他所有成分几乎被完全丢弃。 2(水煎法熬药:此过程只是葛根原植物中的部分水溶性物质，淀粉、纤维 素和其他成分等随药渣被丢弃。 3(利用现代中药提取工艺生产葛根素注射液:此过程得到的是葛根素单一 成分的纯品。淀粉、纤维素，还有除葛根素以外的其他有效植物化学成分则一 并作为药渣被废弃。 以传统工艺生产的葛粉，本课题组经HPLC指纹图谱技术分析显示:在生产 过程中排放掉的废弃液中植物化学成分与野葛根原植物构成模式一致，而传统 葛粉中几乎不含有野葛中天然存在的任何植物化学成分团;以现代中药提取工艺 提取葛根素的过程中，在得到葛根素纯品的同时而又将葛根素以外的天然成分 淀粉、纤维素和其它生物有效成分 随药渣一起被废弃掉。 我国虽是野葛根的资源国，但却大多仍处于加工葛根淀粉、葛根饮料、黄 酮浸膏等粗放型生产状态，葛根这一珍贵的资源未能得到充分利用。为此，本 课题组多年来一直致力于寻找利用多级生态转化机制，综合利用野葛根资源的 生态加工模式。本课题组利用全小麦啤酒生产工艺和酿醋工艺转化野葛根的结 果显示:在上述啤酒和醋中呈现的植物化学物模式与野葛根原植物的植物化学 物模式有较高的一致性【3训，但这两种转化模式野葛根中的纤维素均未能得到充 分转化。高婧通过饲喂奶牛葛根粗提物，发现能够提高奶牛血浆雌激素水平和 泌乳量【5】，但用野葛根直接饲喂奶牛的研究鲜见报道。葛根作为新的饲料资源， 奶牛对其是否采食，才时候对奶牛的消化机能、产奶量以及乳成分是否会产生 引言 不良影响，为此本研究拟探讨饲喂野葛根对奶牛采食行为、消化功能、产奶 量 及乳成分的影响，为把奶牛作为野葛根生态转化器提供依据。 奶牛是多胃室反刍动物，是食物链中转化植物资源的生态级联反应器。奶 牛的瘤胃是一个极其复杂的天然发酵系统，若能用野葛根直接饲喂奶牛，既可 节省制备粗提物的费用，又能更有效地提高野葛根的生物学效应。在自然界的 物质循环、能量流动、以及信息传递的过程中，奶牛按照物质不灭、能量守恒、 以及信息传承的生态法则，以其特有的消化机制先将植物中的养分高效地转化 成其自身所需要的营养，然后再以其特有的泌乳机制萃取、富集成营养更加丰 富的牛奶;利用其消化道特有的微生物群的转化功能转化植物资源具有提高原 料利用度、转化效率和终产品品质的优点，且奶牛生物转化器是一种无需煤电、 无污染的高效生态生产模式，如能阐明其对野葛根植物化学物的转化规律，将 对野葛根，乃至其他豆科植物的科学利用具有积极意义。 2 饲喂野葛根对奶牛产奶性能的影响 2饲喂野葛根对奶牛产奶性能的影响 2(1材料与方法 2(1(1 实验材料 本实验所用的野葛根采自河南省信阳市董家河乡的山区，东经114。 05’，北 纬32。12’，海拔为430,-450m，采于秋季，标本植株经河南中医学院标本馆馆 长刘若庸教授鉴定为野葛根[Pueraria I-'IPLC指纹图谱进行分析。野葛根经切片，干燥后运抵现场，饲喂前粉碎过60 目筛。 2(1(2实验动物选择与分组 选择产奶水平、泌乳阶段、胎次相同或相近的健康泌乳中期荷斯坦奶牛18 头，随机等分为实验组和对照组，每组9头并逐一编号。实验于2009年11月 28日"-'12月26日在国家重要技术标准研究示范企业与示范基地――山东曹县 银香伟业集团养殖基地进行。 2(1(3实验处理 实验组每头牛饲喂混合精料和野葛根15009,d，对照组饲喂与实验组等能量 混合精料和玉米13859,d，粗饲料自由采食。 2(1(4饲养管理 牛舍为隔栏开放棚式舍，室外设有运动场供活动。由专人负责牛舍内饲养 管理，精料统一配制，定量配发，粗饲料自由采食，自由饮水，每天喂料三次， 每天利用脉冲式真空吸奶装置自动挤奶三次。专人负责饲喂野葛根，每天将野 葛根分三次混入少量精料中，等奶牛采食完毕后，再继续饲喂精料。定期消 毒 牛舍，预防疾病发生，保持棚舍内外的清洁卫生。每日定时清扫牛舍和去除粪 尿，实验期间由专人注意观察奶牛采食情况、排便状况、精神状态和健康情况。 混和精料配方见表2(1。 3 饲喂野葛根对奶牛产奶性能的影响 表2(1混合精料配方 , 种类 构成比 玉米 O 豆粕 钉H5 棉粕 0 小苏打 5 食盐 0 麸皮 0 花生粕 0 磷酸氢钙 0 预混料 m??6他3? 0 合计 2(1(5样品采集与实验测定 2(1(5(1奶样的采集 实验期每天记录奶牛的产奶量。每周的最后一天，在早、中、晚挤奶时 收 冷藏，以备乳成分的测定。另取250raL冷冻保存，用于实验室分析牛奶成分。 2(1(5(2粪样的采集 每周最后一天收集粪样，称量记录，并按比例 早:中:晚 4:3:3 混匀后， 干燥粉碎后保存。60?鼓风烘箱中烘干，粉碎，过40目筛，装入封口袋内备用。 2(1(5(3乳品质指标的测定 定乳样品中的乳蛋白质率、乳脂肪率和乳密度等指标。 2(1(6数据分析 ProductandService 数据使用SPSS Statistical Solutions 12(0软件进行处理， 以平均数士标准差 i?J 表示，检验水准a--O(05。 2(2结果 4 饲喂野葛根对奶牛产奶性能的影响 2(2(1饲喂野葛根对奶牛产奶量的影响 对实验组和对照组奶牛产奶量进行W检验，各样本尸均大于O(05，因此奶 牛产奶量服从正态分布，对实验组和对照组奶牛产奶量进行配对t检验。结果显 示，实验组和对照组差异在a 0(05水准上有统计学意义 P O(05 ，实验组产奶 量显著高于对照组。实验组相对于对照组产奶量提高了2(O埏，提高了9(02,。 表2(2饲喂野葛根对奶牛产奶量的影响 kg,d ， i?s 2(2(2饲喂野葛根对乳成分的影响 2(2(2(1 饲喂野葛根对牛奶中蛋白质含量的影响 实验组奶牛9头，对照组奶牛9头。对实验组和对照组奶牛牛奶中蛋白质 含量进行W检验，各样本尸均大于O(05，因此牛奶中蛋白质含量服从正态分布， 对实验组和对照组奶牛蛋白质含量进行配对t检验。结果显示，第一周实验组和 对照组蛋白质含量的差异在a 0(05水准上有统计学意义 尸 O(023 ，实验组高 于对照组。第二周、第三周和第四周的实验组和对照组差异在a---0(05水准上均 有统计学意义 P--0(001 ，实验组显著高于对照组。LSD(f法两两比较显 示:实 验组各周之间差异无统计学意义 尸 0(05 ，即饲喂野葛根后，实验组牛奶中蛋 白质率并不随时间增加而增长。 表2(3饲喂野葛根对牛奶中蛋白质含量的影响 , ， i?s 2(2(2(2饲喂野葛根对牛奶中脂肪含量的影响 实验组奶牛9头，对照组奶牛9头。对实验组和对照组奶牛牛奶中脂肪含 量进行W检验，各样本P均大于0(05，因此牛奶中脂肪含量服从正态分布，对 5 饲喂野葛根对奶牛产奶性能的影响 实验组和对照组奶牛乳脂肪含量进行配对t检验。结果显示，第一周、第二 周、 第三周、第四周实验组和对照组乳脂肪率差异均有统计学意义 P O(05 ，实验 组牛奶中脂肪含量高于对照组。LSD(f法两两比较显示:实验组各周之间差异无 统计学意义 尸 O(05 ，即饲喂野葛根后，实验组牛奶中脂肪含量并不随时间增 加而增长。 表2(4饲喂野葛根对牛奶中脂肪含量的影响 , ， i?s 2(2(2(3饲喂野葛根对牛奶密度的影响 实验组奶牛9头，对照组奶牛9头。对实验组和对照组奶牛牛奶密度进行 W检验，各样本尸均大于0(05，因此牛奶密度服从正态分布，对实验组和对照 实验组和对照组乳密度差异在a 0(05水准上无统计学意义。第三周实验组和对 照组乳密度差异有统计学意义 P O(011 ，实验组乳密度高于对照组。第四周 的实验组和对照组差异有统计学意义 氏O(001 ，实验组乳密度高于对照组。 LSD(r法两两比较显示:只有第一周实验组乳密度与第四周实验组乳密度差异有 统计学意义 卢O(035 ，第四周实验组的牛奶密度大于第一周，说明随着饲喂时 间的增长，实验组牛奶密度有提高的趋势，但是差异并不显著。 表2(5饲喂野葛根对牛奶密度的影响 g??cm-3 ， i?J 2(2(3饲喂野葛根对奶牛粪量的影响 实验期内实验组粪便呈褐绿色，中度的粥样黏稠度，可形成一个圆顶型堆 6 饲喂野葛根对奶牛产奶性能的影响 积体，高度在2(5厘米,5(0厘米之间，无明显未消化的纤维和饲料。野葛根作为 饲料，对牛的胃肠道无刺激，在实验期内均未出现明显的消化道不适现象。 对实验组和对照组奶牛粪便量进行W检验，各样本P均大于O(05，因此粪 便量服从正态分布，对实验组和对照组奶牛粪便量进行配对t检验。结果显示， 实验组和对照组奶牛粪便量差异有统计学意义 P 0(026 ，实验组奶牛粪便量 高于对照组。 具体见表2(6 表2(6饲喂野葛根对奶牛粪便量的影响 湿重，kg,d ， i?S 2(3讨论 野葛根的淀粉含量23(46哆扣54(62,，纤维含量3(76哆扣17(58,，蛋白质含量 4(33,-10(38,，根据季节而发生变化【6】。本课题组研究同时发现，产地不同，季 节不同，野葛根中成分变化不同。实验用野葛根采自董家河乡的山区，标本采 lobata 集后经河南中医学院标本馆馆长刘若庸教授鉴定为野葛根[Pueraria 葛根所做的实验研究。 葛根为中国卫生部收录的药食两用食物。实验期间奶牛对野葛根采食良 好， 野葛根采食完全，在饲喂中并没有发现因添加野葛根而造成奶牛采食量减少的 状况，葛根性味甘平，无不良气味，作为饲料适宜奶牛采食。野葛根作为饲料， 对牛的胃肠道无刺激，在实验期内均未出现明显的消化道不适现象，说明野葛 根作为饲料对奶牛适口性良好。实验组奶牛排粪量高于对照组。可能是因为高 产奶牛的消化代谢比较旺盛，粪便量较大。在饲料中添加野葛根能显著提高产 奶量，产奶量提高2(0kg,d，相对于对照组提高了9(02,;显著提高牛奶中蛋白 质含量，相比对照组增加了0(13,;实验组乳脂肪含量相比对照组显著增加。牛 胃由四个胃室组成，即瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃。瘤网胃中的微生物主要是分 解纤维素的菌群，约占瘤胃活菌的1,4，其次是发酵淀粉以及糖类的菌群。瘤胃 内的碳水化合物在多种不同细菌的重叠或相继作用下通过相应酶系统产生挥发 性脂肪酸，主要是乙酸、丙酸、丁酸，直接由瘤网胃壁进入血液而被吸收，作 7 饲喂野葛根对奶牛产奶性能的影响 为能量来源和合成脂肪，生成的二氧化碳和甲烷等以嗳气形式排出体外，所合 成的蛋白质和维生素B族、维生素K、维生素C等供牛体利用。大部分日粮中 的蛋白质被瘤胃微生物分解为胃蛋白、氨基酸和氨，各种类型的微生物利用这 些化合物来合成其本身的细胞蛋白质。有些微生物只能利用胃蛋白或氨基酸， 而另一些微生物只能利用氨，这就是非蛋白质含氮物可作反刍动物蛋白质来源 的原因【71。由于葛根中的主要物质能被牛吸收利用，这也可能是在实验期间奶牛 未出现消化道不适的另一个原因。 葛根中有许多种多酚类化合物，尤其是异黄酮类化合物，主要为大豆苷元 素样活性。巴音吉日嘎拉等人研究发现葛根素具有上调乳腺组织雌激素受体 estrogenreceptor，ER 表达的作用，这是其促乳腺发育的作用机理之一【l们。大 豆甙元、染料木素和芒柄花素具有明显的浓度依赖性的雌激素活性，其中染料 木素活性最高，约为雌二醇的1,1000t11】。薛晓鸥等人研究发现野葛根提取物促 进未成熟大鼠乳腺发育，可以增加血清中雌二醇含量【121。补饲野葛根提取物增 加了奶牛产奶量，且产奶量更加稳定，血浆中雌二醇 Estradiol，E2 、皮质醇 刘浪采用王不留行、黄芪、党参、当归、路路通、通草、川芎、益母草、白术、 甘草等植物原料按一定比例组成植物源性饲料添加剂，能显著提高奶牛的产奶 量【14】。刘福元等采用饲用甜菜根茎替代荷斯坦奶牛常规日粮中的部分玉米青贮 饲料能显著增加奶牛平均产奶量，乳脂肪率和乳蛋白率也有提高【l副;也有研究 报告指出黄芪、王不留行促进奶牛乳腺细胞璐1(酪蛋白、B(酪蛋白和乳铁蛋白 的合成，改进其泌乳性能【161。综合所述，在饲料中添加野葛根有助于提高产奶 量，改善奶牛的产奶性能，为奶农带来一定的经济效益。 8 饲喂野葛根对奶牛产奶性能的影响 2(4结论 牛粪量显著增加，并未出现明显的消化道不适现象。野葛根作为饲料对奶 牛适口性良好，日粮中添加野葛根显著增加了奶牛的产奶量;牛奶中的蛋白质 含量、脂肪含量显著增加，促进了奶牛的产奶性能。 9 牛奶营养成分分析 3牛奶营养成分分析 3(1材料与方法 3(1(1材料 3(1(1(1 主要设备 仪器 型号 厂家 电子分析天平 ALl04 梅特勒(托利多仪器上 海有限公司 紫外可见分光光度计 UV-1601日本日立公司 台式高速离心机LDZ4(0(8北京医用离心机厂 恒温水浴 CU420 上海一恒科学仪器有限公司 自动定氮分析仪 2300型 瑞典福斯特卡托公司 忿振塞曼原子吸收光谱Z-5000 []本Hitachi公司 仪 偏振效应背景校正器 Zeeman 日本HITACHI公司 循环水式多用真空泵 SHB(III 郑州长城科工贸有限公司 旋转蒸发仪 RE(2000 上海亚荣生化仪器厂 电热板 K420 上海一恒科学仪器有限公司 恒温水浴 CU420 上海一恒科学仪器有限公司 电热鼓风干燥箱 101(2BS 天津市华北实验仪器有限公司 脂肪测定仪 SZF(06A 上海精隆科学仪器有限公司 微波炉 P70D207L(D4格兰仕微波炉电器有限公司 3(1(1(2试剂 原料名称 类型,级别 生产厂家 芦丁标准品 批号:100080(200707国家标准物质研究中心 霪杂锇镁、钙标100。吼 国家 标准物质研黼心 10 f( 牛奶营养成分分析 浓硝酸 优级纯 洛阳市化学试剂厂 高氯酸 优级纯 天津市东方化工厂 浓硫酸 分析纯 洛阳市化学试剂厂 硫酸铵 分析纯 洛阳市化学试剂厂 硫酸钾 分析纯 洛阳市化学试剂厂 硫酸铜 分析纯 洛阳市化学试剂厂 氢氧化钠 分析纯 洛阳市化学试剂厂 无水乙醇 分析纯 烟台市双双化工有限公司 盐酸 分析纯 洛阳市化学试剂厂 无水乙醚 分析纯 天津市天大化工实验厂 石油醚 分析纯 郑州派尼化学试剂厂 甲基红 分析纯 上海试剂三厂 溴甲酚绿 分析纯 上海公私合 营新中化学厂 甲基红 分析纯 上海试剂三厂 海砂 化学纯 国药集团化学试剂有限公司 重铬酸钾 分析纯 宜兴市辉煌化学试剂厂 其他常规试剂 分析纯 洛阳市化学试剂厂 3(1(1(3待测样品:2(1(5中采集的奶样 3(1(2方法 3(1(2(1奶样品中蛋白质含量的测定 5009(5规定的凯氏定氮方法测定。实验原理:有机物中的蛋白质 参照GB,T 在强热、硫酸和催化剂的作用下一同加热消化，使蛋白质分解，分解出的氨与 硫酸结合生成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，再用硼酸吸收后，最后以盐酸 标准溶液进行滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 1 消化 精确称取5(009牛奶样品，送入消化管中，加入79硫酸钾、O(8g硫酸铜和 牛奶营养成分分析 12mL浓硫酸，装上排气设备，打开水管，开足水吸气器的流量。将消化管放入 预热好的消化炉中420"C进行消化。当消化管中液体变为透明的蓝绿色澄清液 体，表示消化完毕。关闭电源，戴上手套用夹子将消化管取出，放在铁架子上 冷却。牛奶含有大量的蛋白质和脂肪，消化过程中容易产生气泡，难以消化完 全，因此在消化前分别滴加两滴异丙醇进行消泡。 2 定氮仪参数设定 40mL。 3 回收率检验 称取0(159硫酸铵放入消化管，不加硫酸钾、硫酸铜和浓硫酸直接进行消化， 上机进行蒸馏和滴定。结果为101(2,，在要求范围内。 4 蒸馏与滴定 在自动凯式定氮分析仪中完成。程序设定完成后，将消化管放入蒸馏器内， 关好安全门后，检测完成后直接显示结果。平行三份测定，求平均值。 5 空白对照 精确称取去离子水5(009，按上述程序做试剂空白对照实验。 3(1(2(2牛奶中脂肪含量的测定 参照GB,T5009(46(2003规定的哥特里(罗紫法测定。实验原理:从乳中用 乙醚提脂肪，称其质量。实验步骤:准确吸取10(009牛奶于100mL的具塞量筒 中，加入1(25mL氨水，充分混匀，置于60?水浴中进行加热5min，振摇2min， 再加10mL乙醇，充分摇匀，于冷水中冷却后，加入25mL无水乙醚，振摇O(5min， 层体积。放出乙醚层，至已恒量的烧瓶中，记录下体积，蒸馏回收乙醚，然后 后两次质量相差不超过lmg。 样品中脂肪的含量按下面公式3(1进行计算: x:竺二鱼×100 3(1 m2×旦 , X(――样品中脂肪的含量，g,1009; 12 牛奶营养成分分析 1111――烧瓶加脂肪质量，g; m旷瑚瓶质量，g; m尹卅品质量，g; V一卖取乙醚层总体积，mL; Vl――放出乙醚层体积，mL。 3(1(2(3牛奶中矿物质元素含量的测定 实验原理:样品在酸性条件下，湿法消化，再定容导入原子吸收分光光度 计中，经过火焰原子化后，在不同吸收共振线下，吸收量与含量成正比，再与 标准系列进行比较即可定量。 1 供试样品制备 精确称取冷冻牛奶样品5(009，置于50mL三角瓶中，加入玻璃珠4个， 加 入混合酸消化液 硝酸:高氯酸 4:1 ，上部放一个漏斗，放置过夜后进行消化。 放置在电热板上加热消化，温度设置为250?。红棕色气体消失后，持续加热 至白烟散尽，溶液接近无色透明为止。取下稍稍冷却后，加入约5mL去离子水， 继续加热以除去多余的硝酸。等到三角瓶中的液体接近2~3mL时，取下冷却。 用去离子水冲洗三角瓶和上端的漏斗后，转移到25mL容量瓶后，定容，混匀待 测。 精确称取去离子水5(009，按上述操作步骤做试剂空白测定。 2 标准溶液测定 分别取不同量铜、锌、钙、铁、镁的标准应用液，用0(5mol,L硝酸溶液稀 释后得标准系列 见表3(1 。 表3(1标准系列 rag,L 3 样品测定 测量铜、锌、铁、钙、镁含量时火焰原子吸收分光光度计的工作条件见表 3(2。测定不同元素时，溶液可根据情况用O(5,硝酸溶液进行不同倍数的稀释。 13 牛奶营养成分分析 表3(2 Z-5000仪器工作条件 4 计算 矿物质元素含量根据以下公式3(2计算: X-坠二鱼2兰!兰』兰!塑 3(2 朋×1000 X(一样品中矿物质的含量，pg,g。 ; C一测定样品中矿物质的浓度 由标准曲线查出 v-一样品定容体积，mL m一样品重量，g; 卜稀释倍数; C0(溶液空白液中矿物质的浓度 由标准曲线查出 ，pg,mL 3(1(2(4牛奶样品真空冷冻干燥处理 真空冷冻干燥原理:在水的三相点以下，即低温 0? ，低压 610Pa 的条件下使被干燥物中冻结的水分以冰态直接升华而脱去。 将牛奶倒入圆底烧瓶中，在液氮中旋转冷冻，直至样品均匀地涂布在冻干 瓶表面，样品厚度不超过lena，在一80?低温冰箱冷冻过夜。先打开真空泵，预 热约20,30分钟;关闭泵。打开主机电源开关，观察控制器上的冷凝室温度显 示，当冷凝室内的温度降至一40?以下时，检查所有的外挂瓶阀，确认其处于 关闭状态 大头向上 。检查仪器右侧的放水阀，确认其处于关闭状态。打开真 空泵，系统开始抽真空。观察控制器上的真空值显示，当真空值降至O(1mbar 以下时，将预冻好样品的冻干瓶项在阀口，将橡胶阀非常缓慢地旋至开启状态 大头向下 ，确定瓶被吸牢后，外挂瓶挂好。真空值降至0(1mbar以下时，主 干燥开始，打开气体平衡阀，将从样品中抽出的水分放走。24小时后，干燥结 束。 14 牛奶营养成分分析 3(1(2(5牛奶中总黄酮量的测定 参照《营养与食品卫生学实习指导》【17】中食品中总黄酮的测定方法。实验 原理:黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般 都 具有4位羰基，且呈现黄色。黄酮类化合物的3(羟基、4(羟基或5(羟基、4(羰基 或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物。本 1 方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于5Ohm波长下测 定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。 1 标准曲线的绘制 乙醇定容至刻度。摇匀，放置15rain，于510hm波长处测定吸光度，以零管为 空白，以芦丁含量 ttg 为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制相关系数，计算相 关系数r。 2 奶样品前处理 液，放入微波炉微波辅助提取，粗提液冷却后，减压抽滤，并用少量25,乙醇 溶液洗涤滤渣，合并滤液。在50?下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至溶液无 醇味，倒出容器内溶液，用25mL热水分3次洗涤，倒入离心管内，5000rpm离 心15分钟，收集上清液，倒入分液漏斗中，以75mL氯仿分3次萃取脱脂，等 到完全分层后，收集下层水溶液并定容至25mL。 3 总黄酮的测定――比色法 准确吸取样品溶液5mL于lOmL，刻度比色管中，各加5,亚硝酸钠溶液 510hm波长处测定吸光度。 4 计算 牛奶中总黄酮含量根据以下公式3(3计算: X-』坚?× 100 、 3(3 7 m×v'×10。 】5 牛奶营养成分分析 X(一样品中黄酮含量，g,lOOg或g,lOOmL; ml――根据标准曲线计算出待测液中黄酮的量，嵋; m??―样品质量或样品体积，g或者111L; Vl――样品提取液测定用体积，mL; Vr样品提取液总体积，mL。 3(1(2(6响应面法优化微波辅助提取牛奶中总黄酮的工艺研究 微波法具有溶剂用量少、耗时短、选择性强，有利于对原料中热不稳定活 性物质的提取等优点，且微波法效率高，能耗低、操作容易、低污染、安全高 效【18】。本实验使用乙醇为提取溶剂，借助微波辅助提取，采用响应面法优化牛 奶中总黄酮的提取工艺。 3(1(2(6(1牛奶中总黄酮的提取工艺中单因素研究 1 微波预处理与实验 取一批规格相同的三角瓶，每瓶加乙醇40mL，在微波炉中均匀排成一 圈， 保证每瓶接受的微波剂量相等。每组分别在低火档 119W 、解冻档 259W 、 中低火档 280W 分别处理，观察样品沸腾情况记录下沸腾时间，分别是280s、 120s、85s。实验中微波辐射时间均应短于相应微波强度的沸腾时间，否则，容 易造成提取液溅出损失，造成实验结果不准确。最终确定微波功率选择在低火 档，功率为119W。 2 料液比对提取效果的影响 定、计算总黄酮量。 3 乙醇浓度对提取效果的影响 精密称取6份2(009冻干奶粉于250raL三角瓶中，分别加入20,、 30,、 40,、50,、60,、70,乙醇60mL，l19W微波3min，减压抽滤，减压蒸馏去除 乙醇，5000rpm离心15分钟除蛋白，加入氯仿萃取以除去脂肪，定容至25mL， 测定、计算总黄酮量。 4 微波时间对提取效果的影响 16 牛奶营养成分分析 醇，5000rpm离心15分钟除蛋白，加入氯仿萃取以除去脂肪，定容至25mL， 测定、计算总黄酮量。 3(1(2(6(2牛奶中总黄酮的提取工艺中主要因素的综合研究 参考有关文献，结合料液比、乙醇浓度、微波时间三个因素分别作单因 素 实验的基础上，通过响应面法对微波辅助提取牛奶中总黄酮工艺进行优化以获 得最佳工艺条件。 3(1(2(7统计学方法 数据处理采用SPSSl2(0软件进行方差分析，以平均数?标准差 舅?s 表 示，检验水准a--O(05。 3(2结果 3(2(1 牛奶中蛋白质含量的测定 对实验组和对照组奶牛牛奶中蛋白质含量进行W检验，各样本尸均大于 O(05，因此牛奶中蛋白质含量服从正态分布，对两种实验方法测定的牛奶中蛋白 质含量进行配对t检验。结果显示，同使用乳成分测试仪测试的结果对比，凯氏 定氮仪测定蛋白质含量差异无统计学意义 胗0(05 。具体结果见表3(3。 表3(3两种实验方法测定的牛奶中蛋白质含量 舅?s ， n--9 17 牛奶营养成分分析 3(2(2牛奶中脂肪含量的测定 对实验组和对照组奶牛牛奶中脂肪含量进行W检验，各样本P均大于O(05， 因此牛奶中脂肪含量服从正态分布，对两种实验方法测定的牛奶中脂肪含量进 行配对t检验。结果显示，同使用乳成分测试仪测试的结果对比，使用哥特里- 罗紫法测定脂肪含量差异无统计学意义 尸 0(05 。具体结果见表3(4: 表3(4两种实验方法测定的牛奶中脂肪含量 i?s ， n两 3(2(3牛奶中矿物质元素含量的测定 3(2(3(1标准曲线的绘制 将配制各种微量元素的标准系列溶液分别进样，然后以吸光度为纵坐标， 浓度为横坐标，作出各元素的标准曲线，以确定该方法的线性范围。结果显示 各元素回归系数均大于0(995，说明各元素在其线性范围内线性较好，具体结果 见表3(5。 表3(5 Cu、Zn、Ca、Mg、Fe的线性回归方程 18 牛奶营养成分分析 3(2(3(2牛奶中矿物质含量测定 对实验组和对照组牛奶中矿物质含量进行W检验，各样本P均大于O(05， 因此牛奶中矿物质含量服从正态分布，对实验组和对照组牛奶中矿物质含量进 行配对t检验。结果显示，实验组牛奶中的钙、铁、锌、镁和铜均大于对照组， 差异有统计学意义 尸 O(05 ，具体见表3(6。 表3(6牛奶样品中主要矿物质含量 孑?s ， n---9 3(2(4真空冷冻干燥 精确吸取50(OmL牛奶进行真空冷冻干燥，干燥前牛奶重51(493? 0(5319， 多孔。 3(2(5响应面法优化微波辅助提取牛奶中总黄酮的工艺研究 根据标准曲线中芦丁含量及测得的吸光度，得到回归方程 量与吸光度呈现良好的线性关系。将样品的吸光度代入上述回归方程，计算出 样品中的总黄酮含量。芦丁标准曲线见下图3(1。 19 牛奶营养成分分析 700 600 够 、(， 托 ?-―_ 霞 100 0 0(0 0(1 O(2 0(3 0(4 0(5 0(6 吸光度A 图3(I芦丁标准曲线 3(2(5(1料液比对提取效果的影响 在固定微波时间，乙醇浓度的条件下，随液体量的增大提取率也增大， 具 体结果见图3(2。 3l 30 ―29 一 曹28 、_, 器27 工。 心 涵26 25 24 l:10 1:20 l:30 l:40 l:50 料液LL giml(, 图3(2料液比对总黄酮提取效果的影响 3(2(5(2乙醇体积分数对提取效果的影响 20 牛奶营养成分分析 随乙醇体积分数的增大提取率先是增加而后则缓慢降低，具体结果见图3(3。 3 5 乏32 3L5 ，-、 一 窖 3l 3 5 帮 鬻巴 袈 c;30 嗣 2 5 9 2殳2&5 20 30 40 50 60 70 乙醇体积分数 , 图3(3乙醇体积分数对总黄酮提取效果的影响 3(2(5(3微波时间对提取效果的影响 随微波时间的增加提取率先是增加较多，达到最大值后随着微波时间的增 加总黄酮量反而有所下降，具体结果见图3(4。 21 牛奶营养成分分析 31(5 3l ，、 一 30(5 奄 。 30 滠 二:-r 味 29(5 :毒 29 28(5 2 3 4 微波时|’IlJ四 图3(4微波时间对总黄酮提取效果的影响 3(2(5(4牛奶中总黄酮的提取工艺中主要影响因子的综合研究 结合牛奶中总黄酮的提取工艺中单因素实验所得的最优实验条件，对牛 奶 中总黄酮的提取工艺进行优化研究。将料液比、乙醇浓度、微波时间进行三因 素三水平实验。以总黄酮量为主要参考指标。 3(2(5(4(1响应面优化设计实验 在单因素实验的基础上，根据Box(Behnken中心组合设计原理，本实验以 总黄酮量Y为响应值，利用DesignExpert7(1(1软件设计了三因素三水平的响应 面法实验，共有15个实验，其中12个为析因点，3个为零点以估计误差。因素 水平见表和实验设计见表3(7和3(8。 表3(7实验设计因素与水平表 22 牛奶营养成分分析 表3(8Box-Behnken设计方案及实验结果 因素 实验编号Xl X2 X3 总黄酮量 微波时间A,rain乙醇浓度B,, 料液比C,g??mLl’Y, mg??L-l 1 3 30 l:40 29(225 2 2 40 l:20 28(593 3 1 20 1:30 26(471 4 3 40 1:30 28(343 5 3 20 l:30 28(292 6 2 40 1:40 28(933 7 1 30 1:40 28(732 8 2 30 l:30 29(876 9 1 40 1:30 27(745 10 2 30 l:30 30(163 1l l 30 1:20 27(965 12 2 20 1:40 28(073 13 2 20 1:20 27(320 14 3 30 1:20 28(822 15 2 30 1:30 30(033 3(2(5(4(2方差分析 利用软件对实验结果进行二次多元回归拟合，对表3(8的数据进行方 差分析 后得到模型的二次多项回归方程为: 1(40B‘一0(43Cz 方差分析结果，见表3(9。 23 牛奶营养成分分析 表3(9回归模型方差分析结果 表3(9显示，失拟项不显著 胗O(05 ，而模型的尸值为0(0006，小 于0(05， 表明模型显著;因素一次项 A、B、C 、二次项 A、B、C 和交互项AB对 3(2(5(4(3回归模型的优化 交互项 AC、BC 对结果影响不显著 胗O(05 ，采用手动优化的方法对 回归模型进行优化，优化的结果见表3(10。 经手动优化后得到回归方程为: 24 牛奶营养成分分析 表3(10去掉交互项BC、AC后的同归模犁方著分析 显著;而交互项显著性也较高，说明因素之间有一定的交互作用。同时软件分 接近。信噪比为22(783，远远大于4;CV值为0(75,，很低，显示实验稳定性好， 操作可信。这表明该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是合适的，可以 用此模型对提取牛奶中总黄酮工艺进行分析和预测;在所选取的因素水平范围 内，各因素对结果的影响排序为微波时间A 乙醇浓度B 料液tLc。 3(2(5(4(4响应曲面图分析 响应曲面分析 RSA 方法的图形是特定的响应面Y对应的因素XI、X2( X3构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以很直观地反映各因素对响 应值的影响，从实验所得的响应面分析图上可以找到它们在反应过程中的相互 作用。 随着微波时间的延长，总黄酮量先升高后缓慢下降，而随着乙醇浓度比例 的升高总黄酮量先快速升高后快速下降。同时可以看出该图等高线接近椭圆， 表明微波时间和乙醇浓度两因素交互作用显著;等高线也可明显看出微波时间 比乙醇浓度对提取总黄酮量影响相对较为显著，所以选择适当的微波时问对提 取效果更为重要。 25 牛奶营养成分分析 趟 蠖 溢 门 ?? ? A:微波时间 图3(5微波时间和乙醇浓度对牛奶总黄酮鼙提取影响的响应面曲线图 及等高线图 3(2(5(4(5最佳工艺条件的预测和验证 26 牛奶营养成分分析 通过Design Expert7(1(1软件对经过手动优化后的回归方程进行求解，在实验 的因素水平范围内预测最佳发酵工艺的最佳条件为:微波时间为2(23rain，乙醇 浓度为31(29,，料液比为1:33(32，在此条件下总黄酮量最高可达30(186。 由于实验操作的可行性，将提取总黄酮的最佳工艺条件修正为:微波时间 验证性实验，测得的牛奶中总黄酮量的均值为30(180，与理论预测值30(186较 为接近，说明模型的拟合程度较好，说明经手动优化后的回归方程对牛奶中总 黄酮的提取工艺进行分析和预测非常可靠。 3(2(6牛奶中总黄酮含量的测定 方差分析结果显示:实验组和对照组总黄酮含量差异有统计学意义 第三周和第四周的奶样品相比，牛奶中总黄酮量差异在a 0(05水准上无统计学 意义 P 0(530 ，第一周、第二周、第三周和第四周牛奶样品中的总黄酮含量 与对照组牛奶样品相比，差异在a 0(05水准上均有统计学意义 尸 0(001 ;第 一周牛奶样品与第二周牛奶样品相比，差异在a---0(05水准上有统计学意义，但 水准上有显著的统计学意义 P -0(002 。 样品中总黄酮含量见下表3(11: 表3(11牛奶中总黄酮含量 i士s 27 牛奶营养成分分析 3(3讨论 牛奶中蛋白质含量是反映牛奶营养价值的一个重要指标。牛奶中所含氮的 95,是真蛋白质，是由脂蛋白、酪蛋白和乳清蛋白组成，剩余的有5,是非蛋白 的含氮化合物，其中包含有氨基酸、氨、尿素、尿酸、肌酸和肌酐等成分，大 约有15,30mgtl91。凯式定氮的原理是将含氮有机物转变为无机氮硫酸铵来进行 检测，以得到的含氮量的测定值乘以系数 牛奶系数6(25 ，得出蛋白质含量。 所以牛奶中非蛋白氮也被认为是蛋白氮，计入最终结果，所以造成结果偏高。 而且凯式定氮法测定蛋白质时间较长 约5h ，操作复杂，需要加浓酸高温消 化，有一定的危险性。哥特里(罗紫法测定的牛奶中脂肪的含量与乳成分分析仪 测定结果一致。乳成分分析仪是基于傅立叶变换红外技术，是目前世界上用于 快速检测牛奶和乳制品的化学组分的分析仪器。乳成分分析仪快速 0(5rnin ， 简便，准确率高，奶牛场可配备作为乳成分分析仪常规乳成分检测使用。 按照矿物质在人体内总含量占体重的百分比，把矿物质分为常量元素和微 量元素。常量元素主要有钙、磷、钠、钾、镁和硫等，微量元素种类比较多。 1995年FAO,WHO将微量元素中的铁、铜、锌、钻、氟、铬、碘、硒、锰、和 钼10种元素列为维持正常人体生命活动不可缺少的必需微量元素。牛奶中矿物 质皆为溶解状态，含量十分丰富，范围广 钾、钙、磷、镁、锌、铁、铜、碘、 锰和钴 、含量高，比例适合人体需要，特别是钙磷比例合适，牛奶中含有维生 素D，容易消化吸收。段理清研究发现野葛根中铜含量在9(74~21(669‖g之间， 103~29(52X 103pg儋之间变化，镁含量范围在3(68×103--4(04X103pg儋。春夏秋 冬不同季节之间变化并没有一定的规律;各种矿物质元素含量均较高，是矿物 质的良好来源[61。一是本身含有丰富的微量元素，二是野葛根中黄酮类化合物可 以调节微量元素的吸收和代谢。郑高利【20】等为了研究葛根总异黄酮 Total IsoflavonesofPuerariaDC((TIP 对去卵巢引起的骨质疏松症大鼠骨骼骨矿物质 密度和微量元素含量的影响。把52只雌性SD大鼠分为假手术组、模型组、尼 尔雌醇 Nilestriol 外均切除双侧卵巢，7天后分别灌胃给予O(5,羧甲基纤维素钠 sodium carboxyl cellulose，CMC-Na 假手术组和模型组 、CEEa1(0mg??kg以??wk"1、TIPl00 methyl 和20mg??kgd??wkl，连续7个月。化学法测定胫骨钙和磷含量，原子吸收分光 光度法测定铁、锌、镁、锰、铜、钻、铬和铝等微量元素的含量。结果显示大 牛奶营养成分分析 鼠在去卵巢后胫骨的表观密度及灰密度分别下降了5(8,和11(4,，钙、磷、铁、 锌和镁等元素的含量也显著减少。经TIPl00和20 mg??kg以??d。1治疗7个月后， 胫骨表观密度增加7(5,和7(1,，灰密度增加9(6,和4(6,;钙密度增加9(8,和 6(1,，磷密度增加10(1,和6(2,，对钙磷比值无明显影响。铁、锌和镁含量恢 复到接近正常水平，锰和铝含量略高于正常组，而铜比正常组高39,和75,， 铬比正常组高31(3,和26(5,，钻含量则无明显变化。说明TIP对雌激素缺乏引 起的骨矿物质密度和微量元素丢失具有明显的防治作用。饲喂野葛根后，牛奶 中矿物质显著提高，尤其是奶中本来比较缺乏的铁，含量增加了24,。牛奶本 来就是人类所需钙的良好来源，饲喂野葛根后，钙含量也有一定程度的增加， 对预防骨质疏松有一定的积极作用。 钙是人体内含量最多的无机元素，主要存在于骨骼和牙齿中，钙对许多参 与细胞代谢的酶具有重要的调节作用，参与血液凝固，维持神经肌肉的正常生 理功能。此外，一些研究表明，补钙可以使血压降低，降低结肠癌的发病率有 关【20】。镁也是一种人体必需的宏量元素，在能量和物质代谢中起着重要的作用。 研究发现，镁与第二信使cAMP的生成，与激素及生长因子、心肌细胞阳离子 通道等多种生理功能有关。当人体摄入镁减少时，易患高血压和心律不齐，还 可能导致冠状动脉痉挛和心肌梗塞【2ll。还有研究表明长寿地区人们镁的摄入量 明显高于一般地区阎。铁是人体必需的微量元素，是血红蛋白、肌红蛋白、 细 胞色素以及某些呼吸酶族的组成成分，参与体内氧的运送和组织呼吸过程，维 持正常的造血功能和正常免疫功能等。锌是人体内多种酶的功能成分或激活剂， 与糖的代谢活动有密切关系，能够促进婴幼儿的生长和智力发育，提高机体免 疫功能，以及对物质代谢和生殖功能方面均具有重要的作用。铜也是人体必需 的微量元素，具有维持正常造血功能，维护中枢神经系统完整性和增强机体免 疫力等生理功能。 真空冷冻干燥优点:低温下进行干燥，特别适用于热敏性的物质;被干燥 物质中的一些受热易挥温发性成分损失很小，很适合一些特殊的化学产品、食 品和药品的干燥;微生物的生长和酶的作用在冷冻低温环境下而无法继续进行， 原来的性状得到了保持;由于在冻结的状态下进行干燥，体积几乎不会被改变， 保持了被干燥物原有的结构，不会发生浓缩现象;干燥后的物质呈海绵状，疏 松多孔，加水后溶解迅速而完全，几乎立即就恢复到原来的性状;真空状态下 进行干燥，氧气极少，有效地保护了易被氧化的物质;干燥能排除95,99,水份， 29 牛奶营养成分分析 使干燥后的产品能长期保存而不发生变质【23】。将真空冷冻干燥作为样品的前处 理，有助于下一步实验室分析检测，既最大成分的保留了样品中的有效成分， 去除了大量的水分，使某些微量的待测成分得到了浓缩，又可作为一种十分有 效的样品处理保存方式。 在固定微波时间，乙醇浓度的条件下，随液体量的增大提取率也增大。在 料液比小于1:30时随着溶剂量的增加，总黄酮量率随着液固比增大而快速增加， 比增大而变化不大这是因为液体量太低时溶剂不能完全溶胀原料以及完全溶解 出黄酮，溶剂量越大，有效成分浸出越完全，但太高时又增加生产成本、溶剂 用量和能耗都会大量增加，以及增加后续处理的难度。在保证提取效果的同时， 应尽量减少水的用量和降低浓缩负荷。初步确定最佳料液比在1:20,1:40之间。 随乙醇体积分数的增大提取率先是增加而后则缓慢降低，这是因为黄酮类 化合物为多羟基酚类其极性比乙醇强而比水弱，较易溶于中等体积分数的乙醇 溶液。另外，用纯水时得到的提取液泡沫多，难过滤，其原因是提取液含有较 多的多糖和氨基酸。而乙醇浓度越大时，皂苷、色素及其他脂溶性物质溶出也 较多，而且溶剂的挥发性也越大，生产成本也越高，水溶性黄酮溶出量减少，因 此黄酮产率下降。因此，初步确定20,--40,的乙醇为合适的溶剂。 随微波时间的增加提取率先是增加较多，达到最大值后随着微波时间的增 加总黄酮量反而有所下降。这是因为微波的作用机制是微波直接作用于分子， 使分子的热运动加剧，从而引起温度升高，可以快速破坏细胞壁，使细胞内的 有效成分更快的分离浸提出来。当微波时间达到2min以上时细胞破裂完全，细 胞内的有效成分大部分可浸提出来。但实验时发现，微波时间为3min时，黄酮 提取率反而降低，这可能是长时间辐射后牛奶中的黄酮类有效成分结构被破坏 的结果，辐射时间越长，有效成分损失越多，因而引起总黄酮量下降。在实际 操作中，应同时考虑微波时间的影响，既要保证尽量把黄酮提取出来，又要避 免温度过高而使黄酮发生转化，实验证明微波时间控制在2分钟左右为最佳。 饲料中添加野葛根饲喂奶牛后，其产出的牛奶中总黄酮含量显著高于饲料 中未添加野葛根的奶牛产出的牛奶。随着饲料添加的时间越久，奶牛中总黄酮 含量逐渐增多，到第四周，总黄酮量虽然相比第三周仍有增多，但差异很小， 无统计学意义。说明第四周牛奶中总黄酮含量已经十分稳定，随着时间的推移， 总黄酮含量可能不会再明显的增长。 牛奶营养成分分析 总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是 许 多中草药的有效成分。根据中央三碳的氧化程度、是否成环、B环的联接位点等 特点，可将该类化合物分为多种结构类型:黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、 二氢黄酮醇类、异黄酮类、二氢异黄酮类、查尔酮类、橙酮类、黄烷类、花色 素类、双黄酮类。葛根奶是黄酮类化合物的良好来源。近几年的研究表明，黄 酮类化合物作为食物中的一种非营养成分，具有等多种生理活性【241。国外有文 献报道，黄酮类化合物对心血管系统和免疫功能都有很大的影响【251，具有清除 自由基以及抑制动脉粥样硬化的发生、治疗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗 衰老等作用【冽;改善围绝经期症状暖刀，促进钙磷代谢，改善骨矿物质密度 BMD 【28捌，增强机体免疫力等作用【30，3?。本研究表明，通过野葛根饲喂奶牛产出的牛 奶，总黄酮含量明显高于普通牛奶中黄酮的含量，提高了牛奶中其他活性成分 的含量，增加了牛奶的营养价值。 实验表明胰腺和小肠的糖苷酶催化糖苷产生相关苷元，苷元在肠内内容物 中细菌的作用下进一步转化为其它分子，如部分染料木素转化成己基苯酚，大 部分大豆苷元转化为雌马酚 eq01 ;染料木素、大豆黄素和雌马酚与雌激素受 体有较强的结合力，己基苯酚无雌激素活性【321。袁建平【33】报道动物摄取大豆异 黄酮后，在乳房组织中检测到少量的染料木黄酮和微量的大豆黄酮素，而雌马 酚是乳房组织中主要的雌激素，其含量明显高于血清中雌马酚的浓度。在反刍 动物体内，异黄酮类化合物主要在瘤胃微生物或体外发酵水解脱掉葡萄糖基分 别形成异黄酮苷元，肝脏的代谢量很少，然后通过小肠和大肠吸收，再经过肝 脏酶形成硫酸盐或葡萄糖醛酸结合物经胆汁及尿液排出体外【34】。瘤胃微生物把 异黄酮类中的大豆黄酮大部分进一步代谢为雌马酚和去甲基安哥拉紫檀素 尿、粪或奶排出体外【351。葛根中异黄酮类植物化合物经牛吸收和代谢后，牛奶 中黄酮类化合物等活性成分的结构、含量等具体情况，奶牛作为生态转化器 对 野葛根植物化学物的转化规律还有待于进一步研究。 31 牛奶营养成分分析 3(4结论 饲喂野葛根增加了牛奶中蛋白质和脂肪宏量营养素的含量，钙、镁、铁、 锌、铜微量营养素的含量和总黄酮的含量;将响应面分析法应用于牛奶中总黄 酮提取工艺的研究，采用合理的试验设计，对提取工艺进行全面分析和评测， 并依据回归分析得到提取的最佳工艺条件，缩短了提取时间，建立了一种高效 的提取方法。 3(5本课题的创新之处 1(首次直接使用野葛根饲喂奶牛，并从整体水平上评价了野葛根饲喂奶牛的适 宜性。 2(首次利用响应面分析法考量了牛奶中总黄酮的提取参数。 32 参考文献 参考文献 【l】国家药典委员会(中华人民共和国药典[M](北京:中国医药科技出版社，2010 【2】韩萍(大别山野葛HPLC指纹图谱库的构建及其植物化学物对乙醇神经毒性保护作用 的研究[D](成都:四川大学，2005 【3】陈小梅，张晓峰，韩萍，等(全小麦啤酒工艺酿制野葛根啤酒及其营养学评价[J](中 国酿造，2009， 4 :173,175 【4】赵妍娟(酿醋工艺对野葛根成分转化的营养学评价[D](郑州:郑州大学，2010 【5】高婧(葛根提取物对奶牛泌乳性能的影响及其机理研究[D](郑州:河南农业大学，2006 【6】6 段理清(大别山野葛生长过程中植物化学物及主要营养成分变化规律的研究[D](郑州: 郑州大学，2006 【7】雷云国(肉牛生产技术讲座 三 肉牛的消化系统和功能[J](现代化农业，2002， 05 : 28,29 ofisoflavonesofPuerariaflowers011rtitricoxide 【8】YuanD(Inhibitoryactivity production from rat