志贺氏菌属(Shigellaspp)荧光定量PCR

志贺氏菌属(Shigellaspp)荧光定量PCR志贺氏菌属(Shigellaspp)荧光定量PCR 志贺氏菌属(Shigella.spp)荧光定量PCR 检测试剂盒操作手册(第一版) 适用于各种食品类材料、卫生监督、疾病控制等来源的临检样品 2006.12 深圳易瑞生物技术有限公司试剂盒组成产品目录号规格 48次检测 DNA提取液 3m l / 1管志贺氏菌PCR反应液 1100µl / 1管 Taq酶(5U/µl) 20µl / 1管志贺氏菌阳性对照 40µl / 1管志贺氏菌阴性对照 100µl / 1管操作手册...

志贺氏菌属(Shigellaspp)荧光定量PCR 志贺氏菌属(Shigella.spp)荧光定量PCR 检测试剂盒操作手册(第一版) 适用于各种食品类材料、卫生监督、疾病控制等来源的临检样品 2006.12 深圳易瑞生物技术有限公司试剂盒组成产品目录号规格 48次检测 DNA提取液 3m l / 1管志贺氏菌PCR反应液 1100µl / 1管 Taq酶(5U/µl) 20µl / 1管志贺氏菌阳性对照 40µl / 1管志贺氏菌阴性对照 100µl / 1管操作手册 1份产品介绍 , 本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，用于志贺氏菌的PCR体外特异性检测。 10, 本试剂盒灵敏度为100拷贝/ml。定量检测线性范围为:10-10拷贝/ml。贮存与运输条件 , 本试剂盒必须在-20?下避光保存，有效期为6个月。 , 需在低温下运输。注意事项 , 本试剂盒仅用于体外检测使用，操作人员必须经过培训并具有一定的经验，试剂盒使用前请仔细阅读说明书全文。 , 请严格按照基因扩增检验实验室的管理规范进行实验操作:如 PCR实验严格分区操作;各区应有专用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染;工作人员应遵循从一区到二区的单方向工作 -1- 原则，各工作区相对隔离;进行PCR实验的工作桌面和及相关物品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精、1mol/L盐酸或紫外灯进行灭菌和消毒。 , 试剂盒中各试剂充分融化后请短暂离心。反应液分装时应尽量避免产生气泡。上机前应注意检查各反应管是否盖紧，以免污染仪器。适用荧光PCR仪品牌与型号 , Cepheid公司的SmartCycler , ABI公司的Prism7000、7700、7500、9600系列 , Stratagene公司的MX3000、MX4000 , Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000 , Bio-Rad公司的iCycler系列、MJ opticon2 , Roche公司的LightCycler等实验操作步骤 , DNA提取:取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，10,000rpm离心5min，弃去上清;加入50µl DNA提取液，充分混匀后沸水浴 5 min，13,000rpm离心5min，取上清液进行检测或保存于-20?以待检测。 , 扩增试剂准备(在试剂贮存和准备区完成) , 从试剂盒中取出PCR反应液，冰盒上融化后混匀。试剂在使用前 2000rpm离心20s。 , 设需要的PCR反应管管数为N(N = 待检样本数X份 + 1管阴性对照 +1管阳性对照)。 , MIX的配制:首先吸取反应混合液至1.5ml灭菌离心管，体积 22.6×N (µl)，再加入Taq DNA聚合酶0.4×N (µl)到1.5ml灭菌离心管，混匀后短暂离心(2000rpm/20s)，然后向N 个0.2ml PCR反 -2- 应管中分装已加入Taq酶的MIX各23µl/每管，盖紧管盖。 , 注意:阴性对照管建议在此区中加入2µl阴性对照样品。 , 加样(在样品制备区完成) , 阳性对照取出解冻，使用前2000rpm 离心20s。 , 将保存在-20?的核酸提取物置室温解冻，以13,000rpm离心5min; 向N个PCR管中分别加入待检样本DNA(包括阳性对照)2µl，盖紧管盖，2000rpm离心20s，将PCR反应管转移至核酸扩增区。注意做好样品号标记。 , PCR扩增(在核酸扩增区完成) , 上机前应检查各反应管是否盖紧。 , 反应体系设为25µl;荧光信号采集设定在退火温度。对于多通道荧光PCR仪，选择荧光素FAM为信号采集通道。 , PCR循环参数为:第一阶段，94? 3 min预变性; 第二阶段，[94? 15s;53? 40s;72? 15s] × 40次循环 , 质量控制标准及结果判断 , 阴性对照C值应显示为0或?40.0，阳性对照的C值应?30.0，否TT 则视实验失败，需重做。 , 检测样品C?35.0，结果有效，可直接报告样品阳性; T , 检测样品35.040.0，需进行一次重复实验，若C仍介于35.0TT 和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照Ct值为零，可报告样品阳性，否则报告样品阴性。 , 检测样品C值为零，报告样本阴性。 T , 部分仪器阈值设定方法 , 对于MJ Opticon2系列荧光定量PCR检测仪进行结果分析时，扣除本底后再输入循环1-15之间的荧光值，进行C值的设置或拖动T 基线到合适的位置以确定C值。 T -3- , 对于ABI7500，9600系列荧光PCR检测仪进行结果分析时基线的确定:取3-10或3-15个循环的荧光值，阈值设定原则为阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，而不显示C值为宜。 T -4- -5-

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