醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用

醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用 醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的 应用 囝开发应用2009.vo1.26No.11亿亏与生物Z军呈Chemistry&BiOengineering 醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用 李凌凌,吕早生,吴敏..袁向利.关海燕,张敏 (1.武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北武汉430O81; 2.西部矿业股份有限公司国家级企业技术中心,青海西宁81O0O1) 摘要:醛酮还原酶是氧化还原酶家族成员之一,能对很多羰基底物进行氧化还原.综述了醛酮还原酶家族的命 名,结构,保守氨基酸序列,催化机制,结合辅酶方式和结合底物的特异性;阐述了醛酮还原酶生理作用的研究方法;介绍 了醛酮还原酶在手性醇合成方面的应用. 关键词:醛酮还原酶家族;辅酶;底物特异性;手性醇;不对称合成 中图分类号:Q554.2文献标识码:A文章编号:1672—5425(2OO9)11一OO62一O6 醛酮还原酶(AKR)是氧化还原酶超家族成员之 一 ,在生物界中广泛存在,能对很多羧基底物进行氧化 还原,特别是对生物体而言是很强突变剂的醛或酮中 间产物_1].醛酮还原酶通常都是单体,约含32O个氨 基酸残基,大小约为35kDa,其底物谱很广,包括脂肪 族和芳香族的醛基,酮基,单糖,类固醇,前列腺素等. 目前有三种已知的酶显示出了典型的醛酮还原酶 家族特性:第一种是醛还原酶(A1dehydereductase, EC1.1.1.2),能催化各种醛基的还原,如糖醛酸;第二 种是醛糖还原酶(Aldosereductase,EC1.1.1.21),能 催化乙醇醛和多羟基醛等的还原,但对糖醛酸中醛基 的还原活性较弱;第三种是羰基还原酶(Carbonylre— ductase,EC1.1.1.184),能催化醌,酮基及醛基还原成 相应的醇. 2醛酮还原酶的家族成员 AKR超家族目前已经分成了15个家族(AKR1 , AKR15),约有150个家族成员,还有约13O个未列 人家族中的还未确定功能的蛋白质,它们也很有可能 具有醛酮还原酶活性.这种最初由Jez提出的分类方 式是根据蛋白质序列分类的[3]. AKR家族成员间的氨基酸相似度低于4O,而 每个家族内部成员间的相似度却远远大于60.当 蛋白质具有大于97的氨基酸一致性时,被认为是一 类,除非它们具有不同的酶活性或不同的3非翻译区 (UTR),或者具有不同的基因结构和/或染色体定 位_2].在15个家族中,最大的家族是AKR1,其家族 成员有醛糖还原酶,醛还原酶,羟基类固醇脱氢酶等. 1醛酮还原酶的命名3醛酮还原酶的结构 醛酮还原酶的命名方式为:词头"AKR"代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 醛酮 还原酶,其后的阿拉伯数字代表其所属的家族,接着的 字母代表亚家族,最后的阿拉伯数字代表其独特的蛋 白质序列L2].例如:蛋白质AKR7A1是指醛酮还原酶 第七个家族的亚家族A,其编码基因为A_KR7A1.对 于多聚体的醛酮还原酶,则根据其组成成分的比例来 命名,如:AKR7A1一AKR7A4(1:3)指的是一个四聚 体,其组成为1分子的AKR7A1和3分子的 AKR7A4 AKR家族成员的催化中心为I)_Y—K_H,且以 折叠的羧基端与辅酶结合,这与短链脱氢酶不同,后者 是通过Rossmann折叠区域和NAD(P)(H)结合]. AKR家族成员都具有相同的三维结构:(a/).桶 状折叠(以大麦醛糖还原酶即AKR4C1的结构为例, 见图1a),结构中具有8个平行的折叠,每个折叠 都和一个一螺旋交替,一螺旋和折叠呈反向平行,且 折叠的羧基端是通过一些可变长度的环与a一螺旋的 氨基端结合,这些环形成了活性中心,实际上,参与底 划资助项目(2OO8cB617611),武汉科技大学校基金资助项目基金项目:国家973计 (2OO6xY14) 收稿日期:2OO9一O8—2O 作者简介:李凌凌(1981一),女,安徽铜陵人,硕士研究生,讲师,研究方向:生物浸矿和 生物催化.E—mail:moonl既一smile@yah0o COm.Cn. 李凌凌等:醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用/2O09年舞儿期 物结合和催化作用的残基主要在三个环——A,,和 c一环上(图1b)并根据它们在一级结构上的位置命名, A,环位于残基124,142,B_环位于残基219,225,C一 环位于残基292,32O,均在桶状结构的羧基端,非常 柔软,从而使得酶能适应不同大小形状的底物,并控制 催化等分子事件【_5].AKR家族成员中这三个环的长 度和氨基酸序列均不同.此外,AKR结构中的发夹结 构(B1+B2)封锁了桶状结构的一端[而NAD(P)H的 结合位点位于另一端]],该结构具有高度保守的辅酶 结合"口袋",并有两个辅助的a一螺旋H和H,其中 a一螺旋H定在辅酶结合环的一端,负责连接第7个 折叠和第7个口-螺旋,而旷螺旋H.则锚定在羧基端 环的第8个旷螺旋之后. (b) 图1AKRf大麦醛糖还原酶)的三维结构[6 Fig.1Ac0mm0nthree-dimensiOnaIstructure ofAKR(日ordellmfg口,Paldosereductase) 3.1AKR家族成员中的保守氨基酸 醛酮还原酶家族的序列比对结果显示含有三个保 守序列:N端为LxxxGxxxPxxGxG(x代表可变氨基 酸),活性中心为GxxxDxAxxY(其中含有保守的Asp 和Tyr),还有一个保守区域为LxxxxxxxxxDxxxxH (含有保守的His). 所有AKR家族成员的一级结构中,有11个位点 的氨基酸是严格的保守]:Gly22,Gly45,Asp50, Lys84,Asp112,Pro119,Gly164,Asn167,Pro186, G1n19O和Ser271(这里的数字根据3口一羟基类固醇脱 氢酶即AKR1C9的蛋白质残基顺序编号).另外,有 41个家族成员在额外的8个位点的氨基酸是保守的: Gly2O,Tyr55,Gly62,Leu113,Trp148,Gly158, G】u192,Arg276.其中Asp5O,Asn167,Gln19O, Ser271和Arg276是与辅酶结合的位点;Asp5O, Tyr55,Lys84,His117是催化中心.而额外的保守氨 基酸用以维持三维结构. 醛酮还原酶中最主要的变化区域在C端区域,这 对于保证酶的底物特异性非常重要L7]. 3.2醛酮还原酶的催化机制 图 醛酮还原酶的活性中心通常由酪氨酸Tyr,组氨 酸His,天冬氨酸Asp和赖氨酸Lys这4个氨基酸组 成,但也有例外,如在人类固醇5还原酶即AKRlD1 中His替换为GluL8],而在调控电压门控钾离子通道 的AKR6A3,AKR6A5,AKR6A9中,Asn替换了 Hisl9].在催化中心的4个氨基酸残基中,Tyr是质子 的供体,赖氨酸与天冬氨酸残基的羧基形成盐桥,并与 酪氨酸羟基形成氢键,这样形成的氢键/盐桥可降低 Tyr的pKa值,促进质子转移.His117因其周围的疏 水环境,能降低咪唑侧链的pKa值,使其在生理pH 值下较难作为质子供体.Asp的侧链与辅酶的核糖羟 基形成氢键,该残基对于催化过程并不是必要的.水 分子结合在Tyr55,His117和与酶结合的NADP分 子之间,这样有利于羰基底物的定位.Tyr55,Hisl17 及烟酰胺环形成一个氧阴离子洞L7].在AKR1D1中, 替换His的E12O主要有两种作用[8]:一是使得类固 醇结构复合体均可以插人到活性中心狭洞中,而不至 于被His的眯唑侧链所阻碍,这样反应可以在NAD— PH的4一pr0一R氢阴离子(AKR上转移的氢阴离子的 立体化学结构为4一pr0一R,因此,又称为4一pro—R氢阴 离子_8])和类固醇的C.位置之间发生;二是E12O与 类固醇的c.酮基产生氢键,且侧链处于反式构象的 E120产生了"酸性"的氧阴离子洞,能使类固醇的C. 烯醇化并促进氢阴离子的转移l_8],如图2所示. 图2类固醇5还原酶的催化机制 Fig'2Catalyticmechanismofsteroid-5reductase AKR催化的酶促反应过程为:辅酶NAD(P)H 先结合到AKR上,接着底物再结合到AKR上,通过 一 种"推一拉"机制进行转化反应,待反应结束后,先释 放产物,再释放出氧化态的辅酶.这也许是因为与 NADPH结合,酶的构型才会发生改变,才可以进一步 与底物结合,整个过程中辅酶最先结合到酶,最后从酶 圈凌凌等:醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用/2009年一11期 上释放下来,属于"Orderedbi'bi机制"[.AKR催化 的还原反应为两步[1..(图2):首先将4一pro—R氢阴离 子(即带一对电子的质子)从NAD(P)H上转移到底 物羰基上;然后,质子从酶上的Tyr转移到氧阴离子 中间体,Tyr和Lys之问形成的氢键促进该转移过程, His分子可能参与了质子的转移过程,或者与氧阴离 子形成氢键,从而稳定了该中间体[6]. 3.3醛酮还原酶结合辅酶的方式 大多数的醛酮还原酶都以NADPH作为辅酶,某 些酵母木糖还原酶既能以NADH,也能以NADPH作 为辅酶_1.以C口口把s木糖还原酶(CtXR)为 例,其X一衍射结果说明CtXR会针对辅酶含有或不含 有2,_磷酸基团两种情况,诱导出两种不同的酶构型. 研究也表明:野生型CtXR虽然可以NADH作为辅 酶,但是更倾向与NADPH结合.而构建的ctxR突 变体(K274突变成R,N276突变成D),与野生型 CtXR相比,对于NADH的亲和力要比NADPH高5 倍.另外,Pi如i口s,is的NAD(P)H依赖的I)-木 糖还原酶的结构中,与NAD(H),NADP(H)的结合位 点,均是由16个氨基酸形成的亲水性结合口袋,该口 袋与NAD(H)结合时,G1u223和Phe236与辅酶形成 的氢键起到至关重要的作用.而与NADP(H)结合 时,Lys21和Phe236与辅酶形成的氢键起到作用Il. AKR家族中的成员与辅酶NAD(P)H的结合方 式几乎一致,都在延伸状态的桶状结构的羧基端.其 中NAD(P)H的烟酰胺环结合在桶状结构的中心,焦 磷酸横跨酶裂口的两端(在7和8折叠之间),而腺 嘌呤单磷酸部分则结合于螺旋a一7,a一8和B-环之间. 其中一小部分B-环在辅酶结合后会发生构象变化,将 NADPH的焦磷酸部分锁定在正确的位置,这是整个 反应的限速步骤,对于辅酶的结合和反应最后辅酶的 释放都至关重要.此外,烟酰胺环与Tyr216接触,使 得辅酶能面向活性中心,以保持从4一pro—R面进行氢 阴离子转移.在此方向上,烟酰胺环在核糖的反方向, 而保持这个方向需要Ser166,Asn167和Gln190与辅 酶的酰胺基团形成氢键.Asp5O和Thr24与NADPH 中的核糖相互作用,而焦磷酸骨架与B一环的Leu219 和Ser221之间形成氢键.最终,腺嘌呤2『_单磷酸通 过Arg270,Ser271,Phe272,Arg276,Glu279和 Asn280与酶之间产生广泛的氢键和离子键(以3a一羟 基类固醇脱氢酶为例,见图3)]. 连接第一个折叠和第一个a一螺旋的环(称为一 a一环,位于残基33,36),为较大的柔软的辅酶结合 环,又称之为"安全带".在所有AKR家族中,一 图3AKR《3羟基类固醇脱氢酶)结合辅酶方式 Fig.3SchematicOfNADP+bindingintheAKRs 环均参与了结合辅酶NADPH,并在辅酶结合后跨越 其上,以确保形成NADPH/NADP核苷酸底物.在 AKR结构中,一环的构型变化较大,该结构变化对 于确保辅酶的释放是必须的,且被认为是整个反应的 限速步骤.但其氨基酸序列并非保守[6].如兔2Oa一羟 基类固醇脱氢酶(AKR1C5)的辅酶结合口袋中 His222和Lys270残基侧链形成盐桥,覆盖在辅酶中 心的磷酸链上,即安全带_5].又如大麦醛糖还原酶中, Arg33的N原子和Glu221及Ser219侧链上的.原 子之间形成氢键,产生"安全带"(图4),另外,Ser219 的侧链,Trp32的N原子和辅酶直接作用.而细菌的 2,5一二酮基一I)-葡萄糖酸还原酶A和Gcy1p均缺少这 个安全带,导致对NADPH的结合情况有所变化[6, 特别是Gcy1p对NADPH的亲和力较其它醛酮还原 酶要低很多l_1. 图4大麦醛糖还原酶结构中的安全带 Fig.4Thesafetybelt0f日DrdHm?fg口,ald0sereductase 另外,如果被消耗的NADPH不能很快再次被还 原,NADP会抑制酶的活性.这是由于醛酮还原酶催 李凌凌等:醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用/20O9年一l1啊 化羰基还原反应过程中形成了两个不带电荷的复合 体,一个是酶一Tyr_oH:底物羰基:NADPH,另一个 是酶一Tyr一0一:产物醇:NADP,但NADP过多时, 会形成带正电荷的酶一Tyr—oH:NADP复合物,使得 不带电荷的底物不容易进入活性中心_1. 3.4醛酮还原酶结合底物的方式 醛酮还原酶的结构中,底物结合位点类似于一个 裂缝,包含有三个部分(以3a一羟基类固醇脱氢酶为 例):氧阴离子结合位点(Tyr55,Hisl17和烟酰胺环的 部分);在活性中心位点边缘的残基(Ala52,Leu54, Trp86和Phe118);来自于三个环的氨基酸形成裂缝 的边缘.首先A一环(Met12O,Phe128和Phe129)形成 非极性的裂缝的一边,B一环(T叩227)和羧基端的环 (Asn3O6,Ala308以及Tyr31O)形成另一边].底物 结合口袋中有些部分是保守的,如活性中心的Tyr和 His,活性中心附近的Ala52和Trp86,有些则是可变 的. 醛酮还原酶家族的底物特异性较为广泛,包括醛 糖的醛基,脂肪族和芳香族的醛基,脂肪族和芳香族的 酮基.其活性中心边缘的残基会根据不同大小的底物 调整结合位点的拓扑结构,以区别这些底物分子.不 同AKR的桶状结构羧基端的三个环的组成和大小也 有所区别,说明它们决定着底物特异性.这些环还决 定了HSD还原反应的位置特异性和立体结构特异 性.譬如:在鼠肝3a—HSD中,类固醇的a一面定位朝向 A一环,使得类固醇的C.羰基结合在活性中心;在17 HSD中,类固醇从反向结合,其面定位朝向A一环, 使得类固醇的C位朝向活性中心;而2Oa—HSD中类 固醇底物只能从反向结合.这些底物结合模式的不同 决定于这些酶中A一环的不同.3a—HSD中A一环上的 Phe128和Phe129,在17HSD中被分别替换成了 Tyr和Leu,而在2Oa—HSD中被替换成了两个Leu. 这些发生变化的残基均保留了结合位点的非极性特 征,但同时也产生了类固醇特异性的范德华力作用,从 而产生位置和立体特异性的反应.当然,在非极性裂 缝另一头的B-环和C_环,在不同的HSD中也存在特 异性. 另外,羧基端的环也能区别糖和类固醇,并确定类 固醇特异性.在ADR的环中残基306,3O8和310是 高度保守,为Cys—Leu—Ser;在哺乳动物醛还原酶中,这 些残基都变为Ile—Pro—Leu/Ile;在植物的ALR中这些 残基又变化为Leu—G1y—Glu.醛糖还原酶和醛还原酶 在3O6残基上发生的突变,会影响其对许多底物的催 化效率. 4醛酮还原酶的生理作用 固 大多数醛酮还原酶的生理作用还不清楚,目前主 要采用以下方法来确定醛酮还原酶的生理作用:(1)建 立酶基因的缺失突变体.如将酿酒酵母的1个或2个 AKR基因打断,菌株仍显示正常表型,但将至少3个 AKR基因打断,就会出现热休克表型,并且在缺乏纤 维醇的培养基上生长缓慢,由此表明AKR基因的打 断会导致氧化压力标记的提高和纤维醇营养缺陷[1. 在酿酒酵母中,敲除ARA1(现命名为AKR3C)基因 后,菌株没有检测到I)-型树胶醛糖脱氢酶活性及其对 应产物,由此推测此基因编码的就是I)I阿拉伯糖脱氢 酶[1.;同法推断酿酒酵母中yPR1(现命名为 AKR3A2)具有2一甲基丁醛还原酶活性Ll.(2)过量 ? 表达酶的基因.如在酵母细胞中Gre3P的过量表达, 能使细胞对甲基乙二醛的耐受性提高[1;在大肠杆菌 中异源过量表达AKR14A1,能使细胞免受二羰基的 毒害,说明这个酶可能在菌体内参与了二羰基这种化 合物的解毒代谢_l.(3)从调节方式上推测酶的功 能.如酿酒酵母(Sncc^r0mcP5c8rPnP)中的 GRE3基因(现命名为AKR2B6)是由渗透压诱导产生 的l2,GRE3的mRNA在具有过氧化氢和离子压力 (如LiC1)的条件下,在两阶段生长漂移点被诱导出 来,说明醛酮还原酶在代谢调节和对环境中压力应答 方面有很大的作用.(4)在生物合成的基因簇中与其 它基因的共调节共表达,如红霉素和泰乐菌素合成过 程中的糖基化过程.糖多孢红霉菌(S口f口r00zs一 0r口err口Pn)中PrB?基因编码的氧化还原酶(现 命名为AKR12B)是红霉素合成基因簇中的一部分, 此基因缺失的突变体会积累NDP一4一酮基一6一脱氧一I)_葡 萄糖这种代谢中间产物, 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 此基因在基因簇中所处 的位置,可推测其作用是还原NDP一4一酮基一6一脱氧一I)I 葡萄糖成相应的L型产物.(5)加入酶的抑制剂.如 在过量表达AKR1C3的内皮细胞中加入酶抑制剂吲 哚美辛等预处理后,再加入9,10一菲醌,可以抑制因9, 10一菲醌诱导的还原型谷胱甘肽水平降低.这显示 AKR1C3是在人类的主动脉内皮细胞中9,10一菲醌诱 导产生细胞毒性的起始阶段的重要酶_2. 5醛酮还原酶在不对称合成手性醇方面的应 用 5.1醛酮还原酶在羰基不对称还原方面的应用 醛酮还原酶可应用于羰基不对称还原.例如, 醛酮还原酶可催化4一氯一3一羰基乙酸乙酯(Ethyl4一 圈凌凌等:醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用/20O9年一11囊 chloro一3一oxobutanoate,CoBE)不对称还原成(R)一或 (S)一4一氯一3一羟基丁酸乙酯(Ethyl4一chloro一3一hydroxy— butanoate,CHBE).而(R)一或(S)一CHBE可用于合成 L-肉碱,HMCOA还原酶抑制剂等,是有机合成中 重要的中间体.从许多微生物中分离到的醛酮还原酶 都具有还原CoBE的活性,且都有较高的ee值.以掷 孢酵母(S0r060z0cPss口Zm0?Z0r)AKU4429为 例[2.,从中分离出了三类醛还原酶(ARI,AR?和 AR?).ARI是组成型表达蛋白,占细胞总蛋白重的 4.5,AR?和AR?在细胞中的含量不到ARI的 1.ARI现已实际应用于(R)一CHBE的不对称合 成.丙酮抽提的AR工与葡萄糖脱氢酶(Glucosede— hydrogenase,GDH)在水相中不对称合成(R)一CHBE, 产率为80,ee值为84.AR?可将CAAE还原成 (S)一CHBE,ee值为93,还可还原脂肪族和芳香族 醛,但不能以醛糖作为底物;AR?不对称还原形成的 产物是(R)一CHBE,ee值只有38. 5.2醛酮还原酶在口一羰基不对称还原方面的应用 醛酮还原酶也可应用于a一羰基的不对称合成. [2]和Yamaguchi等[2]从嗜热放线菌 Ishihara等 (SrP,0,cP,Pr0c口P00Z口cPs)IFO14271中 相继分离出三种a一酮酯酶STKER一工,STKER一?, STKER_?.STKER一工酶可专一地催化脂肪族和芳 香族a一酮酯,生成的产物都是(S)一醇,ee值都超过了 99,该酶具有高度的稳定性,在有机溶剂和表面活性 剂中也比较稳定.STKER一?酶的最适pH值为7.0 , 10.O,STKER一?的最适pH值为5.5,9.O.这三 种酶都可以还原3一甲基一2一羟基丁酸乙酯(Ethyl3一 methyl一2一oxobutanoate),STKER—I酶的还原产物为 (S)一醇,而STKER_?和STKER一?酶还原生成的是 (R)一醇,ee值都较高.sTKER一?酶对体积大的底物 的还原均具有高度的立体选择性,而STKER一?酶仅 对3一甲基一2一羟基丁酸乙酯有较高的立体选择性,而对 其它底物立体选择性较低.研究还发现,反应温度对 产物的立体化学性影响较大,如催化3一甲基一2一羟基丁 酸乙酯时,37?时产生(R)一醇,6O?时产生(S)一醇. 5.3异源表达的醛酮还原酶在不对称合成手性醇方 面的应用 随着基因工程技术的发展,国内外一些学者纷纷 尝试构建基因工程菌来异源表达AKR,并应用于不对 称合成手性醇.譬如:异源表达青霉菌(Pc" c如r删m)IFO4631[2]中的一种酮酯还原酶(命名为 AKR3E1)的重组大肠杆菌,可在水相/乙酸丁酯两相 体系中,还原4一溴一3一羰基甲基丁酸(Methyl4.bro— mide一3一oxobutyrate,BAM)生成合成HMG—COA还 原酶抑制剂的重要中间体(S)一4一溴一3一羟基甲基丁酸 lMethyl(S)一4一bromo一3一hydroxybutyrate,(S)一BH— BM],其在有机溶剂中的产率可达277mmo1.L_.,即 54mg?mL_.,而ee值为97.9.Kataoka等[.]通 过克隆来自掷孢酵母的醛还原酶基因而构建重组菌, 用于还原4一氯乙酰乙酸乙酯,在水/有机两相中还原 生成(R)一CHBE,ee值为91.7.Itoh等[26]在大肠杆 菌中异源表达AKR3E1,研究了这个重组的大肠杆菌 对BAM,COBE的不对称还原能力,发现在单一相系 统和水/有机两相系统中,不对称还原BAM生成(S)一 BHBM,ee值分别为96.39/6和97.9,不对称还原 COBE生成(S)一CHBE,ee值分别为61.7和 66.0.Jing等构建了重组菌并还原COBE,发现 重组菌的酶活是从掷孢酵母直接纯化的酶的15倍,产 率为98.5,ee值为99. 6结语 醛酮还原酶是一类具有羰基还原功能的超家族, 种属范围广泛,其家族成员均具有(a/)桶状结构,有 着保守的催化机制,而底物结合口袋有一定的变化. 了解已知AKR的结构和作用之间的关系,可为酶的 理性 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 提供有用的信息,哺乳动物AKR中存在潜 在的药物靶点,可利用这些蛋白的相似性,设计针对酶 的特异性抑制剂.虽然AKR的催化机制和NADPH 结合模式已经阐明,但这些蛋白究竟如何区别糖和类 固醇,如何获得不同类固醇的位置和立体结构特异性, 还有待于进一步研究.此外,AKR家族的结构和作用 之间关系的研究,能提供有关此酶底物特异性的进化 信息,并了解这些酶如何利用相同的反应框架,针对广 泛的底物进行相似的反应.因此将来可能会利用这一 AKR框架,用于改造桶状结构的羧基端环,从而产生 新的底物特异性. 再者,大多数AKR家族成员的生理功能尚不明 晰,虽然可通过基因缺失,异源表达以及表达模式研究 等方法,来推测这些酶在细胞代谢过程中的作用,但直 接考察生理条件下酶活的方法还是非常需要的.如通 过克隆和表达那些与已知AKR的开放阅读框相似的 ORF来确定这些可能的酶及其活性,以及利用基因组 微阵法来掌握未知AKR的ORF调节信息从而了解 未知酶的生理作用等,这些方法均是今后研究AKR 生理活性的重要方向. 最后,许多AKR都已经广泛应用于生物转化,相 信该超家族在生物催化方面,有着更为广泛的产业化 李凌凌等:醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用/2009年一1l期 前景. 参考文献: [1]EllisEM.Microbiala1do-ket0reductase[J].FEMsMicrobiol0一 gyLetters,2002,216(2):l23—131. 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(下转第9O页) 日————————————————一王旭东等:高效液相色谱法检测产绿链 霉菌发酵液中肥拉霉素A的含量/2009年一11期 表l Tab.1 肥拉霉素A的回收率 TherecoveryrateofaVilamycinA 提取1h后,处理样品,用丙酮一磷酸盐缓冲溶液(体 积比7:3)重溶进行液相色谱检测.色谱条件:乙