pSC101-pMB1质粒双复制子质粒的构建

pSC101-pMB1质粒双复制子质粒的构建 pSC101-pMB1质粒双复制子质粒的构建 江西医学院2009年第49卷第8期ActaAcademiaeMedidnaeJiangxl2009Voi49,— No — 8?31' pSC101一pMB1质粒双复制子质粒的构建 莫冰,余克花 (南昌大学a.基础医学院微生物学教研室;b.医学实验教学部,南昌330006) 摘要:目的构建带有pSCIOl和pMB1复制子的质粒.方法将pSCIO1,pUC19(pMB1型复制子)分别用Eco— RI限制性内切酶消化后,DNA连接酶连接.车睾化大肠杆菌DH5a,筛选重组子,提取质粒电泳分析;氯霉素培养条 件下提取双复制子质粒及其检测OD.值,并将双复制子质粒转化ploA一大肠杆菌.结果阳性重组子带有1个 u.9kb质粒,该质粒带有氨苄青霉素和四环素耐药基因的质粒,氯霉素培养条件下双复制子质粒的提取物ODso 值增加,并能转化ploA一大肠杆菌.结论构建的质粒带有pSCIO1和pMB12类复制子. 关键词:质粒;复制子;构建 中图分类号:R378.2l文献标识码:A文章编号:1000--2294(2009)08--0031--02 质粒是染色体以外的遗传物质,它不是细菌必 需要的,但质粒能赋予细菌一些新的生物学性状,如 毒力,耐药性等.野生型质粒一般是单复制子,不同 的质粒有不同类型的复制子,本文通过构建携带2 种不同复制子的质粒研究复制子的特点. l材料和方法 1.1材料 一 步法感受态细菌制备试剂盒,质粒抽提试剂 盒均由碧云天生物技术研究所提供,T4DNA连接 酶和EcoRI限制性内切酶(北京柏莱斯特科技发展 有限公司),pUC19质粒(上海钰森生物技术有限公 司),大肠杆菌菌株AS1.1137(含pSC101,中国普 通微生物菌种保藏管理中心),ploA-大肠杆菌(ATCC 25947,北京中原公司),LB培养基(Luria-Bertani培养 基,胰蛋白胨10g/I,酵母提取物5g/L,氯化钠 10g/L),盐酸四环素(四川制药股份有限公司,批 号:071019),氨苄青霉素(哈尔滨制药二厂生产,批 号:070829),SPX一150B-Z生化培养箱(上海博迅实 业有限公司医疗设备厂),752紫外光栅分光光度计 (上海分析仪器厂). 1.2双复制子质粒的构建 使用质粒抽提试剂盒提取大肠杆菌菌株AS 1.1137中的pSC101质粒.将pSCIO1,pUC19质粒 分别用EeoRI限制性内切酶消化,酶切体系如下: pSC1015I,10×buffer5L,EcoRI3L,补水 至5OL;pUC195肛L,10×buffer5肚I,EcoRI 3L,补水至50I,分别于37?反应3.5h.反应 完毕后,分别用质粒抽提试剂盒提取酶切后的质粒. 收稿日期:2009—04—15 质粒连接:2种酶切后质粒各2I,2×T4DNA连 接酶1O}lL,buffer6L,16C12h.用一步法感受 态细菌制备试剂盒制备感受态大肠杆菌DH5,将连 接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞,转化菌铺 在有氨苄青霉素和四环素的IB平板上,生化培养 箱37?培养过夜.挑取阳性转化子,提取质粒, Ec0RI限制性内切酶酶切电泳分析.双复制子质 粒构建示意图见图1. 图l双复制f庾粒构建不意图 1.3氯霉素培养条件下双复制子质粒的提取及 OD:?值的检测 将阳性转化菌接种到A,B2管IB培养基中, A管在生化培养箱37?培养16h;B管在生化培养 箱37?培养8h后,在LB培养基中加入氯霉索(终 浓度170mg/I),生化培养箱37?培养8h.收集2 ? 32?江西医学院2009年第49卷第8期 ActaAcademiaeMedicinaeJianRxi2009,Vol49,N08 管细菌,细菌浓度调到OD6000.8.用质粒抽提试 剂盒提取A,B2管l祷的质粒,使用紫外光栅分光光 度计测2管菌质粒的0D..值. 1.4双复制子质粒转化pioA-大肠杆菌 用一步法感受态细菌制备试剂盒制备感受态 ploA一大肠杆菌,用质粒抽提试剂盒提取双复制子质 粒,转化ploA一大肠杆菌后,接种于含氨苄青霉素和 四环素的LB培养基筛选. 2结果 2.1双复制子质粒构建的情况 LB平板上分离出对氨苄青霉素和四环素2种 抗生素阳性转化子,?阳性转化子琼脂糖电泳分析 只有1个11.9kb质粒,该质粒经EcoRI限制性内 切酶酶切成9.26,2.69kb2个片段(图2),这与图1 双复制子质粒构建示意图相符.?pSC101质粒带 有四环素耐药基因,pUC19质粒带有氨苄青霉素耐 药基因,阳性转化子的质粒携带氨苄青霉素和四环 素2种抗生素耐药基因,是pSC101和pUC19两质 粒的重组子.pSC101和pUC19两质粒都只有1个 EcoRI限制性内切酶位点,该酶切位点不在两复制 子处,阳性转化子的质粒是带有pSC101和pMB12 类复制子的质粒. 2322bp 2027bp 1:双复制子质粒;2:双复制子庾粒经 }M:xDNA/Hind?Marker EcoRI酶切 图2双嗄制子质粒酶切电泳图 2.2在氯霉素的培养条件下质粒的拷贝数的变化 情况 A管OD260值0.21,B管OD260值0.38.在 氯霉素的作用下,双复制子质粒的拷贝数增加. 2.3双复制子质粒转化ploA-大肠杆菌情况 双复制子质粒转化的ploA一大肠杆菌,并能在 含氨'霉素和四环素的LB培养基筛选出阳性转 化子,显示双复制子质粒能在ploA一大肠杆菌中复 制. 3讨论 质粒是细菌染色体外的遗传物质,是存在于细 胞质中的环状闭合的dsDNA,质粒具有复制子,有 自我复制的能力.自然界存在的野生质粒一般只含 有1个复制子.质粒复制子的类型决定了质粒的复 制调控方式和质粒的拷贝数,当2种质粒的复制子 类型相同或相近时,它们不相容,不能共存于一个宿 主菌中,2种质粒只有当它们复制子的类型不同时 才能共存于一个宿主菌中.pSC101和pMB1是2 种不同类型的质粒,这2种类型的质粒之间是相容 的,可以共存于同一宿主菌中.本研究将这2种类 型的质粒构建到一个质粒上,该质粒在氯霉素的条 件下质粒的拷贝数明显增加,在氯霉素的作用下质 粒拷贝数增加是pMB1复制子的特点[1],pSC101复 制子没有这个特点,这说明双复制子质粒中的 pMB1复制子是有生物活性的.双复制子质粒转化 的ploA-大肠杆菌,并能在含氨苄青霉素和四环素 的LB培养基筛选出阳性转化子,显示双复制子质 粒能在ploA一大肠杆菌中复制,pSC101复制子能在 ploA一大肠杆菌中复制[2],而pMB1复制子不能,这 说明双复制子质粒中的pSC101复制子是有生物活 性的.同时说明质粒上的pSC101和pMB12种质 粒复制子都有生物活性.双复制子质粒的构建将对 进一步研究复制子复制和调控机制提供依据,也能 扩展宿主菌的使用范围. 参考文献: [1]萨姆布鲁克J,拉塞尔Dw.分子克隆实验指南EM].黄培堂, 译.3版.北京;科学出版社,2002:118—120. [2]CampsM.NaukkarinenJ,JohnsonBP,eta1.TargetedGeneE— volutioninEseherichiaEoliUsingaHighlyError-proneDNA PolymeraseI[J].ProcNatlAcadSci,2003,100(17);9727— 9732. (责任编辑:胡炜华) b卵 三善蛳 2964