生物化学实验操作手册(生物科学专为业)

生物化学实验操作手册(生物科学专为业) 总 论 21世纪是生命科学的世纪,生物化学与分子生物学是当代生命科学领域中一门重要的 它涵盖的基础理论,基本知识,基本技术与医学研究各学科领域密切相关,其理论基础学科, 与技术的发展,推动了生命科学的发展,对人类的科技进步与文明产生巨大影响。 生物化学实验是医学院校学生必修的一门独立的基础实验技术课程，其研究技术的发展与应用是依据物理学、化学及生物学的基本理论和实验方法而建立起来的。20世纪20年代微量分析的发展，30年代电子显微镜的出现，40年代层析技术和电泳技术的兴起，以及同位素示踪技术、各种光谱技术、核磁共振技术的应用，激光、超导等新技术的出现，电子计算机技术的突飞猛进，使生物化学实验手段提高到一个崭新的水平，掌握生物化学实验方法和研究技术，对医学院校学生来说是十分重要的。 本门课程主要侧重于给学生以基本的实验方法和技能的训练，让学生了解并掌握生物化学的四大基本实验方法，即:分光光度法、离心法、层析法和电泳法。同时也注意引进一些新近发展起来的、重要的生物化学及分子生物学研究技术，作为学生学习其他专业课程和进入科学研究领域的准备。 一、实验要求 1(实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果，操作关 键步骤及注意事项。 2(实验时要严肃认真专心进行操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果，结果不良时，必须重做。 3(实验中，应及时将实验结果如实记录下来，并请老师当场审核。根据实验结果进行科学分析，按时将 实验报告 化学实验报告单总流体力学实验报告观察种子结构实验报告观察种子结构实验报告单观察种子的结构实验报告单 交教师评阅。 二、实验时注意事项 1(进实验室要穿好实验服，以免酸碱腐蚀衣服。 2(进实验室前准备好实验指导、课本、笔记、实验记录本、 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 本、文具等。 3(要保持实验台整洁，试剂、仪器应整齐,按次序放置。实验完毕要按各类仪器的清洗方法和要求将仪器清洗干净。 4(实验室是培养学生独立思考、独立工作能力及良好科学作风的重要场所，操作务必认真不得敷衍，室内应保持肃静，不得吸烟、玩闹 ，不得随地吐痰，乱丢纸屑。实验后要清扫实验台面、地面、试剂瓶要码放整齐。 5(要爱护仪器、节约药品。第一次实验时要按仪器清单清点仪器，负责保管，用后如数交还,在使用时如有破损，及时报告，经指导教师检查后填写破损单，按学校规定赔偿。 6(贵重仪器，如分光光度计、离心机等，要尽力爱护，使用前应熟悉使用方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动。 7(要节约水电，一经用完随手关闭水门、电门。 三、值日生任务 1(领发本次所用仪器、物品，清点、交还临时用仪器、物品，若有损坏负责追查赔偿。 2(管理操作公用仪器，打蒸馏水。 3(搞好实验室卫生，做到仪器、桌面、地面、水池„„全干净。 4(确保安全:管好仪器、门窗、水电。 5(请任课及技术室老师检查工作，认可后方能离开实验室。 四、试剂使用规则 1(使用试剂前应仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需要。 1 2(取出试剂后，立即将瓶塞盖好，切勿盖错，放回原处。试剂瓶塞、专用吸量管、滴管，不得与试剂瓶分家，以免错用而污染试剂，造成自己或他人实验的失败。未用完的试剂不得倒回瓶内。 3(取标准溶液时，应先将标准液倒入干净试管中，再用清洁吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准溶液。 4(使用滴管时，滴管尖端朝下，切勿倒置，勿使试剂流入橡皮帽内。 5(使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒量取，若用吸管时只能用吸耳球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。 五、安全注意事项 1(低沸点有机溶剂，如乙醚、石油醚、酒精等均系易燃物品，使用时应禁明火、远离火源，若需加热要用水浴加热，不可直接在火上加热。 2. 凡属发烟或产生有毒气体的化学实验，均应在通风柜内进行，以免对人体造成危害。 3(若发生酸碱灼伤事故，先用大量自来水清洗，酸灼伤者用饱和NaHC0溶液中和，碱3灼伤者用饱和HB0溶液中和，氧化剂伤害者用NaS0处理。 33224 4(若发生起火事件，根据发生起火性质分别采用砂、水、C0或CCl灭火器扑灭。 24 5(离开实验室必须关好窗户，切断电源、水源，以确保安全。 六、废弃物处理 1(所有固体废弃物如:用过的滤纸、棉花、碎屑沉淀物等必须倾弃于垃圾筒中。 2(浓酸必须弃于小钵中，用水稀释后倒入水池中。 3(实验完成后之沉淀或混合物含有可提取之贵重药品者不可随意舍弃，应交教师保存。 2 第一篇 生物化学实验基本操作、基本技术及原理 第一章 生物化学实验基本操作 【玻璃仪器的洗涤与清洗】 生物化学实验常用各种玻璃仪器，其清洁程度将直接影响实验结果的可靠性。因此，玻璃仪器的清洁不仅是实验前后的常规工作，而且是一项重要的基本技术。 玻璃仪器的清洗方法很多，需要根据实验的要求，以及污物性质选用不同的清洁方法。 1(新购仪器的清洗 新购仪器表面附着油污和灰尘，特别是附着有可游离的金属离子。因此，新购仪器需要用肥皂水刷洗，流水冲净后，浸于10,NaCO溶液中煮沸。用流水冲净后，再浸泡于1,,23 2,HCl溶液中过夜。流水洗净酸液，用蒸溜水少量多次冲洗后，干燥备用。 2.使用过的玻璃仪器的清洗 (1)一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器，如试管、烧杯、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2,3次后，倒置于清洁处晾干。 (2)容量分析仪器，如吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，沥干后，浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水和蒸馏水冲洗干净，干燥备用。 (3)比色杯，用毕立即用自来水反复冲洗，如有污物粘附于杯壁，宜用盐酸或适当溶剂清洗。然后用自来水、蒸馏水冲洗干净。切忌用刷子、粗糙的布或滤纸等擦试。洗净后，倒置晾干备用。 【吸量管的种类和使用】 吸量管是生化实验最常用的仪器之一，测定的准确度和吸量管的正确选择和使用有密切关系。 1(吸量管的分类 常用的吸量管可以分为三类: (1)奥氏吸量管 供准确量取0.5、1.0、2.0、3.0ml液体所用。此种吸量管只有一个刻度，当放出所量取的液体时，管尖余留的液体必须吹入容器内。 (2)移液管 常用来量取50ml、25ml、10ml、5ml、2ml、1ml的液体，这种吸量管只有一个刻度，放液时，量取的液体自然流出后，管尖需在盛器内壁停留15秒钟，注意管尖残留液体不要吹出。 (3)刻度吸量管 供量取1Oml以下任意体积的溶液。一般刻度包括尖端部分。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，吸量管上端标有“吹”字。未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。 3 图1(1(1 三类吸量管简图 l、2 刻度吸量管 3奥氏吸量管 4移液管 2(吸量管的使用 (1)选用原则 准确量取整数量液体，应选用奥氏吸量管。量取大体积时要用移液管。量取任意体积的液体时，应选用取液量最接近的吸量管。如欲取O.15ml液体，应选用0.2ml的刻度吸量管。同一定量试验中，如欲加同种试剂于不同管中，并且取量不同时，应选择一支与最大取液量接近的刻度吸量管。如各试管应加的试剂量为0.30、0.50、0.70、0.90ml时，应选用一支1.0ml刻度吸量管。 (2)吸量管的使用 使用吸量管时，用拇指和中指夹近顶端部分，将管的下端插入液体，用吸耳球吸入液体到需要刻度标线上1,2cm处(插入液面下的部分不可太深，也不可太浅，防止空气突然进入管内，将溶液吸入吸耳球内)，用食指封闭上口将已充满液体的吸量管提出液面，把吸量管提到与眼睛同一水平线上，然后小心松开上口，调节液面至需要的刻度处。将吸量管移到另一容器，松开上口，使液体自由流出。最后再根据规定吹出或不吹出尖端的液体。 图l.l.2 放液体时的姿势 3(可调式移液器的使用 1)可调式移液器的结构 4 图l.l.3可调式移液器的结构 图l.l.4持移液器的姿势 注:推动按钮内部的活塞分2段行程，第一档为吸液，第二档为放液，手感十分清楚。 2) 可调式移液器的操作 a(调节轮至所需体积值; b(套上吸头，旋紧; c(垂直持握可调式移液器用大拇指按至第一档; d(将吸头插入溶液，徐徐松开大拇指，使其复原; e(将可调式移液器移出液面，必要时可用纱布或滤纸拭去附于吸头表面的液体(注意: 不要接触吸头孔口); f(排放时，重新将大拇指按下，至第一档后，继续按至第二档以排空液体。 注意:移取另一样品时，按卸尖按钮弃掉吸头并更换新吸头。 【混匀】 样品和试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质 迅速地接触，必须借助于外力的机械作用。常用的混匀方法有以下几种: 1.旋转法:手持容器，使溶液作离心旋转。适用于未盛满液体的试管或小口器皿如锥 形瓶。 2.指弹法:一手执试管上端，另一只手轻弹试管下部，使管内溶液作旋涡运动。 3.搅动法:使用玻璃棒搅匀，多用于溶解烧杯中的固体。 4(电磁搅拌混匀 5.混匀器法:将容器置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。 注意:混匀时谨防容器内液体溅出或被污染;严禁用手堵塞管口或瓶口振摇。 【保温】 将容器放入恒温水浴箱，调节温度设定钮至所需温度。水浴箱中水分要充足，实验过程中要随时监测温度，并及时调节。 【过滤】 用于收集滤液，收集沉淀或洗涤沉淀。在生化实验中如用于收集滤液应选用干滤纸，不应将滤纸先弄湿，湿滤纸将影响滤液的稀释比例。滤纸过滤一般采用平析法(即对折后，再对折)并且使滤纸上缘与漏斗壁完全吻合，不留缝隙。向漏斗内加液时，要用玻棒引导而且不应倒入过快，勿使液面超过滤纸上缘。较粗的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸。有时以离心沉淀法代替过滤法可达到省时、快捷的目的。 【离心沉淀法】 5 欲使沉淀与母液分开，过滤和离心都可以达到目的，但是当沉淀粘稠，或颗粒小得可以通过滤纸时，则需选用离心法。特别是溶液量小又需定量测定时，离心分离法更具优越性。离心分离是利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分的方法，是实验室常规采用的技术。 离心机种类很多，转速少于6000r/min的为低速离心机;转速低于25000r/min的为高速离心机;转速超过30000r/min的为超速离心机。根据离心机的用途不同，还可以将离心机分为分析离心机和制备离心机。其中制备离心技术又分为分级离心技术和密度梯度离心技术。用于生物大分子分离的，还有超速离心技术。本节将简要叙述一般离心机的使用方法(特殊用途的离心机请参阅相关的说明书)。 低速离心机的使用: 1(离心前检查:取出所有套管，起动空载的离心机，观察是否转动平稳;检查套管有无软垫，是否完好，内部有无异物;离心管与套管是否匹配。 2(离心原则 平衡:将一对离心管放入一对套管中，置于天平两侧，用滴管向较轻一侧的离心管与套管之间滴水至两侧平衡。 对称:将已平衡好的一对套管置于离心机中的对称位置。 3(离心操作 (1)对称放置配平的一对套管后，盖严离心机盖, 开启电源。 (2)调节转速调节钮，逐渐增加转速至所需值，当离心机转速达到要求时，开始计时。 (3)达到离心时间后，缓慢将转速调回零。断开电源，当离心机自然停止后，取出离心管和离心套管。 (4)倒去离心套管内的平衡用水，倒置于干燥处晾干。 4(注意事项 (1)离心机的起动、停止都要慢，否则离心管易破碎或液体从离心管中溅出。 (2)离心过程中，若听到特殊响声，应立即停止离心，检查离心管。若离心管已碎，应清除并更换新管;若管未碎，应重新平衡。 第二章 实验样品的制备 【血液样品】 1(全血 取清洁干燥的试管或其他容器，收集人或动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。常用剂量如下:草酸钾或草酸钠l,2mg;柠檬酸钠5mg;氟化钠5,10mg;肝素0.1,0.2mg。 抗凝剂宜先配成水溶液，按取血量的需要加于试管或适当容器内，横放，再蒸干水分(肝素不宜超过30?)，使抗凝剂在容器内形成薄层，利于血液与抗凝剂的均匀接触。 取得的全血如不立即使用应储于4?冰箱之中。 2(血浆 抗凝之全血在离心机中离心，使血球下降，如此得到的上清液即为血浆。质量上乘的血浆应为淡黄色。为避免产生溶血，必须采用干燥清洁的采血器具和容器，并尽可能地少振摇。 3(血清 收集不加抗凝剂的血液，室温下自然凝固，所析出的草黄色液体，即为血清。制备血清时血凝块收缩析出血清，大约需要3小时。为促使血清尽快析出，必要时可以采用离心的方 6 法缩短分离时间，并且可得到较多的血清。 制备血清同样要防止溶血，所以，应用的器具应当干燥清洁。而且血清析出后宜用干净的玻璃棒轻轻分离血凝块与容器壁的粘连，及时吸出析出的血清。 【组织样品】 在生化实验中，经常利用离体组织研究各种物质代谢途径和酶系的作用。或者从组织中分离、纯化核酸、酶以及某些有意义的代谢物质进行研究。 但是，在生物组织中，因含有大量的催化活性物质，离体组织的采集必需在冰冷条件下进行，并且尽快完成测定。否则其所含物质的量和生物活性物质的活性都将发生变化。 一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出所需脏器或组织，除去脂肪和结缔组织之后，用冰冷生理盐水洗去血液，再用滤纸吸干，称重后，按试验要求制成匀浆或者组织糜。 组织糜:迅速将组织剪碎，用捣碎机绞成糜状，或者加入少量黄砂于乳钵中，研磨至糊状。 组织匀浆:取一定量新鲜组织剪碎，加入适量匀浆制备液，用高速电动匀浆器或者玻璃匀浆器磨碎组织。由于匀浆器的杵头在高速运转中会产生热量，因此在制备匀浆时，需将匀浆器置于冰水中。 常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液和0(25mol,L的蔗糖液等，可根据实验的要求，加以选择。 组织浸出液:上述组织匀浆液再经过离心分离出的上清液就是组织浸出液。 第三章 分光光度法 光是由光子所组成，光线就是高速向前运动的光子流，光的本质是一种电磁波，传播过程呈波动性质，具有波长和频率的特征。将电磁波按波长(或频率)顺序排列起来，即得: γ射线 X射线 紫外线 可见光 红外线 无线电用电磁波 人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在400,760nm，波长范围在200,400nm为紫外 波长<400nm的光线)，波长范围在760,500000nm为红外区(波长>760nm„„)。可见光区( 光区的电磁波，因波长不同而呈现不同的颜色，这些不同颜色的电磁波称单色光，单色光并非单一波长的光，而是一定波长范围内的光，太阳及钨丝灯发出的白光，是各种单色光的混合光(复合光)，利用棱镜可将白光分成按波长顺序排列的各种单色光，即红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等，这就是光谱。 一切物质都会对某些波长的光进行吸收，而物质对不同波长的射线，表现为不同的吸收现象，这一性质称为选择性吸收。有色溶液之所以呈现不同颜色，就是由于这种对光的选择性吸收所致。某些无色物质虽对可见光无吸收作用，但也能选择性地吸收在可见光范围外的部分光能，即可吸收特定波长的紫外线或红外线。物质的吸收光谱与它们本身的分子结构有关，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同。因此每种物质都具有其特异的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比。故可利用各种物质的不同的吸收光谱特征及其强度对不同物质进行定性和定量的分析。吸收光谱的测定可用来检测各种不同的物质。 分光光度法的原理 分光光度法，常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据Lam—bert和Beer定律。 1(Lambert定律 一束平行单色光垂直照射于一均匀物质(溶液)时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。 7 2(Beer定律 当一束单色光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若溶液的厚度不变，则溶液浓度C愈大，光吸收愈大，透射光线强度的减弱也愈显著，光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比。 3(1ambert-Beer定律(又称吸收定律) A=KCL A=-1gT A为吸光度(光密度、消光度) C为溶液的浓度 L为溶液的厚度 其中K为常数，又称消光系数(extinction coefficint)，表示物质对光线吸收的本领， 其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。 4(待测样品浓度计算 根据lambert--Beer定律，如果单色光的波长、溶液的性质和溶液的厚度一定时，用一个已知浓度的标准液和一个未知浓度的待测液进行比色分析就可以得出下列运算公式: A:KCL = A:KCL 标标样样 由于是同一类物质及相同光径，故 A,A=KCL,KCL=C,C 样标样标样标 C=A,A?C 样样标标 式中C= 待测样品浓度，A= 待测样品吸光度。 样样 C= 标准溶液浓度，A= 标准溶液吸光度。 标标 根据上式可知，对于相同物质和相同波长的单色光(消光系数不变)来说，溶液的吸光度和溶液的浓度呈正比。故己知标准溶液的浓度及吸光度按公式可算出测试样品溶液的浓度。 【分光光度计的结构】 分光光度计的种类很多，其基本原理及结构基本相似，一般都包括下列几个部件，如下图所示。 1(光源 一个良好的光源要求具备发光强度高、光亮、稳定、光谱范围较宽和使用寿命长等特点。 分光光度计上常用的光源有钨灯和氢灯(或氘灯)，前者适用于340,900nm范围的光源，后者适宜于200,360m的紫外光区，为了使发出的光线稳定，光源的供电需要由稳压电源供给。 2(单色器 单色器是将混合光波分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作为色散元件，它们能在较宽光谱范围内分离出相对纯波长的光线，通过此色散系统可根据需要选择一定波长范围的 8 单色光，单色光的波长范围愈狭，仪器的敏感性愈高，测量的结果愈可靠。 3(狭缝 狭缝是由一对隔板在光通路上形成的缝隙，通过调节缝隙的大小调节入射单色光的强度，并使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要，分光光度计的缝隙大小是可调的。 4(吸收池(或称比色杯、比色皿、比色池) 一般由玻璃或石英制成。 在可见光范围内测量时，选用光学玻璃吸收池:在紫外线范围内测量时必须用石英池。 注意保护比色杯的质量是取得良好分析结果的重要条件之一，吸收池上的指纹、油污或壁上的一些沉积物，都会影响其透光性，因此务必注意仔细操作和及时清洗并保持清洁。 5(检测系统 主要由受光器，和测量器两部分组成，常用的受光器有光电池、真空光电管或光电倍增管等。它们可将接收到的光能转变为电能，并应用高灵敏度放大装置，将弱电流放大，提高敏感度。通过测量所产生的电能，由电流计显示出电流的大小，在仪表上可直接读得A值，T值。较高级的现代仪器，还常附有电子计算机及自动记录仪，可自动描出吸收曲线。 第四章 层析法 层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。层析系统包括两个相，一个称为固定相，另一个称为流动相。当以流动相流过加有样品的固定相时，由于样品各组分的理化性质(吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)的差异，受固定相的阻力与流动相的推力的影响不同，因而各组分在固定相与流动相之间的分配也不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。配合相应的光学、电学和电化学检测手段，可用于定性、定量和纯化某种物质，其纯度高达99,。层析法是分离率、灵敏度(pg,fg级)、选择性均高的一种分离方法，尤其适合样品含量少，而杂质含量多的复杂生物样品的分析。 固定相可以是固体也可以是液体，但这个液体必须附载在某个固体物质上，该物质称载体或担体(Support)。同样流动相可以是液体也可以是气体。 【分类】 1(按层析原理分类 (1)吸附层析(Adsorption Chromatography)固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。 (2)分配层析(Partition Chromatography)固定相为液体，利用各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。 (3)离子交换层析(Ion Exchanger Chromatography)固定相为离子交换剂，利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。 (4)凝胶层析(Gel Chromatography)固定相为多孔凝胶，利用各组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行分离。 (5)亲和层析(Affinity Chromatography)根据生物特异性吸附进行分离，固定相只能和一种待分离组分有高度特异性的亲和能力者结合，而与无结合能力的其他组分分离。 2(按操作方式不同分类 (1)纸层析(Paper Chromatography)以滤纸作为液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到组分分离目的。 (2)薄层层析(Thin Layer Chromatography)以一定颗粒度的不溶性物质，均匀涂铺在薄板上，点样后，用流动相展开，使组分达到分离。 (3)柱层析(colunm Chromatography)将固定相装柱后，使样品沿一个方向移动，以达到 9 分离目的。 3(几种层析法 【纸层析】 用滤纸作为支持物的层析法，称为纸层析。纸层析结果的好坏除了与选用展开剂的种类、实验中的点样量多少、点样时是否扩散和实验条件是否稳定有关外，还与所用层析滤纸的质量好坏密切相关。对层析用滤纸的要求是:质地均匀、厚薄均一、机械强度好、平整、无折痕、无明显纵向和横向纸纹等。层析常用的滤纸有whatman和国产新华层析滤纸。根据层析快慢及纸厚度可分若干型号。 表l-4-1新华层析滤纸的规格和性能 型号 厚度(mm) 性能 备注 l 0.17 快速 1(快速滤纸，因纸质疏松，斑点 易扩散，适合于Rf值较大的样品和粘 2 0.16 中速 度较大的展开剂 3 0.15 慢速 2(慢速滤纸，斑点不易扩散，适 合于Rf值较小的样品和粘度较小的 4 0.34 快速 展开剂，但展开时间较长 5 0.32 中速 3(新华2、5号滤纸相当于whatmanI 6 0.30 慢速 和III号层析滤纸 由于纸层析是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维与水有较强的亲和力，约能吸收20,,22,的水，其中部分水与纤维素羟基以氢健形式存在，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力很小，所以滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相(展开剂)。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点上的溶质在水和有机相之间不断进行溶液分配，各种组分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。溶质在纸上的移动速度可用迁移率Rf值表示: 样品原点到斑点中心的距离 Rf= 样品原点到溶剂前沿的距离 可以根据测出的Rf值来判断层析分离的各种物质，当与标准品在同一标准条件下测得Rf值进行对照，即可确定该层析物质。 影响Rf值的因素有很多，除被分离组分的化学结构、样品和溶剂的pH值、层析中温度等外，流动相(展开剂)的极性也是一个重要因素。展开剂极性大，则极性大的物质有较大Rf值，极性小的物质Rf值亦小，反之亦然。常用流动相的极性大小依次排列如下: 水>甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙脂>氯仿>乙醚>甲苯>苯>四氯化碳>环己烷>石油醚 层析时，流动相不应吸取滤纸中的水分，否则改变分配平衡，影响Rf值。所以多数采用水饱和的有机溶剂如水饱和的正丁醇，被分离物质的不同，选择的流动相也不同。 纸层析法既可定性又可定量。定量方法一般采用剪洗法和直接比色法两种。剪洗法是将组分在滤纸上显色后，剪下斑点，用适当溶剂洗脱后，用分光光度计法定量测定。直接比色法是用层析扫描仪直接在滤纸上测定斑点大小和颜色深度，绘出曲线并可自动积分，计算结果。 10 为了提高分辨率，纸层析可用两种不同的展开剂进行双向展层，双向纸层析一般把滤纸裁成长方形或方形，一角点样，先用一种溶剂系统展开，吹干后，转90度，再用第二种溶剂系统进行第二次展开。这样，单向纸层析难以分离清楚的某些物质(Rf值很接近)，通过双向纸层析往往可以获得比较理想的分离效果。 【薄层层析】 薄层层析是利用玻璃板、塑料板、铝板、聚酰胺膜等作为固定相的载体，在板上涂一薄层不溶性物质为固定相，再把样品涂铺在薄层的一端，然后用合适的溶剂作为流动相(展开剂)。薄层层析因固定相涂布物质的不同，可分成吸附薄层层析、离子交换薄层层析和分配薄层层析等三种。通常说的薄层层析就是指吸附薄层层析。有关薄层层析的基本原理与Rf的计算与纸层析基本相似。现就薄层层析时应注意的事项简述如下: 1(吸附剂的选择 吸附剂的选择是否合适是吸附层析的关键。常用吸附剂有硅胶、氧化镁、氧化铝、硅藻土、纤维素等。硅胶为微酸性吸附剂，适合分离酸性和中性物质;氧化铝和氧化镁是微碱性吸附剂，适合分离碱性和中性物质;硅藻土和纤维素为中性吸附剂，适合分离中性物质。 2(吸附能力 一般用活度来表示吸附剂的吸附能力。吸附能力主要受吸附剂含水量的影响。其由强到弱程度以I，II， III，?，V 表示。吸附剂活度强时，能吸附极性较小的基团;吸附剂活度弱时，对非极性基团吸附能力也较强。一般利用加热烘干的办法，减少吸附水分，从而增强其活度。通常，分离水溶性物质时，因其本身具有较强极性，故吸附剂要弱一些:相反，分离脂溶性物质时，吸附剂活度要强一些。 3(颗粒大小 无论那一种薄层层析，其吸附剂颗粒的大小和均匀性，是保证每次实验保持Rf值恒定的基础，一般使用吸附剂颗粒直径为无机类 0.07,0.1mm(150,200目)，有机类0.1,0.2mm(70,140目)。颗粒太粗，层析时溶剂推进快，但分离效果差，而颗粒太细，层析时展开太慢，易产生斑点不集中并有拖尾现象。 薄层层析的优点是:设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，可用腐蚀性的显色剂并可在高温下显色。 纸层析和薄层层析均可用于氨基酸、肽、核苷酸、糖类、脂类和激素等物质的分离和鉴定。 【离子交换层析】 离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，来分离混合物中各种离子的层析技术。作为固定相的离子交换剂，根据其不溶性物质(母体的化学本质)可以分为以下几类: 第一类是在纤维素分子结构上，连接一定的离子交换基团生成的离子交换纤维素。如DEAE-纤维素(二乙基氨乙基纤维素)、羧甲基(CM)纤维素、TEAE-纤维素(三乙基氨乙基纤维素)、GE-纤维素(胍乙基纤维素)等。 # 第二类以不溶性的人工合成高分子为母体的离子交换树脂。如华东强酸阳42、强酸732、AmberliteIR,100、Dowex 50、AmberliteIRC-50、神胶800等。 第三类是以葡聚糖凝胶为母体，结合一定的离子基团生成的离子交换葡聚糖凝胶。 如DEAE-Sephadex A25、A50，CM--Sephadex C25，SP-Sephadex C25,QAE-SephadexA25、A50等。 以上各类离子交换剂，还可根据其所含酸性或碱性基团的解离能力的强弱，可进一步分成强酸型和弱酸型以及强碱型和弱碱型。 离子交换剂的作用原理如下: 11 阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动相中的阳离子进行交换。 +++ +- - R—S0H+ Na== R—S0 Na+ H 33 阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动相中的阴离子进行交换。 +--+- - R—N (CH)0H+ Cl==R—N( CH)C1+ OH 3333 流动相中，不同离子化合物带电荷多少不同，与离子交换剂相互作用的强弱也不同，当它们被结合到固定相交换基团上以后，可以用提高流动相中离子强度或改变pH的办法，把它们从离子交换柱上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。在实际工作中，可根据被分离物质所带电荷的种类、分离物分子的大小、数量等选用适当类型的离子交换剂。 离子交换层析时应注意以下几点: 1(选择合适的离子交换树脂 被分离的物质为无机阳离子或有机碱时，选用阳离子交换树脂;若是无机阴离子或有机酸时，选用阴离子交换树脂。交换树脂颗粒大小:离子交换树脂多为200,400目，纤维素离子交换剂为100,325目。分离用的树脂一般以直径较小为宜，因粒度小，表面积大，分离效率高。但粒度过小，装柱时太紧密，流速慢，需提高洗脱压力。 2(交换剂的处理 离子交换树脂出厂时为干树脂，使用时需用水或溶液浸透使其充分吸水溶胀，然后减压去气泡。倾去浮在溶液中的小颗粒树脂，再用去离子水洗至澄清，使用前用所需的pH和离子强度的缓冲液平衡，纤维素交换剂使用前处理原则基本同上。离子交换树脂和纤维素交换剂，均可再生后反复使用。再生方法为交换树脂使用后，将交换树脂泡入稀酸或稀碱溶液中，一段时间后用蒸馏水洗至中性;或用稀酸、稀碱缓缓流过交换柱。然后再洗至中性。离子交换纤维素使用后用2mol,L NaOH洗涤，然后用水洗净碱液，再用缓冲液平衡，供下次实验用。 3(装柱 一般层析柱选择的原则是柱的高度与直径之比以10:l到20:l为宜。装柱方法一般采用重力沉降法，其关键是交换剂在柱内必须分布均匀，严防脱节和产生气泡，柱中交换剂表面必须平整。 4(洗脱 一般是根据所用洗脱液比吸附物质具有更活泼的离子或基团，从而把吸附物质顶替出来，利用此原则选择各种洗脱液。若分离的是非单一物质，除正确选择洗脱液外，还可采用控制流速和分段收集的方法获得尽可能单一物质。对一些复杂组分的分离，可采用浓度梯度洗脱或pH梯度洗脱。 【凝胶层析】 凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一定量溶液后溶胀成一种柔软富有弹性，不带电荷，不与溶质相互作用的惰性物质，以它作为固定相的层析称为凝胶层析。层析用的凝胶大多为人工合成。目前应用最多的为葡聚糖凝胶(Sephadex)，它是一种次环氧氯丙烷作交联剂交联聚合而成的右旋糖苷珠形聚合物。聚合物具有主体多糖网状结构，其网孔大小与交联度有关，交联度越大，网状结构越致密，网孔的孔径越小，交联度越小，网状结构越疏松，网孔的孔径越大。由于被分离物质的分子大小(直径)和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而最后流出层析柱。可见凝胶层析中的凝胶起着分子筛的作用，因而又称为分子筛层析，或排阻层析。 葡聚糖凝胶(Sephadex)不溶于水，但能吸水膨胀，其吸水量与交联度成反比，在Sephadex后面缀上G-X作为交联度的标记。交联度越小，吸水量越大，X值越大。实际上X值约为该胶粒吸水量的10倍。例如:Sephadex G-50和G-100，吸水量分别为5ml水,g凝胶与10ml,g凝 12 胶。此外交联度大，机械强度大，较能容忍较高压力，易采用高流速;而交联度小的如SephadexG-150，G-200，则机械强度小，易被压缩。使用时流速需慢些，一般每分钟流速不大于2.0ml。 此外尚有以N，N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂将丙烯酰胺聚合而成的聚丙烯酰胺凝胶，其商品名为生物胶P(Bio-Gel P);琼脂糖凝胶是由D--乳糖和3，6无水一L乳糖残基组成的多聚糖，市售有Bio-Gel A和Sepharose;交联琼脂糖(Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B及Sepharose CL-6B)等。各种凝胶由于交联剂的种类和比例不同，因而同一类凝胶可分成若干种类，分离大分子物质的性能也不一样。使用时必须根据被分离物质分子的大小、形状和分离目的选择不同类型的凝胶。 【亲和层析】 亲和层析是以能与生物高分子进行特异结合的配基作为固相(对混合物中某一生物高分子进行一次性分离纯化的层析技术。 生物高分子具有能与其结构相对应的专一分子进行可逆性结合的特性。如:酶与底物、产物、辅酶、抑制剂和变构调节剂结合，激素与受体结合，抗原与相对的抗体结合，RNA与互补的DNA结合等。把作为配基(载体)的专一分子(如酶的底物、辅酶，抗原的互补抗体)以共价健连接到不溶性载体(如纤维素、葡聚糖凝胶)上，使之固相化，然后将固相化的载体装入层析柱，作为层析的固定相，把含有一种或数种生物高分子(如蛋白质)混合液加到柱上，这时混合物中只能与不溶性配基具有高度亲和性的蛋白质被吸留，其他不能与配基结合的蛋白质则不受阻碍地直接从柱中流出。再用缓冲溶液洗脱沾附在配基表面的非亲和吸附物，改变洗脱液，把特异吸附的蛋白质从不溶性配基上解离和洗脱下来。 作为配基(载体)最广泛应用的是琼脂糖凝胶，制品有珠状琼脂糖凝胶(sepharose 2B、4B和6B)，活化后即可作为亲和吸附的载体。如AH--Sepharose 4B;CH—Sepharose和活化的CH-Sepharose 4B等。其中溴化氰(CNBr)活化的Sepharose 4B是亲和层析中使用最广泛的载体。 第五章 电泳法 【电泳的基本原理】 带有电荷的颗粒在电场中泳动的现象叫电泳。带正电荷的泳向负极，带负电的泳向正极。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。混合物中各组分在电场中的泳动速度，首先和本身所带的净电荷多少、分子量大小和形状有关。一般来说，带电越多，分子量(颗粒)越小而且是球形的，则泳动速度就快。反之，则慢。因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。 【影响电泳的主要因素】 1(电泳介质的pH 当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态，即不向正极或负极移动。当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极;反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，即决定于两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH 8.6的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。 2(缓冲液的离子强度 离子强度对电泳的影响是:离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰;离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定;离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层)使电泳速度减慢。所以常用离子强度为 13 0.02,0.2之间。溶液离子强度的计算: 2 I=1,2?CiZ1 2 I=离子强度 Ci=克分子浓度(指离子而言) Z=离子的价数 1 溶液中不能解离的或极少解离的物质不应计入离子强度。 3(电场强度 电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压(电势差)为150V，则电场强度为150,15=10 V,cm，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。 4(电渗作用 在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。电渗现象所造成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中间，观察电渗方向和距离。 【区带电泳的分类】 1(按支持物物理性状不同，可分为: (1)滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。 (2)粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 (3)凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 (4)丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。 2(按支持物的装置形式不同，可分为: (1)平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。 (2)垂直板式电泳。 (3)连续流动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电级，缓冲液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。可分离较大量的蛋白质。以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸，分离效果更好。 3(按pH的连续性不同，可分为: (1)连续pH电泳:电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。 (2)非(不)连续pH电泳:缓冲液与支持物之间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离。 不连续电泳与连续电泳的主要区别在于前者?有两层不同孔径的凝胶系统;?电极槽中及两层凝胶中所用的缓冲液pH值不同;?电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。而后者在这三个方面都是单一或是均匀的。 【几种常见的电泳方法】 1. 纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳 纸电泳是以滤纸为支持物进行电泳,现已基本被醋酸纤维素薄膜电泳所代替。 醋酸纤维素薄膜电泳具有分离速度快，区带清晰，操作简便等优点。例如血清中含多种蛋白质，用醋酸纤维素薄膜电泳可分为五个区带，经固定染色后不仅可看到清晰的色带，而且可定量，计算出各种蛋白质的百分比。 2(琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从琼脂中精制分离出的胶状多糖。琼脂糖凝胶作为生命科学和相关领域研究中的重要介质材料是由于它的特殊物理化学特性。它作为电泳介质有如下优点: 14 1) 琼脂糖凝胶是具有大量微孔的基质，其孔径尺寸取决于它的浓度。浓度越低，孔径 越大。 2) 琼脂糖具有较高的机械强度，允许在1%或更低的浓度下使用。 3) 琼脂糖无毒，不给操作者带来不便。 4) 染色、脱色程序简单、快速，背景色较低。 5) 琼脂糖凝胶很容易干成薄膜，适于光密度扫描和永久保存。 3(聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis)是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳，这种凝胶由丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N’-甲叉基(亚甲基)双丙烯酰胺(N，N’- methylene-bis-acrylamide，简称Bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，弹性大，透明，化学稳定性高，无电渗作用，设备简单，样品用样 ,lOO μg)和分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成量少(1 孔径大小不同的凝胶，可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)，以测定蛋白质亚基分子量。 凝胶浓度的选用如表1-5-1: 表1-5-1 分子量范围 凝胶浓度, <10000 20,30 蛋 10000,40000 15,20 白 40000,100000 lO,15 质 100000,500000 5,10 >500000 2,5 <10000 15,20 核 10000,100000 5,10 酸 100000,2000000 2,2.6 根据凝胶形状可分为盘状电泳和板状电泳。盘状电泳是在直立的玻璃管内，利用不连续的缓冲液的pH值进行电泳，同时，由于样品混合物被分开后形成的区带非常窄，呈圆盘状，故而得名。板状电泳(垂直或水平)是将丙烯酰胺聚合成方形或长方形平板状，平板大小和厚度视实验需要而定。垂直平板电泳有如下优点:?表面积大，易于冷却，便于控制温度;?能在同一凝胶板上，相同操作条件下，同时点加多个样品，便于相互比较;?一个样品在第一次电泳后，可将平板转90度进行第二次电泳即双向电泳;?便于用各种方法鉴定(如放射自显影等)。其缺点是制备凝胶时操作较复杂，电压较高，电泳时间较长。 4(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据蛋白质分子(或其他生物大分子)所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成若干条区带。然而有时两个分子量不同的蛋白质，由于其分子大小的差异，被他们所带电荷的差别补偿而以相同的速度向阳极移动，因而不能达到分离的目的。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳就是设法将电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度。 SDS是一种阴离子表面活性剂，它能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质的疏水部分，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS,g蛋白质。由于SDS带有负电荷，使各种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷差别。这样的SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而只与 15 蛋白质的分子量有关。在一定条件下，迁移率与蛋白质的分子量的对数成正比。 _bm Mr=K(10) IgKM=IgK—bm=K—bm l Mr:蛋白质的分子量 K，K:为常数 l b:为斜率 m:为迁移率 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量，必须先作一个以已知蛋白质分子量迁移率为横坐标，已知蛋白质分子量对数为纵坐标的标准曲线。然后把未知分子量的蛋白质样品在同样的条件下电泳，测出其迁移率。再从图中求出未知蛋白质样品的分子量。由于用这种方法测蛋白质分子量简便、快速、精确度高(一般误差在?10,以内)，近来已得到非常广泛的应用。 5(免疫电泳 免疫电泳是在凝胶电泳与凝胶扩散试验基础上发展起来的一项化学技术。它是一种特异性的沉淀反应，敏感性较高，每种抗原可以和相应抗体起反应，呈现一条乳白色的沉淀弧线。它不仅可以检定混合物中组分的数目，而且还可以利用各组分的电泳迁移率结合免疫特异性及化学性质和酶的活力等来确定混合物中各组分的性质。 将待检可溶性物质(抗原)，在琼脂板上进行电泳分离，由于各种可溶性蛋白质分子的颗粒大小、质量与所带电荷的不同，在电场作用下，其带电分子的运动速度(迁移率)具有一定的规律。因此通过电泳能把混合物中的各种不同成分分离开来。当电泳完毕后，在琼脂板一定的位置上挖一条长的槽，加入相应的抗血清，然后置湿盒内让其进行双向扩散。在琼脂板中抗原和抗体互相扩散，当两者相遇且比例适合时，就形成了不溶性的抗原抗体复合物，出现乳白色的特异性沉淀弧线。可以根据出现的沉淀弧线数目来初步判定混合物中抗原的数量。一种好的抗血清应出现较清晰、特异性的沉淀弧线，沉淀弧线的位置取决于抗原和抗体两种反应物的分子量、比率和扩散速度。当抗原扩散速度慢时，沉淀弧线弯曲度大，其位置靠近移动轴。反之当抗原扩散率较快时，弧度较平，其位置离开移动轴。 第二篇 基础生物化学实验 实验一 蛋白质的定量测定——Folin-酚法 一、目的要求 (1)学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法; (2)制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。 二、实验原理 (一)蛋白质定量测定的方法 目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收等测定得知;另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量克氏定氮，双缩脲反应，Folin—酚试剂法(Lowry法)。这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求和实验条件进行选择。 (二)Folin—酚法原理 1. 原理 Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合 16 物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250ug蛋白质 2. 优缺点 目前实验室多用Folin—酚法测定蛋白质含量。此法的优点是:操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。缺点是此反应受多种因素干扰。在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH,-CH-NH,-CS-NH以及在性质上是氨基酸或肽的缓2222 冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素(约0.5%左右)，胍(0.5%左右)，硫酸钠(1%)，硝酸钠(1%)，三氯乙酸(0.5%)，乙醇(5%)，乙醚(5%)，丙酮(0.5%)对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。 三、试剂和器材 (一)试剂 Folin—酚试剂: 试剂甲: 1) 4%碳酸钠溶液 2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液 3) 1%硫酸铜溶液 4) 2%酒石酸钾钠溶液。 临用前将(1)与(2)等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。(3)与(4)等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。 试剂乙: 称钨酸钠(NaWO•2HO)100g，钼酸钠(NaMoO•2HO)25g置2000ml磨口回流222242 装置内，加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h(烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出)，再加入硫酸锂(LiSO)150g，蒸馏水450ml及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。 试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液(1mol/L左右)，以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红?紫红?紫灰?墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。 (二)标准和待测蛋白质溶液 1. 标准蛋白质溶液 结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150ug/ml蛋白溶液 2. 待测蛋白质溶液 人血清，使用前稀释100倍。 17 (三)器材 试管及试管架;0.5,1,及5ml移液管，恒温水浴，722型分光光度计。 四、操作方法 (一)制作标准曲线 取14支试管，分两组按下表平行操作: 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 试剂处理 标准蛋白质溶液/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/ml 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Folin-酚甲试剂/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 摇匀，于20—25?放置10min Folin-酚乙试剂/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 迅速摇匀，30?(或室温20—25?)水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm处比色 A 640 注:由于这种显色化合物组成尚未确定，它在可见光红光区呈现较宽吸收峰区。不同书籍选用不同的波长，有选用500或540nm的，有选用660,700或750nm的。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收。本实验选用640nm。 绘制标准曲线:以A值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 640 (二)未知样品蛋白质浓度测定 取4支试管，分2组，按下表平行操作: 试管编号 空白管 样品管 试剂处理 ×2 ×2 血清稀释液/ml 0 0.2 蒸馏水/ml 1.0 0.8 Folin,酚甲试剂/ml 5.0 5.0 摇匀，于20—25?放置10min Folin,酚乙试剂/ml 0.5 0.5 迅速摇匀，30?(或室温20—25?)水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm处比色 A 640 (三)计算 ,6640A值对应标准曲线蛋白质含量，10蛋白质(g)/100ml血清,，血清稀释倍数，100测定时用稀释血清的ml数 五、注意事项 (1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin,酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白 质作用生成碱性的铜,蛋白质溶液。当Folin,酚乙试剂加入后，应迅速摇匀(加一管摇一管)，使还原反应产生在磷钼酸,磷钨酸试剂被破坏之前。 (2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。 18 实验二 SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 一、实验目的 1. 学习和掌握SDS,PAGE垂直板电泳测定蛋白质分子量的原理和方法。 2. 掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。 二、实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性和定量分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和分子量测定。SDS-PAGE 是在要进行电泳分析的样品中加入含阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二、三级结构;β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，置沸水浴中煮沸3,5 min，使SDS与蛋白质充分结合，引起蛋白质变性、解聚、带上大量同种负电荷、形成棒状结构。样品处理液中通常加入溴酚蓝染料作为电泳指示剂，用于控制电泳过程(溴酚蓝指示剂为一种小分子物质，可以自由通过凝胶孔径，用它可显示电泳的前沿位置)。此外，样品处理液中还可加入适量蔗糖或甘油以增大溶液密度，便于加样时样品溶液沉入样品凹槽底部，防止加样时产生对流扩散。制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，一般分离大分子量蛋白质需要使用较低浓度的分离胶;分离小分子量蛋白质需要使用较高浓度的分离胶。当分离胶聚合以后，通常要在凝胶上面加上一层约1 cm厚的浓缩胶，并在浓缩胶上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶的pH值较低(通常pH6.8)、浓度较低(通常为3,5,)，形成的孔径大，各种蛋白质都可以自由通过，常用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后通电即可电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统即连续系统与不连续系统，不连续系统中存在着三种不连续性即pH不连续、凝胶不连续、溶液离子组成不连续。样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质容易通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快;大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据各自分子量的大小而被分离。 三、试剂与器材 1(器材 ?夹心式垂直板电泳槽，凝胶模(135×100×1.5mm)(北京六一仪器厂) ?直流稳压电源(电压300—600V，电流50—100mA) ?吸量管(1,5,10 ml) ?烧杯(25,50,100 ml) ?细长头的滴管 ?1ml注射器及6号长针头 ?微量注射器(10μl或50μl) ?水泵或油泵 ?真空干燥器 ?培养皿(直径120mm) 2(试剂 (1)标准蛋白质 目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于SD S-PAGE测定未知蛋白质分子量。 19 ?高分子量标准蛋白试剂盒(Pharmacia公司产品，表中2-1)。 表2-1 5种标准蛋白质 蛋白质名称 M 来 源 r 甲状腺球蛋白 669 000 猪甲状腺 铁蛋白 440 000 马 肺 过氧化氢酶 232 000 牛 肝 乳酸脱氢酶 140 000 牛 心 血清清蛋白 67 000 牛 血 清 注:按说明书要求处理 ?低分子量标准蛋白试剂盒，中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产(表2-2)。 表2-2 5种标准蛋白质 蛋白质名称 M r 磷酸化酶B 94 000 牛血清蛋白 67 000 肌动蛋白 43 000 磷酸酐酶 30 000 烟草花叶病毒外壳蛋白 17 500 ?自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。如买不到标准蛋白试剂盒时，可参考常用的标准蛋白质及其分子量表。从中选择3—5种蛋白质，如马心细胞色素C(Mr12 500)、牛胰胰凝乳蛋白原A(Mr25 000)、猪胃胃蛋白酶(Mr35 000)、鸡卵卵清蛋白(Mr43 000)、牛血清白蛋白(Mr67 000)等蛋白质，按照每种蛋白0.5—1mg?ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。 (2)不连续体系SDS-PAGE有关试剂 ?10%(W/V)SDS溶液:称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4?贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。 ?1%TEMED(V/V):取1mlTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4?贮存。 ?10%AP(W/V):称AP1g，加重蒸水至10ml。最好临用前配制。 -1?样品溶解液:内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol?l pH8.0 Tris-HCl缓冲液。 -1?先配制0.05mol?l pH8.0 Tris-HCl缓冲液:称Tris 0.6g，加入50ml重蒸水，再中入约3ml -11mol?l HCl，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。 ?按表2-3配制样品溶解液。 表2-3不连续体系样品溶解液配制 -1加重蒸水至最后总体积为 SDS 巯基乙醇 溴酚蓝 蔗糖 0.05mol?LTris-HCl 100mg 0.1ml 2mg 4g 2ml 10ml *如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。 ?凝胶贮液 ?30%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同，称Acr 30g及Bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4?贮存。 ?10%浓缩胶贮液:称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4?贮存。 ?凝胶缓冲液 20 -1?分离胶缓冲液(3.0mol?lpH8.9 Tris-HCl缓冲液):称Tris 36.3g，加少许重蒸水使其溶解， -1再加1mol?lpHCl约48ml，调pH至8.9，最后加重蒸水定容至100ml，4?贮存。 ?浓缩胶缓冲液(0.5mol?L-1 pH6.7 Tris-HCl缓冲液):称Tris6.0g，加少许重蒸水使其溶解， -1再加1mol?l HCl约48ml调pH至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4?贮存。 ?电极缓冲液 四、操作步骤: (一)安装夹心式垂直板电泳槽 关心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如图16-4。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由1个 形硅胶框、长与短玻璃板及样品槽模板(梳子)所组成。电泳槽由上贮槽(白金电极在上或面对短玻璃板)，下贮槽(白金电极在下或面对长玻璃板)和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部间依下列顺序组装: 1、将长、短玻璃板分别插到 形硅橡框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 2、将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 3、将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 4、竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。 (二)配胶及凝胶板的制备 1(配胶 根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。由于SDS-PAGE有连续系统及不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法，见表16-5和表16-6。 表16-5 SDS-不连续体系凝胶配制 电极缓冲液为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，内含0.1%SDS。 -1电极缓冲液为0.1mol?lpH7.2磷酸缓冲液，内含0.1%SDS。 2(凝胶板的制备 (1)SDS-不连续体系凝胶板的制备 ?分离胶的制备:按表16-5配制20ml10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。 ?浓缩胶的制备:按表16-5配制10ml3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约30min后凝胶聚合，再放置20—30min，使凝胶“老化”。小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。 (三)样品的处理与加样 1(样品的处理 根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，如上海东风生化试剂厂生产的低分子量标准蛋白试剂盒，每一安瓿则需加入200μl样品溶解液，自己配制标准及未知样品，按.5—1mg/1ml样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧以免加热迸出)，在100?沸水浴中保温3min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可入在—20?冰箱保存较长时间，使用前在100?沸水中加热3min，以除去亚稳态聚合。 2、加样 21 一般每个凹形样品槽内，只加一个种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10—15μl(即2—10μg蛋白)。如样品较稀，加样体积可达100μl。如样品槽中有所泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。 (四)电泳 分离脉聚合后是否进行预电泳则应根据需要而定，SDS连续系统预电泳采用30mA，60—120min。 在电极槽中倒入pH8.3Tris-HCl电级缓冲液，内含0.1%SDS即可进行电泳。在制备浓缩胶后，不能进行预电泳，因预电泳会破坏pH环境，如需要电泳只能在分离胶聚合后，并用分离胶缓冲液进行。预电泳后将分离胶面冲洗干净，然后才能制备浓缩胶。电泳条件也不同于连续SDS-PAGE。开始时电流为10mA左右，待样品进入分离胶后，改为20—30mA，当染料前沿距硅橡胶框底边1.5cm时，停止电泳，关闭电源。 (五)凝胶板剥离与固定 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液，固定守液。 (六)染色与脱色 将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数 五、实验注意事项 1. SDS-PAGE测定分子量有10,误差，不可完全信任。 2. SDS与蛋白质的结合成比例(即:1.4gSDS /g蛋白质)，蛋白质含量不可过量，否则SDS结合量不足，会使测量结果出现偏差。 3. 有的蛋白质(如:电荷异常或结构异常的蛋白质;带有较大辅基的蛋白质)不能采用该法测相对分子量。 4. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。 实验三 酵母核糖核酸(RNA)的提取 一、实验目的 掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。 二、实验原理 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。 酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%~10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%~0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成 22 本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。 稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。 三、仪器与试剂 (一)仪器 公用:1(离心机 2(pH试纸 3. 沸水浴 4. 量筒 5. 石蕊试纸。 个人:1(三角瓶10只 2(中试管10支 3(吸管:5ml 、 10ml各1支 4(滴管4 支 5.离心管10只。 (二)试剂 1. 1molNaCL。 2. 0.14molNaCl。 3. 氯仿-异丙醇混合液。 4. 干酵母粉。 5(0.04mol氢氧化钠溶液。 6(乙酸。 7(95,乙醇。 8(5,硫酸。 9. 浓氨水。 10. 50g/L硝酸银溶液。 11(3,5—二羟甲苯试剂(地衣酚):取比重1.19HCl 100ml，加入FeCl?6H0100mg及32二羟甲苯100mg，混匀溶解后，置于棕色瓶中，此试剂必须在临用前新鲜配制。市售的3,5—二羟甲苯不能使用，必须用苯纯化结晶l,2次，并用活性炭脱色方可使用。 12(定磷试剂:2.5,钼酸铵溶液:20ml水溶解2.5克钼酸铵，加5mol,LHS030ml，24用水稀释至l00ml，此试剂可在冷处保存一月不变质。 10,抗坏血酸溶液: 10g抗坏血酸溶于100ml水。贮棕色瓶中。溶液呈淡黄色尚可用，如呈深黄色即失效。 13(二苯胺试剂: 称取1.5g二苯胺(如不纯，须在70,乙醇中重结晶2次)，溶于100ml冰醋酸(AR)中，再加入浓HSO1.5ml， 摇匀，贮在棕色瓶中放冰箱内保存备用。 24 14(沉淀剂(钼酸铵—过氯酸试剂):0.25,钼酸铵溶于2.5,过氯酸中。如配200ml，即在 193ml水中加入7m170,过氯酸和0.5g钼酸铵。 四、操作步聚 每二人取1g二片干酵母于研钵中研碎(或半药匙干酵母粉于大试管底部),加入2g,LNaOH溶液5ml提取，放入大试管沸水浴加热30分钟，并经常搅拌。待冷却后加入乙酸5,8滴，使提取液呈酸性(石蕊试纸)，分成二个试管(每人1管)，离心10,15分钟(4000转,分)。将上清液倒入另一小试管中，加入95,乙醇2ml，边加边搅。加毕，离心10分钟，即可得到核酸钠的白色沉淀。 五、注意事项 1. 稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生 物活性实验材料。 2(利用等电点控制RNA析出时，应严格控制pH。 实验四 酵母核糖核酸(RNA)组分的鉴定 23 一、实验目的 了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。 二、实验原理 RNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，加钼酸铵沉淀(或用定磷法)和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。(1)嘌呤 )地衣酚显色法:核糖核酸与浓盐酸共热碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。(2 时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚(3，5-二羟基甲苯)反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。(3)磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀[(NH4)3PO4?12MoO? 3 三、仪器与试剂 (一)仪器 公用:1(离心机 2(pH试纸 3. 沸水浴 4. 量筒 5. 石蕊试纸。 个人:1(三角瓶10只 2(中试管10支 3(吸管:5ml 、 10ml各1支 4(滴管4 支 5.离心管10只。 (二)试剂 1. 1molNaCL。 2. 0.14molNaCl。 . 氯仿-异丙醇混合液。 4. 干酵母粉。 3 5(0.04mol氢氧化钠溶液。 6(乙酸。 7(95,乙醇。 8(5,硫酸。 9. 浓氨水。 10. 50g/L硝酸银溶液。 11(3,5—二羟甲苯试剂(地衣酚):取比重1.19HCl 100ml，加入FeCl?6H0100mg及32二羟甲苯100mg，混匀溶解后，置于棕色瓶中，此试剂必须在临用前新鲜配制。市售的3,5—二羟甲苯不能使用，必须用苯纯化结晶l,2次，并用活性炭脱色方可使用。 12(定磷试剂:2.5,钼酸铵溶液:20ml水溶解2.5克钼酸铵，加5mol,LHS030ml，24用水稀释至l00ml，此试剂可在冷处保存一月不变质。 10,抗坏血酸溶液: 10g抗坏血酸溶于100ml水。贮棕色瓶中。溶液呈淡黄色尚可用，如呈深黄色即失效。 13(二苯胺试剂: 称取1.5g二苯胺(如不纯，须在70,乙醇中重结晶2次)，溶于100ml冰醋酸(AR)中，再加入浓HSO1.5ml， 摇匀，贮在棕色瓶中放冰箱内保存备用。 24 14(沉淀剂(钼酸铵—过氯酸试剂):0.25,钼酸铵溶于2.5,过氯酸中。如配200ml，即在 193ml水中加入7m170,过氯酸和0.5g钼酸铵。 四、操作步聚 (一)核酸的水解:在含有核酸钠的离心管中加入5,硫酸2ml，用玻棒搅匀，沸水浴煮10分钟。 (二)核酸的鉴定 取水解液，按下表所列程序分别鉴定核酸的嘌呤碱、磷酸及核糖和脱氧核糖。 1.嘌呤碱的鉴定:取试管两只，分别标明测定管与对照管，依次加入下列各试剂: 管 号 水 解 液 5,HSO 浓 氨 水 50g,L AgNO 243测定管 10滴 不加 3滴使成碱性 5滴 对照管 不加 10滴 3滴使成碱性 5滴 24 注:加浓氨水使呈碱性可用pH 试纸检定。 加入AgNO后，观察有何变化。静置15分钟后，再比较两管中之沉淀。 3 2.磷酸的鉴定:取试管两只，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂: 管 号 水 解 液 5,HSO 钼酸铵试剂 V24C 测定管 10滴 不加 5滴 5滴 对照管 不加 10滴 5滴 5滴 放置数分钟，观察两管颜色有何不同。 3( 核糖的鉴定:取试管两只，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂: 管 号 水 解 液 5,HSO3，5-二羟甲苯 24 测定管 4滴 不加 6滴 对照管 不加 4滴 6滴 将两试管放入沸水浴内加热10分钟，比较两管之颜色。 4.脱氧核糖的鉴定:取两试管分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂: 管 号 水 解 液 5,HSO二苯胺 24 测定管 4滴 不加 6滴 对照管 不加 4滴 6滴 将两试管同时放入沸水浴内，加热10分钟后，比较两管之颜色。 五、注意事项 地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别 的依据。 实验五 核酸的定量测定——紫外(UV)吸收法 一、目的要求 1. 掌握紫外线(UV)吸收法测定核酸浓度的原理。 2. 进一步熟悉紫外分光光度计的使用方法。 二、实验原理 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm ,()P,()P波长处。核酸的摩尔消光系数(或称吸收系数)用来表示。为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值(即A值)(表)。测得未知浓度核酸溶液的A值，即可以计260nm算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。 表4-1 核酸摩尔消光系数及相光数值 ε(P) A 260nm含磷量/(%) pH7，260nm 1µg/ml RNA 7700-7800 9.5 0.022-0.024 DNA-Na盐 6600 9.2 0.02 25 (小牛胸腺) 蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上;DNA的260nm与280nmx吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。 三、试剂和器材 (一)试剂 钼酸铵,过氯酸沉淀剂:取3.6ml70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4ml蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵,2.5%过氯酸溶液。 5-6%氨水:用25-30%氨水稀释5倍。 (二)器材 电子分析天平，离心机，离心管，紫外分光光度计，烧杯，冰浴，容量瓶(50ml)，移液管，试管及试管架。 四、操作方法 (一)准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量0.01mol/LNaOH调成糊状，再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50ml。 取两支离心管，甲管加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水，乙管加入2ml样品溶液和2ml沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min，在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5ml上清液，用蒸馏水定容至50ml。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。 (二)计算: ,A260RNADNA或浓度,，N0.024(0.020)或，L ,A260式中，为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值。 1ml待测液中测得的核酸微克数，1001ml待测液中制品的微克数核酸, , 在本实验中，1ml待测液中制品量为50μg。 实验六 过氧化氢酶米氏常数(K)的测定 m 一、实验目的 学习米氏常数的测定方法。 二、实验原理 本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶(CAT)催化下列反应: 26 过氧化氢酶2HO2HO+O? ,,,,,,2222 HO浓度可用KMnO在硫酸存在下滴定测知。 224 ,,,2KMnO，5HO，3HSO 2MnSO，KSO，5O?，8HO 4222442422 求出反应前后HO的浓度差即为反应速度。作图求出过氧化氢酶的米氏常22 数。 三、试剂 1(0.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠(AR)于100,105?烘12h。冷却后，准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓HSO 5ml，加蒸馏水至24 刻度，充分混匀，此液可贮存数周。 2(约0.02ml KMnO储存液 称取KMnO 3.4g，溶于1000ml蒸馏水中，44 加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。 3(0.004mol/L KMnO应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶4 中，加浓HSO ml，于70?水浴中用KMnO贮存液滴定至微红色，根据滴定结244 果算出KMnO贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标4 定储存液。 4(约0.08mol/L HO液 取20%HO(AR)40ml于1000.0ml量瓶中，加2222 蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO标定之，稀释至所需浓度。 4 5(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)。 四、操作步骤 l(血液稀释 吸取新鲜(或肝素抗凝)血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1:1000稀释血液。 2(HO浓度的标定:取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.08mol/L的HO 22222.0ml和25%HSO2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO滴定至微红色。从滴定用24 4 去KMnOml数，求出HO的mol浓度。 422 3(反应速度的测定:取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。 1 2 3 4 5 加入物(ml) 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 HO(约0.08mol/L) 22 3.0 2.50 2.00 1.50 1.00 蒸馏水 将各瓶置37?水浴预热5min，依次加入1:1000稀释血液每瓶0.5ml，边加 27 边摇，继续保温准5min，按顺序向各瓶加25%HSO2.0ml，边加边摇，使酶促24 反应立即终止。 最后用0.004mol/L KMnO滴定各瓶至微红色,记录KMnO消耗量(ml)。 44【计算】 HO mmolHO mol，HOml22浓度加入22数22数1( HO(mol/L),,反应瓶中22浓度44 (式中:4为反应液量4ml) 2(反应速度的计算:以反应消耗的HO mmol数表示。 22 反应速度=加入的HO mmol数,剩余的HO mmol数 2222 即:HO mol浓度×加入的毫升数,KMnO0.004 mol/L×消耗的KMnO毫升数× 5/2 224 4 (式中:5/2为KMnO与HO反应中mol换算系数) 422 3(求K值: m 下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的K值，供计算参考。 m 己知KMnO为0.004mo1/L，标定出HO浓度为0.08mol/L，列表计算如下: 422 1 2 3 4 5 计算程序 ?加人HO数 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 22 ?加人HOmmol=?×0.08 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 22 ?底物浓度,S,=??4 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 ?酶作用后，KMnO滴定ml 1.35 3.70 6.40 9.80 13.20 4 ?剩余HOmmol=?×0.004×5/2 0.0135 0.037 0.064 0.098 0.132 22 ?反应速度V=?一? 0.0265 0.043 0.056 0.062 0.068 ?[S]/V=??? 0.377 0.465 0.536 0.645 0.735 按前述方法作图求得K,0.032mol/L。 m 【思考题】 l(K值的意义是什么, m 2(测酶K值的实验中，需要特别注意哪些操作, m 实验七 维生素C的定量测定(2.6-二氯酚靛酚滴定法) 一、实验目的 1. 学习并掌握定量测量维生素C的原理和方法。 2. 熟练微量滴定法的基本操作。 28 二、实验原理 维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗体血酸(ascorbic acid)。它对物质代谢的调节具有重要的作用。近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有对化学致癌物的阻断作用。维生素C是具有L系糖构型的不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，植物的绿色部分及许多水果(如橘子、苹果、草莓、山楂等)、蔬菜(黄瓜、洋白菜、西红柿等)中的含量更为丰富。 192?，溶于水或乙醇中，不溶维生素C(还原型)纯品为白色无臭结晶，熔点190, 于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸(有生理作用)。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有 (1)2，6-二氯靛酚法 (还原型V) C (2)2，4-二硝基苯肼法 (总V) C (3)碘酸法 (4)碘量法 (5)荧光分光光度法 维生素C具有很强的还原性。它可分为还原型和脱氢型。金属铜和酶(抗坏血酸氧化酶)可以催化维生素C氧化为脱氢型。根据它具有的还原性质可测定其含量。氧化型2，6,二氯酚靛酚(Dichlorophenolindo phenol-DCPIP)在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。因此，当用2，6–二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸尚未全部被氧化时，滴下的2，6–二氯酚靛酚立即被还原成无色。但溶液中的抗坏血酸一旦全部被氧化时，则滴下的2，6–二氯酚靛酚立即呈现红色。所以，当溶液从无色转变成微红色时，即表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。此时即为滴定终点。从滴定时2，6–二氯酚靛酚标准的消耗量，可以计算出被检物质中抗坏血酸的含量。 该法简便易行，但有下列缺点:?在生物组织内和组织提取物内，抗坏血酸还能以脱氢抗坏血酸及结合抗血酸的形式存在。它们同样具有维生素C的生理作用，但不能将2，6–二氯酚靛酚还原脱色。?生物组织提取物和生物体液中常含有其他还原性物质，其中有些也可以在同样实验条件下使2，6–二氯酚靛酚还原脱色。?在生物组织提取物中，常有色素类物质存在，给滴定终点的观察造成困难。 29 2,6-二氯靛酚钠 2,6-二氯酚靛酚钠盐;双氯酚靛酚钠;2,6-二氯-N-(对羟基苯)对苯醌亚胺钠盐;2,6-别名 双氯靛酚钠盐 英文名 2,6-Dichloroindophenol sodium 分子式 C12H6Cl2NNaO2 分子量 290.08 结构式 深绿色粉末(二水合物)。有吸湿性。易溶于水和乙醇，不溶于乙醚和氯仿。其水溶液为深蓝色，酸化后变为深红色，在酸性碘化钾溶液中能使碘析出，遇热及光分解。半数致死量(小鼠，静脉)180mg/kg。 用于测定维生素C和胆碱酯酶。氧化还原指示剂。 本品应密封于阴凉干燥处避光保存。 三、试剂和器材 (一)试剂及材料 (1)松针 (2)酸化蒸馏水 (3)2，6–二氯酚靛酚钠溶液;将50mg 2，6–二氯酚靛酚溶解于约200ml含有52mg碳酸氢钠的热水中。冷后稀释至250ml。装入棕色瓶内。放在 冰箱里保存。2，6–二氯酚靛酚不稳定, 每周必须重新配制，使用前需按照下法标定: 取5ml标准抗坏血酸溶液加5ml 1,草酸，以2，6–二氯酚靛酚滴定呈粉红色，并在15秒钟内不退色为终点。计算2，6–二氯酚靛酚溶液的浓度。 (4)标准抗坏血酸溶液:溶解100mg纯抗坏血酸粉状结晶于1,草酸中，然后稀释到500ml。 使用前临时配制。 (二)器材 (1)锥形瓶(50ml)(2)小研钵(3)吸量管(10ml)(4)漏斗 (5)滤纸(6)容量瓶(50ml)(7)微量滴定管(5ml) 四、操作方法 用分析天平准确地称取松针约1克。样品必须用温水洗去泥土，并在空气中风干。放入研钵中，加酸化蒸馏水5,10ml一起研磨。放置片刻，离心4000转/分5分钟，将上清液移入容量瓶定容至50ml，取10ml放入小锥形瓶内进行滴定。 用微量滴定管，以2，6–二氯酚靛酚溶液(蓝色)滴定至提取液呈现淡粉红色，并保持15,30秒不褪。滴定过程必须迅速，不要超过2min。因为在本滴定条件下，一些非维生素C还原物质的还原作用较迟缓，快速滴定右以避免或减少它们的影响。 要使结果准确，滴下使用的2，6–二氯酚靛酚钠在1,4ml之间，若滴定结果超过此范围，则必须增减样品用量或交提取液适当稀释。 另取10ml 酸化蒸馏水作空白对照滴定。 提取液和空白对照各做三份，对结果取平均值进行计算。 30 计算: 式中:V为滴定样品提取液所耗用的2，6–二氯酚靛酚的平均毫升数;V为滴定空白AB对照所耗用的2，6–二氯酚靛酚的平均毫升数;C为样品提取液的总毫升数;D为滴定时所取的样品提取液毫升数;W为被检样品的质量。T为1毫升标准0.001N2，6–二氯酚靛酚溶液相当维生素C的毫克数，T的具体数目为mg/ml。 五、注意事项 (1)某些水果、蔬菜(如橘子、西红柿)浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。 (2)整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C太高或太低时，要酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。 (3)本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物质反应进行很慢。 (4)2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作用。 (5)干扰滴量因素有: ?若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1mL氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。 2+2+?Fe可还原二氯酚靛酚。对含大量Fe的样品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取， 2+此时Fe不会很快与染料起作用。 ?样品中可能有其他杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一滴一滴地加入，并要不断摇动三角瓶直至呈粉红色，于15s内不消退为终点。 (6)提取的浆状物如不易过滤，留取上清液进行滴定。 维生素C标定法 为了准确知道标准维生素C含量，须经标定，方法如下: (1)将标准维生素C溶液稀释为0.02mg/mL。 (2)量取上述标准维生素C溶液5mL于锥形瓶中，加入6%碘化钾溶液0.5mL,1%淀粉液3滴，再以0.001mol/L碘酸钾标准液滴定，终点为蓝色。 V，0.0881抗坏血酸浓度(mg/mL), V2 式中:V—滴定时所消耗0.001mol/L碘酸钾标准液的量(mL); 1 V—滴定时所取抗坏血酸的量(mL); 2 0.088—1mL 0.001mol/L碘酸钾标准溶液相当于抗坏血酸的量(mg)。 思考题 1、为了测得准确的维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤,为什么, 2、试简述维生素C的生理意义。 实验八 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 一、实验目的 31 1(学习分光光度计的原理和使用方法。 2(学习测定淀粉酶活力的方法。 3(了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、实验原理 种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖的一类水解酶。几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶(还有异淀粉酶和糖化淀粉酶等)。休眠种子中主要含有β-淀粉酶，而α-淀粉酶是在萌发过程中形成的。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用;其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖;β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。 两种淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化;β-淀酶不耐热，在70?下15min则被钝化。据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，我们可以采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力，再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较，求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖有还原性能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 三、器材和试剂 (一)器材 1(25毫升刻度试管。2(吸管。3(乳体。4(离心管。 5(分光光度计。6(离心机。7(恒温水浴。 (二)试剂 1. 0.1,标准麦芽糖溶液 20毫升:精确称量100毫克麦芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。 2(pH 6.9，0.02摩尔,L磷酸缓冲液 100毫升 3(l,淀粉溶液100毫升:1克可溶性淀粉溶于100毫升 0.02摩尔,L磷酸缓冲液，其中含有 0.006摩尔,L氯化钠。 4(l,3,5-二硝基水杨酸试剂: 1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20毫升2摩尔,L的氢氧化钠溶液和50毫升水中;再加人30克酒石酸钾钠，定客至100毫升。若溶液混浊，可过滤。 5(l,氯化钠溶液300毫升 6(海砂5克 四、操作步骤 1(种子发芽: 小麦种子浸泡2.5小时后，放人25?恒温箱内或在室温下发芽。 2( 酶液提取: 取发芽第三天或第四天的幼苗15株，放人乳钵内，加海砂 200毫克，加 1,氯化钠溶液10毫升，用力磨碎。在室温下放置 20分钟，搅拌几次。将提取液离心(l500转,min)6,7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，将酶提取液稀释10倍。 32 取干燥种子15粒作为对照(提取步骤同上)。 3(酶活力测定: (1)取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂(各试剂须25?预热10分钟)。 1(干种子) 2(湿种子) 3(标注管) 4(空白管) 酶液 0.5 0.5 ---- ---- 标准麦芽糖溶液 ---- ---- 0.5 ---- 淀粉溶液 1 1 1 1 蒸馏水 ---- ---- ---- 0.5 将各管混匀，放在25?，水浴中保温3分钟后，立即向各管中加人1,3,5-二硝基水杨酸溶液2毫升。 (2)取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。将各管充分混匀。 (3)用空白管作对照;在500毫微米处测定各管的光吸收值，将读数填人上表。 4(计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即:A,A,C,C 标准未知标准未知则C(酶液管浓度),A×C,A 酶标准标准 总活力单位= C×N×V 酶酶酶 N为酶液的稀释倍数 V为测量后酶液的总体 实验九 血糖的定量测定(GOD-PAP法) 一、实验目的: 学习GOD-PAP法测定血糖含量的原理和方法。 二、实验原理: 动物血液中的糖主要是葡萄糖，正常情况下，其含量较恒定。健康动物血糖水平为80~120mg/dl。GOD-PAP法，即过氧化物酶—抗过氧化物酶法是近几年临床血糖定量测定的普遍方法。该法测定血糖依据的酶反应为: Glu氧化酶(GOD) 葡萄糖 + O+ HO 2 2葡萄糖酸 ， HO 22 过氧化物酶(POD) 2HO， 4-氨基氨替比林 +酚 醌亚胺 ， 4HO 222 醌亚胺在Anm~Anm波长有最大吸收，所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的480550 量成正比。在同样条件下，测定葡萄糖标准液和样品的吸收值，代入后面所给公式即可求出样品中葡萄糖的含量。 33 三、操作(见基础生化实验指导211页) 实验十 血液中谷丙转氨酶活力的测定 一、实验目的 1. 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义。 2. 学习转氨酶活力测定的原理和方法。 二、实验原理 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶)和谷氨酸-丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶)的活力最强。它们催化的反应如下。 正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 酮测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。丙酮酸2， ，4-二硝基苯腙的生成4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。从丙酮酸2 量，可计算酶的活力。 三、试剂和器材 (一)器材 1.试管及试管架 2.吸管 3.恒温水浴 4.分光光度计 (二)试剂 1.0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4) 2.2.0μmol/ml丙酮酸钠标准溶液。 取分析纯丙酮酸钠11mg溶解于50ml磷酸缓冲液内 [当日配制]。 3.谷丙转氨酶底物。 取分析纯α-酮戊二酸29.2mg DL-丙氨酸1.78g克置于小烧杯内，加1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸调整pH至7.4后，加磷酸缓冲液至100ml。然后加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升含α-酮戊二酸2.0μmol，丙氨酸200μmol。[在冰箱内可保存一周]。 4.2，4-二硝基苯肼溶液。 在200ml锥形瓶内放入分析纯2，4-硝基苯肼19.8mg，加100ml 1 mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色玻璃瓶内置 [冰箱内保存]。 5.0.4mol/L氢氧化钠溶液。 6.人血清 [冰箱内保存。 四、操作方法 1.标准曲线的给制:取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按下表所列的 34 次序添加各试剂。 试 管 号 试剂(ml) 0 1 2 3 4 5 丙酮酸钠标准液 - 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 谷丙转氨酶底物 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 磷酸缓冲液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 (0.1mol/L,pH7.4) 2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物，(内含α-酮戊二酸)以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。 先将试管置于37?恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管内加入0.5ml2，4-二硝基苯肼溶液后再保温20min，最后，分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min，以0号管作空白，测定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。 酶活力的测定:取2支试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白2. 对照管。各加入谷丙转氨酶底物0.5ml,置于37?水浴内10min，使管内外温度平衡。取血清0.1ml加到第1号试管内，继续保温60min。到60min时，向两支试管内各加入2，4-二硝基苯肼试剂0.5ml，于37?保温20min,然后再向2支管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min后，测定未知管的520nm波长光吸收值(显色后30min至2小时内其色度稳定)。在标准曲线上查出丙酮酸的微摩尔数。(用1μmol丙酮酸代表1.0单位酶活力)。计算每100ml血清中转氨酶的活力单位数。 袆莂薆蚅袅蒄螁羃袅膄薄衿袄芆蝿螅袃莈薂蚁羂蒀莅羀羁膀薁羆羀莂莃袂罿蒅虿螈罿膄蒂蚄羈芇蚇羃羇荿蒀衿肆蒁蚅螅肅膁蒈蚁肄芃蚄薇肃蒆蒆羅肃膅螂袁肂芈薅螇肁莀螀蚃肀蒂薃羂腿膂莆袈膈芄薁螄膈莆莄蚀膇膆薀蚆膆芈蒂羄膅莁蚈袀膄蒃蒁螆膃膃蚆蚂节芅葿羁节莇蚅袇芁蒀蒇螃芀艿蚃蝿袆莂薆蚅袅蒄螁羃袅膄薄衿袄芆蝿螅袃莈薂蚁羂蒀莅羀羁膀薁羆羀莂莃袂罿蒅虿螈罿膄蒂蚄羈芇蚇羃羇荿蒀衿肆蒁蚅螅肅膁蒈蚁肄芃蚄薇肃蒆蒆羅肃膅螂袁肂芈薅螇肁莀螀蚃肀蒂薃羂腿膂莆袈膈芄薁螄膈莆莄蚀膇膆薀蚆膆芈蒂羄膅莁蚈袀膄蒃蒁螆膃膃蚆蚂节芅葿羁节莇蚅袇芁蒀蒇螃芀艿蚃蝿袆莂薆蚅袅蒄螁羃袅膄薄衿袄芆蝿螅袃莈薂蚁羂蒀莅羀羁膀薁羆羀莂莃袂罿蒅虿螈罿膄蒂蚄羈芇蚇羃羇荿蒀衿肆蒁蚅螅肅膁蒈蚁肄芃蚄薇肃蒆蒆羅肃膅螂袁肂芈薅螇肁莀螀蚃肀蒂薃羂腿膂莆袈膈芄薁螄膈莆莄蚀膇膆薀蚆膆芈蒂羄膅莁蚈袀膄蒃蒁螆膃膃蚆蚂节芅葿羁节莇蚅袇芁蒀蒇螃芀艿蚃蝿袆莂薆蚅袅蒄螁羃袅膄薄衿袄芆蝿螅袃莈薂蚁羂蒀莅羀羁膀薁羆羀莂莃袂罿蒅虿螈罿膄蒂蚄羈芇蚇羃羇荿蒀衿肆蒁蚅螅肅膁蒈蚁肄芃蚄薇肃蒆蒆羅肃膅螂袁肂芈薅螇肁莀螀蚃肀蒂薃羂腿膂莆袈膈芄薁螄膈莆莄蚀膇膆薀蚆膆芈蒂羄膅莁蚈袀膄蒃蒁螆膃膃蚆蚂节芅葿羁节莇蚅袇芁蒀蒇螃芀艿蚃蝿袆莂薆蚅袅蒄螁羃袅膄薄衿袄芆蝿螅袃莈薂蚁羂蒀莅羀羁膀薁羆羀莂莃袂罿蒅虿螈罿膄蒂蚄羈芇蚇羃羇荿蒀衿肆蒁蚅螅肅膁蒈蚁肄芃蚄薇肃蒆蒆羅肃膅螂袁肂芈薅螇肁莀螀蚃肀蒂薃羂腿膂莆袈膈芄薁螄膈莆莄蚀膇膆薀蚆膆芈蒂羄膅莁蚈袀膄蒃蒁螆膃膃蚆蚂节芅葿羁节莇蚅袇芁蒀蒇螃芀艿蚃蝿袆莂薆蚅袅蒄螁羃袅膄薄衿袄芆蝿螅袃莈薂蚁羂蒀莅羀羁膀薁羆羀莂莃袂罿蒅虿螈罿膄蒂蚄羈芇蚇羃羇荿蒀衿肆蒁蚅螅肅膁蒈蚁肄芃蚄薇肃蒆蒆羅肃膅螂袁肂芈薅螇肁莀螀蚃肀蒂薃羂腿膂莆袈膈芄薁螄膈莆莄蚀膇膆薀蚆膆芈蒂羄膅莁蚈袀膄蒃蒁螆膃膃蚆蚂节芅葿羁节莇蚅袇芁蒀蒇螃芀艿蚃蝿袆莂薆蚅袅蒄螁羃袅 35 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膄蒂蚄羈芇蚇羃羇荿蒀衿肆蒁蚅螅肅膁蒈蚁肄芃蚄薇肃蒆蒆羅肃膅螂袁肂芈薅螇肁莀螀蚃肀蒂薃羂腿膂莆袈膈芄薁螄膈莆莄蚀膇膆薀蚆膆芈蒂羄膅莁蚈袀膄蒃蒁螆膃膃蚆蚂节芅葿羁节莇蚅袇芁蒀蒇螃芀艿蚃蝿袆莂薆蚅袅蒄螁羃袅膄薄衿袄芆蝿螅袃莈薂蚁羂蒀莅羀羁膀薁羆羀莂莃袂罿蒅虿螈罿膄蒂蚄羈芇蚇羃羇荿蒀衿肆蒁蚅螅肅膁蒈蚁肄芃蚄薇肃蒆蒆羅肃膅螂袁肂芈薅螇肁莀螀蚃肀蒂薃羂腿膂莆袈膈芄薁螄膈莆莄蚀膇膆薀蚆膆芈蒂羄膅莁蚈袀膄蒃蒁螆膃膃蚆蚂节芅葿羁节莇蚅袇芁蒀蒇螃芀艿蚃蝿袆莂薆蚅袅蒄螁羃袅膄薄衿袄芆蝿螅袃莈薂蚁羂蒀莅羀羁膀薁羆羀莂莃袂罿蒅虿螈罿膄蒂蚄羈芇蚇羃羇荿蒀衿肆蒁蚅螅肅肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿 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芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆 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膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅 41 羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆聿芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芄袆肇芃蒀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄肄膇莁袃肃艿薆蝿膃莁荿蚅膂肁薅薁螈膃莇蒇螇莆蚃袅螆肅蒆螁螆膈蚁蚇螅芀蒄薃螄莂芇袂袃肂蒂螈袂膄芅蚄袁芇蒁薀袀肆芃薆袀腿蕿袄衿芁莂螀袈莃薇蚆袇肃莀薂羆膅薆蒈羅芇莈螇羅羇薄螃羄腿莇虿羃节蚂薅羂莄蒅袄羁肄芈螀羀膆蒃蚆荿蚈蚅羁莈莇袁袇蒇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒄蒄袇羃蒄薆螀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀膈薃螇袆膇蚅羂膅膆莅螅膁膅薇肁肇膄虿袃羃膃螂蚆芁膂蒁袂膇膂薄蚅肃芁蚆袀罿芀莆蚃袅艿蒈袈芄芈蚀蚁膀芇螃羇肆芆蒂蝿羂芆薅羅袈芅蚇螈膆莄莆羃肂莃葿螆羈莂薁羁袄莁螃螄芃莀蒃蚇腿莀薅袃肅荿蚈蚅羁莈莇袁袇蒇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒄蒄袇羃蒄薆螀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀膈薃螇袆膇蚅羂膅膆莅螅膁膅薇肁肇膄虿袃羃膃螂蚆芁膂蒁袂膇膂薄蚅肃芁蚆袀罿芀莆蚃袅艿蒈袈芄芈蚀蚁膀芇螃羇肆芆蒂蝿羂芆薅羅袈芅蚇螈膆莄莆羃肂莃葿螆羈莂薁羁袄莁螃螄芃莀蒃蚇腿莀薅袃肅荿蚈蚅羁莈莇袁袇蒇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒄蒄袇羃蒄薆螀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀膈薃螇袆膇蚅羂膅膆莅螅膁膅薇肁肇膄虿袃羃膃螂蚆芁膂蒁袂膇膂薄蚅肃芁蚆袀罿芀莆蚃袅艿蒈袈芄芈蚀蚁膀芇螃羇肆芆蒂蝿羂芆薅羅袈芅蚇螈膆莄莆羃肂莃葿螆羈莂薁羁袄莁螃螄芃莀蒃蚇腿莀薅袃肅荿蚈蚅羁莈莇袁袇蒇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒄蒄袇羃蒄薆螀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀膈薃螇袆膇蚅羂膅膆莅螅膁膅薇肁肇膄虿袃羃膃螂蚆芁膂蒁袂膇膂薄蚅肃芁蚆袀罿芀莆蚃袅艿蒈袈芄芈蚀蚁膀芇螃羇肆芆蒂蝿羂芆薅羅袈芅蚇螈膆莄莆羃肂莃葿螆羈莂薁羁袄莁螃螄芃莀蒃蚇腿莀薅袃肅荿蚈蚅羁莈莇袁袇蒇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒄蒄袇羃蒄薆螀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀膈薃螇袆膇蚅羂膅膆莅螅膁膅薇肁肇膄虿袃羃膃螂蚆芁膂蒁袂膇膂薄蚅肃芁蚆袀罿芀莆蚃袅艿蒈袈芄芈蚀蚁膀芇螃羇肆芆蒂蝿羂芆薅羅袈芅蚇螈膆莄莆羃肂莃葿螆羈莂薁羁袄莁螃螄芃莀蒃蚇腿莀薅袃肅荿蚈蚅羁莈莇袁袇蒇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒄蒄袇羃蒄薆螀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀膈薃螇袆膇蚅羂 42