动物免疫学论文

《动物免疫学》期 末 论 文 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 题目：单克隆抗体 姓    名                    学    号  101601020          院    系  生命科学与技术        专    业  生物技术              年    级    10级                  指导教师                    2013年 6月 2 日         摘要………………………………………………………………………………………1 关键词………………………………………………… …………………………………………………1 Abstract……………………………………………………………………………………1 Key words…………………………………………………………………………………1 1．McAb 的制备技术现状…………………………………………… ……………………2 1.1 鼠源性单抗………………………………………………………………………3 1.2人-鼠嵌合抗体……………………………… ……………………………………3 1.3完全人源性抗体……………………………………………………………………4 1.3.1噬菌体体抗体库技术……………………………………………………………4 1.3.2 转基因技术……………………………………………………………………4 1.3.3 核糖体展示技术………………………………………… …………………5 2.单克隆抗体的应用………………………………………………………………………5 2.1 单克隆抗体在预防方面应用………………………………………… …………5 2.2单抗在诊断学中的应用……………………………………………………………6 2.3单克隆抗体在蛋白提纯中的应用…………………………………………………6 2.4单克隆抗体技术在食品卫生中的应用……………………………………………6 2.5单克隆抗体制备的细胞工程学……………………………………………………7 3 结论………………………………………………………………………………………7 参考文献……………………………………………………………………………………9 致 谢………………………………………………………………………………………10         目录 单克隆抗体 摘要: 单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，其在基因和蛋白质的结构与功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来，随着分子生物学和细胞生物学的发展，出现了抗原特异性的B淋巴细胞杂交瘤技术、人-鼠嵌合抗体制备技术、噬菌体展示技术、核糖体展示技术和转基因小鼠技术制备单克隆抗体，这些技术有效地解决了单克隆抗体鼠源性等问题，使单克隆抗体凭借自身高度特异性和均一性的特点在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面显出了独特的优势和良好的应用前景，故单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。 关键词：杂交瘤技术; 单克隆抗体; 基因工程抗体；制备技术 Abstract: Monoclonal antibody technique，as an important tool in modern life science research，plays anindispensable role in the study of gene structure and protein function． Recently，with the development of molecularbiology techniques and cell biology，Several methods to generate McAb have evolved，such as immortalizationof antigen-specific B cell hybridoma technology，generation of chimeric and humanized antibodyfrom antibody by genetic engineering，Phage display technology，Ribosome display technology and Transgeneticmouse，this methods can revolved the murine problem of McAb and so on． McAb has now gained a niche as an epochal breakthrough in the treatment of the tumor，autoimmune disease，organ transplanting and so on． Somonoclonal antibody preparation technology development is very important． Key words: Hybridomatechnique；Monoclonal antibody; Chimeric atibody ；Preparative technique; 1．McAb 的制备技术现状 1975 年，Kohler 和Milstein 将小鼠骨髓瘤细胞和经绵阳红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术,因此在1984年获得诺贝尔医学和生理学奖[1]。单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb,简称单抗)技术是将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体的技术。单克隆抗体具有性质纯、效价高、特异性高、少或无血清交叉反应等特点，另外单克隆抗体用永生的杂交瘤细胞株来分泌抗体，不需要不断免疫动物。由于它上述的性质，使它在许多学科领域得到应用，尤其在疾病的诊断与治疗方面，单抗已占生物药品市场的20％的份额。 单克隆抗体传统制备 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 图 制备过程—致敏B淋巴细胞（免疫动物） 杂交细胞瘤制备、筛选 杂交瘤细胞分泌抗体的确认 分泌抗体的杂交瘤细胞克隆 单克隆抗体的批量生产 1．1 鼠源性单抗 目前所生产的单抗大多数是鼠源性的。然而作为在人体内的应用， 鼠源单抗尚存在一些问题。鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体（human anti-mouseantibody,HAMA）[2]，很大程度上限制了mAbs 的临床应用。此外，鼠源性mAbs 不能与人类抗体FcRn 结合，鼠源单抗与自然杀伤细胞等免疫细胞表面Fc 段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，人血循环中的半衰期短，它发挥细胞毒作用作用的时间较短。为了克服以上这些问题，近年，随着分子生物学的发展，人们已有可能通过抗体工程技术制备人-鼠嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体 1.2人-鼠嵌合抗体 嵌合抗体产生于1980 年代中期，是将非人源抗体可变区移植到人抗体恒定区, 应用DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组, 再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物,选用适当的抗生素或试剂进行筛选, 再用与传统杂交瘤技术相似的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。嵌合抗体是通过基因重组技术用人McAb 的恒定区基因替换鼠McAb 的恒定区基因，从而编码产生的McAb，也就是将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能去除鼠源化部分或代之以人源化片段，减少了鼠源性抗体的免疫原性，从而尽可能减少单抗的异源性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。但嵌合抗体仍保留了30%的鼠源性［3］，可诱发人抗鼠反应。 为了进一步提高嵌合抗体的人源化，在嵌合抗体的制备过程中又引进了重构抗体技术和表面重塑技术以提高抗体的人源化。重构抗体是与异源抗体和抗原的结合相关的；而表面重塑抗体技术是对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸进行替换。所替换的片段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区构像的残基要尽量保留。 1.3完全人源性抗体  全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的[4]。完全人源性抗体是用于治疗的最理想抗体，研究者已经创建了一系列的方法来制备此抗体。 1.3.1噬菌体体抗体库技术  噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术. 20 世纪80 年代Smith发现了可以分离基因的噬菌体展示技术。噬菌体展示技术建立在噬菌体外壳具有表达抗体蛋白片段能力的基础上。 基本原理是将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因通过基因工程技术随机插入噬菌体的外壳蛋白基因，继而感染大肠杆菌，经增殖并以抗体片段Fab 或ScFv外壳蛋白融合蛋白的形式展示在噬菌体表面；利用靶分子，经过“亲和-洗脱-扩增-亲和”循环过程筛选，除去杂蛋白并富集特异性抗体[5]。噬菌体表达技术制备抗体有以下优点：其一是可以获得具有人体性质的单克隆抗体, 其二是分离抗体的速度极快, 最快在1 周内即可完成抗体的分离工作。但该技术也存在一定的缺陷，如从非免疫抗体库获得的抗体亲和力不高; 免疫抗体库的库容量不足，难以涵盖一些动物抗体的多样性; 在淘选过程中会出现高亲和力低拷贝的特异性噬菌体抗体的丢失等［6］。 1.3.2 转基因技术  全人抗体还可以通过小鼠的基因工程免疫方法获得。转基因小鼠的Ig 基因是用人的相应基因替代，产生对人免疫系统非异种抗体，这种影响人抗体的策略是改造小鼠的体液免疫系统，将人Ig 基因微位点转入小鼠，产生能分泌人Ig 的转基因小鼠。这样可省去对抗体分子重构时在基因水平的复杂性，保留了完整的Ig 类别转换和亲和力成熟的自然机理。这种转基因小鼠的不足之处在于基因片段较小，仅30 kb 左右，因此这种抗体在面对抗原多样性时，其抗体应答显得单薄而不足。 此后，Green 等[7]人利用基因打靶技术将编码人抗体轻重链的基因片段大约18 Mb 的DNA 全部转到自身抗体基因位点已被灭活的小鼠基因组中，再经过繁育筛选，建立了稳定的转基因小鼠品系。这样得到的转基因小鼠对特异的抗原能产生高亲和力的人源抗体。再用传统的杂交瘤技术，将表达特异抗体的转基因小鼠B 细胞和骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞系，产生人源抗体。 1.3.3  核糖体展示技术  核糖体展示技术是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的技术。该技术利用聚合酶链反应扩增含目的基因的cDNA 文库，同时引入启动子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/翻译耦联系统作用下，形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物，构成核糖体展示的抗体库，再用相应的抗原对翻译混合物进行筛选并从中分离mRNA，通过反转录-聚合酶链反应富集目的基因，并将目的基因导入表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工程抗体库。 核糖体展示技术与噬菌体展示技术和转基因技术相比，由于其完全属于体外操作系统， 无需依赖细胞技术和毒性蛋白对宿主菌生长的影响，不受体内环境的限制，扩大了展示文库的库容量和分子多样性。此外， 核糖体展示技术无需进行体内外系统转化， 全程只需通过PCR 技术复制、扩增，使得其建库时间缩短，筛选简便。PCR 技术还可引入突变， 增加分子多样性， 从而获得高亲和力抗体。目前还有很多研究表明，核糖体展示技术还能提高小分子抗体的稳定性， 如三结构域抗体(VH／K)可以明显改进ScFv [8]的稳定性。而核糖体展示技术的最大缺点就是mRNA 易降解。目前已有研究表明，氧钒核糖核苷复合物(VRC)作为过渡阶段的类似物发生作用，可有效地抑制核酸酶，提高mRNA 的稳定性。另外“蛋白质-核糖体-mRNA” 三元复合物的稳定性也较差，但可通过在缓冲液中加入一定浓度的镁离子、交联核糖体RNA 的磷酸基团，抑制核糖体复合物的解离[9]。