蛋白质水解度的简易测定方法

蛋白质水解度的简易测定方法 广 西 农 业 生 物 科 学 第 21 卷 第 2 期 2002 年 6 月 Jour nal of Guangxi Agric. and Biol. Science Vol. 21, No. 2 June, 2002 a 文章编号: 1008 3464 ( 2002) 02 0113 03 蛋白质水解度的简易测定方法 1 2 2 袁斌 , 吕桂善 , 刘小玲 ( 1 深圳市成业冷冻有限公司, 广东 深圳 518019; 2 广西大学 生物技术与糖业 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院, 广西 南宁 530004) 摘要: 介绍了一种比较简单可行的蛋白质水解度的测定方法, 该方法基于国外通 用的 pH STAT 法, 不 需要特别的仪器, 化学试剂耗量少, 测定结果可靠, 便于实验室和工业 化生产使用。 关键词: 蛋白质; 水解度; pH STAT 法 中图分类号: TQ936. 1 文献标识码: A The simple method of deter mining for the degree of hydrolysis of proteins 1 2 2 YU ANG Bin , LU Gui shan , LIU Xiao ling ( 1 Shenzhen Chengye F reeze Cor por at ion Limit ed, Shenzhen 518019, China; 2 Biot echnology and Sugar Engineering Col lege, Guangxi U niv . , Nanning 530004, China) Abstr act: A simple and workable method , which was based on pH STAT method , for deter- mining t he degree of hydr olysis of protein , was intr oduced in the present paper. This met hod can be used in lab and food indust ry wit h good result s and l it t le reagents consumptions. Key wor ds : prot ein; degree of hydr olysis; pH ST AT Met hod 蛋白质是人体必不可少的营养素, 在人体的代谢和生长过程中起着十分重要的作用。但由于不同 的蛋白质其氨基酸组成与空间结构不同, 在人体内的消化吸收率也大不相同。当蛋白质被水解为小肽 和游离氨基酸后, 其吸收利用率大为增加。因此, 为了充分地利用好这些蛋白质资源, 对蛋白质进行 水解是十分必要的。但如果蛋白质水解过度, 会导致水解产物出现苦味, 严重影响到产品的质量和风 味。因此, 对蛋白质进行有限水解非常重要。为了使水解达到预定的要求, 就必须对蛋白质的水解度 进行有效的测定。 所谓蛋白质的水解度 ( Degree of hydrolysis, DH ) 是指蛋白质中的肽键被水解的百分数, 其计算 公式为: DH % = h / htot×100% 其中, h 即是蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数 ( mmol / g 蛋白质) , 而 htot 则是指每克 原料蛋白中肽键的毫摩尔数。对于某一特定的蛋白质, 该值是一个常数。但由于蛋白质中的肽键的数 目没法精确的测出, 而且不同的蛋白质其肽键的含量也不同, 因此, 一般根据文献取一个经验值, 对 于酪蛋白, h tot值为 8. 2 mmol/ g 蛋白质。 收稿日期: 2001 08 18 a 基金项目: 广西大学科 研基金资助 ( X0102019) 作者简介: 袁斌 ( 1973 ) , 男, 广东兴宁人, 深圳市成业冷冻有限公司助理工程师; 通讯联系人为吕桂善。 广 西 农 业 生 物 科 学 21 卷 第114 很显然, 当蛋白质中的肽键全部被水解生成游离的氨基酸时, 则水解度为 100% ; 没有被水解时, 其水解度为 0。由于蛋白质水解时每裂解一个肽键就新生成一个- NH 2 和一个- COOH 基, 因此, 在 测定蛋白质的水解度时, 只要定量的测定新生成的- NH 2 和- COOH 基的量就可以计算出 h 值, 这样 就可以算出蛋白质的水解度来。 常见的蛋白质水解度的测定方法有三硝基苯磺酸法 ( T NBS) [ 1] , 甲醛固定法, 茚三酮法[ 2] , 三氯乙 酸法和 pH STA T 法[ 3] 。在上述几种方法中, 国内通常采用甲醛固定法和茚三酮法。对于茚三酮法, 由 于比色测定时读数不稳定, 很难读出一个准确的数值; 而且它采用单一氨基酸作为标准, 而不同的氨 基酸对茚三酮的显色度有偏差, 因此所得的结果不够准确 [ 4]。甲醛固定法操作相对简单, 但结果偏低。 对于 T NBS 法, 测定结果相对可靠, 但测定用试剂不容易买到[ 2, 4] 。因此, 国外常用 pH ST AT 法。但 由于 pH STAT 法需要特别的仪器, 普通的实验室没有这一整套设备, 因此, 国内很少采用这种方法 进行水解度的测定。本文即介绍一种实用、简便的 pH STAT 变通法。 1 材料与方法 1. 1 实验材料 酪蛋 白 的 制 备 : 取 1 kg 的 鲜 牛 乳 , 脱 脂 后 用 6 mol / L 的HCl 调 至 pH 4 . 6 , 使 酪 蛋 白 沉 淀 , 4 000 r/ min 离心 15 min , 将沉淀和乳清分开。水洗酪蛋白沉淀, 使其 pH 为中性, 离心去掉上清液, 将 沉淀冷冻干燥, 即得酪蛋白。 1. 2 化学试剂 胰蛋白酶 ( T rypsin, Gibco 公司生产, 活力单位 1?250) , 20 mmol / L 磷酸盐缓冲液 ( pH7. 10) , 0. 5 mol/ L 的 NaOH 等。 1. 3 酪蛋白的水解 准确称取 1. 0000 g 的酪蛋白, 用 25 mL 20 mmol/ L 磷酸盐缓冲液 ( pH7. 10) 溶解, 调节其 pH 为 7. 0, 加入 100 mg 胰蛋白酶, 混匀, 置于 50 ?的水浴锅中进行水解, 经过一定反应时间, 需要终止反 应时, 将反应体系加热到 100 ?, 保持 5 min, 将酶失活, 即可终止反应。 1. 4 经典 pH ST AT 法测定蛋白质水解度 [ 3] 采用经典的 pH 值进行在线控制, 以维持反应体系恒定的 pH。 1. 5 本文简易法蛋白质水解度 ( DH % ) 的测定 [ 3] pH ST AT 法那样, 对反应体系的 pH 值进行在线控制, 而只需在水解结束后将反应体系的 pH 调至 7. 0, 并记录下所用的碱液的量即可。具体方法如下: 水解开始时, 调节反应体系的 pH 为 7. 0, 反应 结束后测定反应体系的 pH 值, 用 0. 5 mol / L 的 NaOH 将反应体系的 pH 调到原来的 pH, 记录下所用 的碱液的量, 按下式即可计算出酪蛋白的水解度[ 3] : 水解度 DH % = B ( Mb) ( 1/ A) ( 1/ MP ) ( 1/ htot) ×100 其中: B 为 NaOH 的体积 ( mL) ; Mb 为 NaOH 的浓度 ( mol/ L) ; 在 pH 7. 0, 50 ?的实验条件下, 对 于酪蛋白, 1/ A为 2. 26; MP 为蛋白质的质量 ( g) ; htot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数, 对于酪蛋 白, 该值取 8. 2。 2 结果与讨论 ( 1) 两种方法结果对比。为了验证本测定方法的可靠性, 进行了酪蛋白的水解实验, 分别用经典的 pH ST AT 法和本实验的简易方法对酪蛋白的水解度进行测定, 结果见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1。从表 1 中结果可以看出, 用 pH STAT 法与本文所述简易法测定的结果没有显著的差异。 ( 2) 酪蛋白水解进程研究。为了研究不同的水解反应, 尤其是长时间的水解反应, 是否可以同样应 用这种方法进行水解度的测定, 本文还对酪蛋白的水解进程进行了研究, 具体结果见表 2。结果表明, ST AT 法 测定蛋白质的水解度时, 利用 pH 自动控制仪实时对反应体系的 pH 水解度的测定按照 pH STAT 法 , 有改动。采用本方法测定蛋白质水解度时, 不需要象经典的 第 2 期 袁斌等: 蛋白质水解度的简易测定方法 115 在不需要进行恒定 pH 值水解时, 可以用本方法进行水解度的测定。事实上, 在水解过程中, 通过 pH STA T 法进行水解度的测定可以知道, 对于大多数的蛋白质酶法水解反应, 酶的水解作用主要发生在 刚开始的 1 h 内, 过后其水解作用逐渐下降 ( 见表 2) , 所以一般的水解反应都可以用本方法进行测定。 ( 3) 考虑到某些长时间的水解反应 ( 如水解 16,24 h) , 如果水解时 pH 下降太快, 导致体系的 pH 过低, 有可能影响到蛋白酶的活性, 这时不宜采用本方法进行测定, 而只能用 pH STAT 法或其它方 法进行测定。 表 1 酪蛋白水解 度的测定结果 Table 1 The deter mination of the degr ee of hydrolysis of casein 方法 水解度 开始时 pH 终止时 pH 添加 0. 5 mol?L - 1NaOH 的量/ LL M ethod Beginning T erm ination Volume of /% - 1 pH value pH value Degr ee of 0. 5 mol?L NaOH hydr olysis 1050 经 典 pH STAT 法 pH STAT method 7. 0 7. 0 14. 47 本 文简易法 Simple way in the pr esent paper 7. 0 6. 20 1040 14. 33 注: 反应时间为 240 min。 Note : T he tota l hydr olysis time was 240 min . 表 2 酪蛋白水解 进程参数记录 Table 2 The par ameters of casein hydr olysis process 项目 方法 时间 T ime/ min 30 60 90 120 150 180 210 240 Item M ethod 7. 00 7. 00 7. 00 7. 00 7. 00 7. 00 7. 00 7. 00 pH 值 pH value A B 6. 57 6. 34 6. 32 6. 32 6. 32 6. 32 6. 33 6. 34 950. 00 A 加 碱量/ LL 1000. 00 Volume of 0. 5 mol?L - 1NaOH B 水 解度/ % A 13. 09 Degr ee of hydr olysis B 13. 78 注: A 为用经典的 pH ST AT 法测定酪蛋白水解度, B 为每隔 30 m in 测一次 pH 值, 到反应结束后再加碱调节 pH 到 7. 0 的方法测定酪蛋白水解度。 Note : A denot es t he t ypical pH STAT method; B denot es t he simple way used in t he pr esent paper . 3 小 结 本文在 pH ST AT 法的基础上通过变通, 提出了一种简单易行的蛋白质水解度的测定方法, 适应 于不需要恒定 pH 的水解反应。本方法不需要操作者随时守着水解反应体系, 记录水解时 pH 的变化并 保持一个恒定的 pH 值, 只需要在水解结束时测定一下反应体系的 pH 值, 并调节到原来的 pH 值即可, 因此本方法较之 pH ST AT 法要简单易行。可适用于实验室及食品工业生产线上需要控制蛋白质水解 程度的 DH % 的检测。 参考文献: [ 1] ADLER NI SSEN J. Deter mination of the degree of hydr olysis of food protein hydrolysates by Tr initr oben- zenesulfonic Acid [ J ] . J Agr ic F ood Chem, 1979, 27: 1 256,1 262. [ 2] 赵新淮, 冯志彪. 蛋白质水解物水解度的测定 [ J] . 食品科学, 1994, 11: 65,67. [ 3] ADLER NISSEN J. Enzymatic Hydrolysis of Food P roteins [ M] . London: Elsevier Applied Science Publisher s, 1986. 12,14. [ 4] 郭兴凤. 蛋白质水解度的测定 [ J ] . 中国油脂, 2000, 25 ( 6) : 176,177. ( 责任编辑 梁健)