光系统Ⅱ抑制型除草剂Atrazine诱导小麦幼苗叶绿体蛋白质组变化分析

光系统Ⅱ抑制型除草剂Atrazine诱导小麦幼苗叶绿体蛋白质组变化分析 光系统?抑制型除草剂Atrazine诱导小麦 幼苗叶绿体蛋白质组变化分析 农业环境科学学报2010,29(6):1039—1043 JournalofAgro—EnvironmentScience 光系统?抑制型除草剂Atrazine诱导小麦幼苗 叶绿体蛋白质组变化分析 王振英,李学平,李雪梅,彭永康 (天津师范大学化学与生命科学学院,天津市细胞遗传与分子调控重点实验室,天津300387) 摘要:为了研究除草剂作用机理,用光系统?抑制型除草剂阿特托津(Atrazine)处理小麦幼苗,用2-DE技术和生物质谱方法,分 析了叶绿体蛋白质组的变化.结果发现,在10mg?L浓度处理时,有7个叶绿体蛋白质斑点(斑点1,50kDa/PI8.1;斑点2,4lkDa/ PI8.4;斑点3,41kDa/PI7.6;斑点4,23kDa/PI7.1;斑点5,31kDMPI5.0;斑点6,35kDa/PI8.9;斑点7,14kDa/PI8.1)丢失.对7个发生 变化的斑点利用MALDI—MS方法,于NCBI进行数据查询,其中,有6个叶绿体蛋白质归属得到鉴别,它们是Calvin循环中,同定 CO的RuBPcase的激活酶(2个同T体和1个p型前体),在HO氧化裂解中起重要作用的23kDa氧释放蛋白(psbpprotein),在能 量转中起重要作用的3一磷酸甘油酸激酶和催化HCO;一CO水合作用可逆反应的碳酸酐酶.研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,叶绿体蛋白质组中丢失的 6个蛋白质是Atrazine处理的相关蛋内. 关键词:叶绿体蛋白质组;阿特拉津;MALDI—TOF—MS;光系统11;小麦 中图分类号:X503.231文献标志码:A文章编号:1672—2043(2010)06—1039—05 ChangesintheChloroplastProteomeinResponsetoPS?InhibitingHerbicideAtrazineinWheatSeedlings WANGZhen-ying,LIXue-ping,LIXue—mei,PENGYong-kang (TianjinKeyLabofCyto-geneticalandMolecularRegulalion,CollegeofChemistryandLifeScience,Ti anjinNormalUniversity,Tianjin 300387,China) Abstract:Toinvestigatethemechanismwithwhichtheherbicideworks,chloroplastproteomechanges wereanalyzedinwheatseedlings whichweretreatedwith0.01,0.1.l,10mg?L,Photosystem1IinhibitingherbicideAtrazinerespectively,byusing2-DEtechniques.There, suitsindicatedthat7chloroplastproteinspotsdisappearedtreatedwithhighconcentrationAtrazine(10 mg’L-)inwheatseedlings.Theywere spot1,50kDa/PI8.1;spot2,41kDa/PI8.4;spot3,41kDa/PI7.6;spot4,23kDa/PI7.1;spot5,31kDa/PI5.0 ;spot6,35kDa/PI8.9;spot7, 14kDa/PI8.1.6proteinspots(spot1-spot6)wereidentifiedbyusingMAIDI-TOF—MSanalysisandNC BIgreenplantsdatahase(Viridip1au, tae1searching.Spot1-spot3wererespeetivelyidentifiedas2aetivasesubunitsofRuBPcaseandactivase beta,formprecursor.These3pro— teinswereassociatedwithCO2fixationinplantPS1I.Spot4wasidentifiedas23kDaoxygenevolvingpro teinofPS?,thisproteinwas showedtoregulatePS1IactivitybymodulatingtheCaandC1一requirementofwater-splittingreaction.Spot5was3-phosphoglyeerateki— naseakeyenzymeinthetransferofhigh—energy.Spot6wasidentifiedascarbonicanhydrase,whichisan importantenzymeforcatalyzing thereversionconversionofHCO;一CO,,butspot7couldnotbeidentified,becauseitsteoretica1massandPIdidnotfitwelltheexpermental one.Theresnltsindicatedthatthese6chloroplastproteinspots,whichweredisapperedinseedlings,were associatedAtrazine—treatedpro— teins.ThistechniquemayprovidebetterwaystounderstandingoftheresponsesofwheattoAtrazineatpr oteomeleve1. Keywords:chloroplastproteome;Atrazine;MALDI-TOF—MS;PhotosystemlI;wheat 我国是Atrazine的使用大国,至今每年仍以20% 收稿日期:2009—12一l5 基金项目:天津市科委基金项目(2006ZD08,08JCZDJC16500) 作者简介:王振英(1965,),女,博f,教授,主要研究方向为细胞与分 子生物学.E-mail:wzycell@yahoo.corn.cn 通讯联系人:彭永康E-mail:pykcell@yahoo.(~on1.cn 的需求量增加l】1.Atrazine可以在土壤中长期存在,并 在作物体内累积,造成农业环境污染,作物受害,对食 品安全造成潜在威胁,因此,引起人们的高度重视.如 对Atrazine的环境监测『2_3】,生物降解与除污I,动植 物的毒性影响f叫等.对Atrazine作用机理的研究已有 报道,Atrazine是一种光系统?(PS?)抑制性除草剂, 1040王振英等:光系统?抑制型除草剂Atrazine诱导小麦幼苗叶绿体蛋白质组变化分析2010年6月 它通过与一个位于叶绿体内的分子量为32kDa的 D1蛋白质相结合,阻止PS?中的电子传递,导致叶 绿体分子的破坏,抑制光合作用的正常进行.D1是一 种类囊体膜蛋白,是Atrazine的靶蛋白,Atrazine的除 草作用主要是破坏了D1蛋白质的功能,这是一直被 学术界接受的观点.但除D1以外,植物经Ps?抑制 型除草剂Atrazine处理后,叶绿体蛋白质组中的其他 蛋白质是否也会受到影响?这方面的研究尚未见报 道.近年来,蛋白质分析技术上的突破,特别是蛋白质 组技术的出现,在研究植物的某一个特定组织或在某 一 特殊环境因子的胁迫下植物体内蛋白质组分变化 时,可获得更大量,更全面的实验结果,目前已有很多 研究者利用蛋白质组研究技术,对植物受到盐,低温, H0,疾病等胁迫时,体内蛋白质组的变化进行分析, 获得很多有价值的结果?oI”].小麦是我国主要粮食作 物,并且是Atrazine敏感作物,苗期除草常造成药害. 本研究中,以小麦幼苗为 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ,用不同浓度PS?抑制 型除草剂Atrazine处理小麦,从叶绿体蛋白质组水平 上,对Atrazine的作用机理进行分析,以期获得一些 新的结果,为全面了解Atrazine作用机理,减少药害 提供科学依据. 1材料与方法 1.1材料与培养 栽培小麦(Triticumaestivum)农大189种子经3% HgC1表面消毒5min,再用自来水冲洗2次,在含有 用蒸馏水湿润滤纸的培养皿中,室温下萌发24h,再 在28~C/25?(昼/夜)培养3d,每日光照12h.将3d 龄的幼苗分别放入0.O1,0.1,1和10mg?L阿特拉津 溶液中,处理5,10d. 1.2叶绿体分离和叶绿体蛋白质的制备 叶绿体的分离和叶绿体蛋白质的制备根据 Roscoe等卅的方法.将小麦幼苗叶子置于预冷分离介 质A(0.33tool?L一山梨醇,4mmol?L,MgCI2,2iHmo]? L抗坏血酸,10mmo]?L焦磷酸钠,pH6.5)中匀浆, 4层纱布过滤,200xg4oC下离心7min,上清液放入 干净的离心管,1O00xg4oC下离心7min,沉淀物重 新悬浮于预冷分离介质B(0.33mol?L山梨醇,4 mmo]?L,MgC12,50mmo]?L,HEPES,2mmol?L,ED— TA,pH7.6)中,1O00xg4oC下离心7min,此步骤需重 复3次.将叶绿体重新悬浮于经稀释的分离介质B (1:25)中,8O00xg4oC立即离心5min,除去分离介 质,将叶绿体悬浮于等渗介质B和80%预冷的丙酮 中,一20?温浴1h后,35O00xg离心15min,将沉淀 物冻干,然后将干燥的沉淀物溶解在裂解缓冲液『含9 Hlmol?L脲,4%CHAPS,10mmo]?L—DTT,0.5%两性 电解质(pH3.0,10.0),1mmo|?L,PMSF,2mmo]?L EDTA,20mmo]?L,Tris—HC1(pH8.5)1中,40O00xg离 心30rain.以BSA为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 蛋白质溶液,利用Bradford 的方法测定蛋白质浓度. 1-32-DE电泳和图谱分析 电泳第一向利用IPC胶条(pI-I3.0,10.0,11em), 在BioRad蛋白质分析系统进行2-DE分析,每根胶 条的上样量为60g.分别在250V下1h,500V下 1h,1000V下2h,2000V下2h,4000V下2h进 行等电聚焦.电泳的第二向为12.5%的聚丙烯酰胺凝 胶.2一DE提供的结果均经3次重复.凝胶用考马斯 亮蓝旧染色,凝胶通过GS800色谱扫描取得图像,用 PDQuest软件进行凝胶斑点检测,匹配和差异斑点鉴 别,确定对照和处理组之间有差异的蛋白质斑点,进 行质谱分析. 1.4凝胶消化和MALDI—TOF—MS分析 从制备胶上切下经鉴别有差异的蛋白质斑点,用 超纯水冲洗2次,50mmo]?L,NHHCO3脱色2次, 100%乙腈干燥,用0.1%TFA在50%乙腈溶液37 下消化过夜,将制备物混匀,冻干.将冻干的制备物溶 解在含有0.I%TFA和50%乙腈的5mg?mLCHCA 中,利用ABI4700型(USA)正离子生物质谱仪进行 MALDI—TOF—MS分析,质谱采用胰蛋白酶自动降解 片段作为内部标准校正.通过MASCOT软件,在 NCBInr数据库进行查询.为了表明新鉴别的蛋白质 的可靠性,查询条件为:每个被鉴定的蛋白质其序列 覆盖率至少达15%,最少肽数目为5个,肽质量数误 差范围为?0.1Da,未水解的酶切位点数为1,对照物 种为水稻和拟南芥. 2结果与分析 2.1叶绿体蛋白质组变化 利用等电点为3—10IPG胶条,分别对0.O1,0.1, 1,10mg?LAtrazine处理后小麦幼苗叶绿体蛋白质组 变化进行分析.发现在0.O1,0.1mg?L浓度下,叶绿 体蛋白质组没有产生变化,而在1mg?L浓度下虽有 变化,但不明显,只是个别叶绿体蛋白质斑点的含量 有些减少,而变化最为明显的是在10mg?L浓度下 处理的幼苗.用2DSDS—PAGE分析的结果表明,共 有350余个叶绿体蛋白质斑点被检测到.MW范围在 第29卷第6期农业环境科学学报1041 10,110kDa之间,PI范围4,10.有7个叶绿体蛋白 质产生变化,主要表现为叶绿体蛋白质斑点的消失. 图1是小麦幼苗叶绿体蛋白质组中有变化区域的凝 胶图,处理的幼苗明显可以看到叶绿体蛋白质斑点的 缺失,但没有发现新蛋白质斑点被诱导产生. A对照B处理 一黪蓑i A:control,B:treatment 图1小麦幼苗经10mg?LPSII抑制型除草剂处理后 叶绿体蛋白质组的变化 Figure1Changesinchloroplastproteomeinwheatseedlings treatedwithPSIIinhibitingherbicideAtrazine(10mg?L-) 2.2与Atrazine处理相关叶绿体蛋白质的MS鉴别 在经10mg?LAtrazine处理后叶绿体蛋白质组 中,有7个斑点消失.为了对消失蛋白的生物学功能 及可能与Atrazine处理间存在的关系进行分析,我们 利用MS技术,对这7个消失的叶绿体蛋白质斑点的 归属进行了鉴别,这7个被消失的蛋白分别是:斑点 1,核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶激活酶亚基2;斑点2, 核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶激活酶亚基1;斑点3,核 酮糖一1,5一二磷酸羧化酶激活酶B一亚基前体;斑点 4,23kDa氧进化蛋白(psbpprotein);斑点5,三磷酸甘 油酸激酶;斑点6,碳酸酐酶;斑点7由于MS分析所 得出的匹配率偏低,未能鉴别其归属(表1o 从表1提供的数据看出,6个被鉴别出的蛋白质 斑点肽片段的匹配率高,蛋白质序列覆盖率高,得分 达100,表明该实验结果是可靠的. 3讨论 在前期研究中,我们对三氮苯类除草剂Atrazine 对水稻,白菜染色体结构和蛋白质变化作了分析比 较.水稻中得出的结果表明,在0.001mg?LAtrazine 浓度下,可引起染色体凝聚和微核的形成,而引起蛋 白质变化的浓度为0.1mg?L_I8].Atrazinc对白菜染色 体结构影响不明显,引起蛋白质变化的浓度为10 mg?L-11】.上述实验结果表明,不同作物对Atrazine的 耐药性有很大差异. 小麦是一种对Atrazine敏感的作物,很多研究表 明,在对Atrazine敏感的作物中,Atrazine可以阻断光 合作用Ps?的正常进行,引起叶绿素损伤,叶子枯 萎,作物生长受抑,最后导致死亡.在本研究中,我们 分析了Atrazine处理小麦幼苗后,叶绿体蛋白质组中 有7个蛋白质斑点消失,通过MALDI—TOF—MS分析 和数据库搜寻,它们分别为核酮糖一1,5一二磷酸羧化 酶激酶的两个亚基(ribulose—l,5一bisphosphatecar— boxylaseactivaseisoform),核酮糖一1,5一二磷酸羧化 酶一加氧酶激酶B形式的前体(Rubiscoactivasebeta formprecursor),23kDa的氧进化蛋白(23kDaoxygen evolvingproteinofPS1I),3一磷酸甘油酸激酶(3-phos— phoglyceratekinase)和叶绿体前体中的碳酸酐酶 (Carbonicanhydrase,chloroplastprecursor). 在Calvin循环中,CO:可以被酶催化转变为还原 性的化合物.核酮糖一1,5一二磷酸(简称RuBP)是COz 固定中的CO受体.核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶(简 表110mg?L..阿特拉津处理10dNdx麦幼苗叶绿体蛋白质差异蛋白质的质谱鉴定 Table1Identificationof2-DseparatedproteinspotsfromwheatchloroplastfollowingtreatmentwithAtr azine(10mg.L)f0r10days , 1042王振英等:光系统?抑制型除草剂Atrazine诱导小麦幼苗叶绿体蛋白质组变化分析 2010年6月 称为Rubisco)可以催化CO与RuBP加成.Rubisco 存在于叶绿体的基质中,它是一个很丰富的酶,约占 总叶绿体蛋白质的50%.在高等植物中它是一个杂 多聚体,分子量为540kDa,由8个相同的大亚基和8 个小亚基组成.大亚基是酶的催化单位,它能结合底 物(CO和RuBP)以及Mgn;小亚基是调节酶活性的 单位,能使催化速度常数增加100倍以上.Rubisco的 大亚基是由叶绿体DNA的一个基因编码的,而小亚 基是由核DNA的一个多基因家族编码的.Rubisco以 3种形式存在:一是无活性形式,称E型;二是氨甲酰 化的无活性形式,称EC型;三是活性形式,氨甲酰化 并在活性部位有Mg,称ECM型.底物RuBP与E型 Rubisco的结合比与ECM型的结合更牢固,因此 RuBP是Rubisco活性的强抑制剂.从Rubisco的活性 部位除去RuBP是由Rubisco激活酶介导的,Rubisco 激活酶是一个调节蛋白,它能与E型Rubisco结合, 在消耗ATP的反应中促进RuBP的释放.然后,游离 的Rubisco经氨甲酰化和Mg的结合变成活性形式. 小麦在经过阿特拉津处理后,有两个Rubisco激酶的 亚基和一个Rubisco的前体与对照相比消失了,这会 造成Rubisco的活性受到抑制,从而使CO:和RuBP 的合成反应速率减慢或受到抑制,影响了小麦Calvin 循环中有机化合物的合成. 在光合作用研究中,光合放氧一直是一个最基 础,最焦点的课题,它是一个光合生物将低氧化性的 水转变为高氧化性的氧气的过程,放氧是发生在PS ?中的一个重要化学反应.在PS?中,一个完整的具 有光合放氧功能的放氧颗粒包括D1,D2,Cytb559, CP43,CP47,33kDa,23kDa,17kDa等20多种蛋白 质.33kDa,23kDa,17kDa是突出于基粒片层膜外的 3个水溶性外周蛋白,它们结合于类囊体囊腔侧,对 维持锰簇的稳定及正常的放氧功能起很重要的作用. 由于位置上突出的特殊性,它们成为光合结构中对理 化处理特别敏感的部位,也容易受环境胁迫的影响. 现在已经知道,阿特拉津的作用机理是取代质体醌与 叶绿体类囊体膜上的32kDa蛋白结合,从而阻断光 系统?的电子传递而使光合作用受阻.在本研究中, 我们没有检测到32kDa蛋白的变化,而是发现23 kDa的蛋白质消失了.17kDa和23kDa蛋白的去除 也会引起放氧功能的部分消失,这主要是因为它们的 脱落会引起ca和Cl一的游离,研究发现缺失23kDa 蛋白会使Cl-X~锰簇的亲和力减小而对光抑制非常敏 感.由此可见,阿特拉津对小麦的处理对光合放氧也 产生了一些影响.这一结果与已有研究一致. Calvin循环中,在Rubisco羧化酶作用下CO和 RuBP缩合生成不稳定的中间物,然后裂解成2分子 3一磷酸甘油酸,基质的3一磷酸甘油酸激酶催化磷酸 基从ATP转移到3一磷酸甘油酸,生成1,3一二磷酸甘 油酸.在甘油醛一3一磷酸脱氢酶催化的反应中 NADPH提供电子,生成甘油醛一3一磷酸.丙糖磷酸异 构酶催化甘油醛一3一磷酸与二羟丙酮磷酸互变.丙糖 磷酸在叶绿体中可以转化为淀粉或立即外运到细胞 质转变为蔗糖以便运送到植物的生长区域,为生长提 供能量.3一磷酸甘油酸激酶的消失使磷酸基不能转 移,从而也抑制了淀粉或蔗糖等碳水化合物的合成. 碳酸酐酶是锌金属酶,它可以催化CO水合作用 的可逆反应.在植物叶绿体中,碳酸酐酶对无机碳的 固定起着非常重要的作用.阿特拉津对小麦的处理 影响CO:的固定. 由以上结果可以看出,小麦在10mg?LAtrazine 处理10d后,叶绿体蛋白质组中涉及到光合作用的 多个蛋白质组分消失,可以认为这些蛋白质的消失, 影响了植物正常的光合作用,使植物生长受抑. 虽然以前的研究表明[21-23】,Atrazine是Ps?抑制 型除草剂,它主要抑制叶绿体蛋白质组中的D1蛋白 质,而阻断PS?的正常进行,Dl是唯一的Atrazine结 合蛋白.我们的研究则表明,Atrazine处理小麦幼苗 后,有7个叶绿体蛋白质消失,表明这7个蛋白质是 与Atrazine的处理相关的,虽然其确切的作用机理有 待进一步研究,但本项研究加强了对Atrazine作用机 理的了解,为减少Atrazine对作物的伤害和农业上安 全,合理使用除草剂提供了参考依据. 4结论 用10mg?LAtrazine浓度处理小麦幼苗后,有7 个叶绿体蛋白质斑点(斑点1,50kDa/PI8.1;斑点 2,41kDa/PI8.4;斑点3,41kDa/PI7.6;斑点4,23kDa/ PI7.1;斑点5,31kDa/PI5.0;斑点6,35kDa/PI8.9;斑 点7,14kDa/PI8.1)丢失.它们是calvin循环中,固定 CO:的RuBPease的激活酶(2个同工体和1个B型 前体),在H:O氧化裂解中起重要作用的23kDa氧释 放蛋白(psbpprotein),在能量转贮中起重要作用的 3一磷酸甘油酸激酶和催化HCO3一CO水合作用可逆 反应的碳酸酐酶.6个叶绿体蛋白质是阿特拉津处理 的相关蛋白,蛋白质组分析技术可用于Atrazine作用 分子机理研究. 第29卷第6期农业环境科学学报1043 参考文献 [1]李清波,黄阚宏,王颜红,等.阿特拉津生态风险及其检测和修复技 术研究进展【JJ_应用生态学报,2002,13(5):625—628. 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