低剂量氟达拉滨、环磷酰胺联合供者NK细胞作为非清髓性预处理用于小鼠单倍相合造血干细胞移植

低剂量氟达拉滨、环磷酰胺联合供者NK细胞作为非清髓性预处理用于小鼠单倍相合造血干细胞移植 低剂量氟达拉滨、环磷酰胺联合供者NK细胞作为非清髓性预处理用于小鼠单倍相合造血干细胞移植 作者: 于津浦， 曹水， 辛宁， 安秀梅， 齐静， 任秀宝【摘要】 本研究探讨低剂量氟达拉滨、环磷酰胺联合供者异体反应性NK细胞(flu+cy+allo NK)作为新的非清髓性单倍相合造血干细胞移植(haploidentical HSCT)预处理 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的可行性。利用免疫磁珠富集F1供鼠(H 2d/b)脾脏NK细胞，检测其中Ly49C+、Ly49A+ 细胞的比例;LDH法检测其异体反应性。建立小鼠单倍相合造血干细胞移植模型，并比较清髓性方案(9 Gy TBI)、各种非清髓性方案(6.5 Gy TBI，flu+cy，及 flu+cy+allo NK)的体内清髓效果、移植后供者嵌合率、GVHD的发生率及严重程度。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明: 与其他非清髓性预处理方案相比，flu+cy+allo NK组不能增加清髓程度，但可显着提高单倍相合移植后的供者嵌合率，移植后21天的嵌合率在骨髓为 (28.70?5.90)%，脾脏为 (46.40?5.00)%，并持续2个月。与flu+cy组相比，flu+cy+allo NK组出现的GVHD反应轻微，仅有50%(5/10)受鼠出现体重减轻，flu+cy+allo NK组小鼠的肝脏、小肠、肾脏及皮肤的病理切片均未见明显的组织损伤。结论: 供者allo NK具有促进单倍相合供者造血干细胞植入，减轻GVHD强度的作用;低剂量flu+cy+allo NK方案为高龄和一般情况差的肿瘤患者开展单倍相合造血干细胞移植提供了新的途径。 【关键词】 非清髓性预处理 Application of Low Dose of Fludarabine and Cyclophosphamide Combined with Donor NK Cells as a Non myeloablative Conditio ning Regimen for the Haploidentical Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Mice Department of Immunology, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Cancer Institute and Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300060, China Abstract This study was aimed to investigate the feasibity of low dose of fludarabine, cyclophosphamide bined with donor derived alloreactive NK cells as a new nonmyeloablative conditioning regimen in the haploidentical hematopoietic stem cell transplantation (haploidentical HSCT). F1 derived NK cells were enriched with MACS magnetic separation system, in which the proportions of the Ly49C+ and Ly49A+ cells were detected by flow cytometry and the alloreactivity was measured by LDH method. The haploidentical HSCT models were constructed, and the myeloablativity in vivo, donor engraftment and the intensity of GVHD were pared between different myeloablative and nonmyeloablative conditioning regimens, including 9 Gy TBI, 6.5 Gy TBI, flu+cy, and flu+cy+allo NK. The results showed that the flu+c‎‎condiy+all‎‎tionio NK ng was nonmyeloablative, but the rate of donor chimerism after haploidentical HSCT was significantly higher as pared with other nonmyeloablative methods, which were (28.70?5.90)% in bone marrow and (46.40?5.00)% in spleen at day 21 post transplantation. When pared with the flu+cy conditioning, the intensity of GVHD was slight in‎‎ the group‎‎flu+c, in ‎‎y+allwhich‎‎o NK only a half of C57BL/6 recipients experienced weight loss, and no distinct pathological damages observed in the liver, intestine, kidney and skin samples. It is concluded donor derived alloreactive NK cells can facilitate engraftment of the haploidentical hematopoietic stem cells and mitigate GVHD. The condiflu+ctioniy+allng o NK provides a new method for those elder patients with high risk solid tumor undergoing haploidentical HSCT. Key words alloreactive NK cell; haploidentical hemopoietic stem cell transplantation; nonmyeloablative conditioning regimen; fludarabine; cyclophosphamide 亲缘间HLA单倍相合造血干细胞移植(haploidentical HSCT)供者容易获得，GVT效应显着，适合用于实体肿瘤的治疗。但haploidentical HSCT发生移植排斥和严重移植物抗宿主病(GVHD)的机率较高，因此寻找一种新的非清髓性预处理方案，在保证移植物顺利植入的基础上控制GVHD和各种严重并发症，是目前亟待解决的问题。 在haploidentical HSCT中，当供者NK细胞表面KIR受体与受者的MHC I类分子不相配时，会产生供者对受者(GVH)NK细胞同种反应性，特异性杀伤受者靶细胞，这种NK细胞被称为异体反应性NK(allo NK)。针对血液系统恶性肿瘤的动物实验和临床回顾性分析均表明，allo NK用于haploidentical HSCT的预处理，具有促进植入、预防GVHD和减少复发等优点,1,2,。在本实验中，通过比较低剂量氟达拉滨、环磷酰胺联合allo NK(flu+cy+allo NK)与其他预处理方案的清髓效果、供者植入率和GVHD情况，初步探讨其在haploidentical HSCT治疗实体瘤中的应用潜力。 实验动物和药物 供体鼠: 清洁级(BALB/c×C57BL/6)F1(H 2Db/d，?)，8-12周龄，体重18-22 g;受体鼠，近交系C57BL/6(H 2Db ，?)，8-12周龄，体重18-22 g，均购自北京维通利华动物中心，为清洁级动物。受鼠饲养于天津医科大学动物实验中心层流房内，供鼠饲养在普通清洁动物房内，每天更换垫料，受鼠移植前7天及移植后饮用的水中加入庆大霉素300 mg/L，饲料经60Co照射灭菌。试验用药: 氟达拉滨(flu, 福达华，先灵公司产品);环磷酰胺(cy，Sigma公司产品)。 供者NK细胞的富集 供者NK细胞的富集按照小鼠NK细胞分选试剂盒(Miltenyi Biotec公司产品) 的操作说明进行。F1供体鼠无菌取脾脏，制备单细胞悬液，用PBS+0.5% BSA+2 mmol/L EDTA洗液洗涤后弃上清，以40 μl/107 cells的浓度重悬细胞，以10 μl/107 cells比例加入生物素标记的单克隆抗体混合液(包括抗L3T4, Ly 2, Ly 1, CD19, Gr 1和Ter 119单克隆抗体)，4-8?孵育10分钟，然后以20 μl/107 cells比例加入包被抗生物素单克隆抗体的磁珠，4-8?继续孵育15分钟，离心洗涤后用500 μl洗液重悬，过柱，收集分选的细胞，用FITC NK 1.1, FITC Ly49A, PE Ly49C(BD PharMingen, Bioscience公司产品)标记，流式细胞仪检测分选细胞中NK富集度，台盼蓝检测活率。 供者NK细胞异体反应性的测定 用含10% FCS的RPMI 1640培养液调整上述富集的供者NK细胞浓度为2×106/ ml，作为效应细胞。分别制备C57BL/6和F1来源脾细胞悬液，在体外用25 mg/ml的PHA连续刺激72小时，收集活化细胞。将NK细胞敏感的Yac 1细胞及H 2抗原不同的C57BL/6和F1来源的靶细胞离心洗涤后调整细胞浓度为1×105/ ml，作为靶细胞。按效靶比(E/T)20? 1、10?1和5?1，将效应细胞和不同靶细胞混合加入96孔凹孔板内，200 μl/well，然后置于37?、5% CO2的条件下培养4小时，根据LDH杀伤试剂盒(Promega公司产品)的操作说明书测定各孔的细胞杀伤率。 不同预处理方案的体内清髓效果比较 根据不同预处理方案，将28只小鼠分为4组，每组7只，分别为 ?9 Gy TBI组， ?6.5 Gy TBI组， ?flu+cy组， ?flu+cy+ allo NK组。第 ?组和第 ?组C57BL/6小鼠分别于移植当天接受照射源为137Cs γ射线9 Gy和6.5 Gy的全身照射，剂量率为0.81 Gy/min。第 ?组和第 ?组的C57BL/6小鼠在移植前5天开始腹腔注射flu 100 mg/(kg?d)(移植前5天-移植前1天)，cy 150 mg/(kg?d)(移植前2天-移植前1天)，其中第 ?组C57BL/6小鼠在移植当天同时经尾静脉给予供者allo NK细胞，每只小鼠2×106细胞。预处理后的小鼠不行移植，在移植后 1、 2、 3、7和10天，分别处死小鼠，取小鼠脾脏和单根股骨，制备单细胞悬液，台盼蓝法计数脾脏单个核细胞数和骨髓有核细胞数。以正常C57BL/6小鼠的骨髓和脾脏有核细胞作为0天对照。 不同预处理方案的小鼠haploidentical HSCT移植模型的建立 根据上述分组，再取72只C57BL/6小鼠行haploidentical HSCT，每组18只，建立不同预处理方案的小鼠haploidentical HSCT移植模型。第 ?组和第 ?组分别在照射后6小时经尾静脉给予(BALB/c×C57BL/6)F1小鼠的骨髓细胞，每只小鼠 1.3×107细胞。第 ?组和第 ?组则在腹腔给药后5天从尾静脉给予F1小鼠的骨髓细胞每只小鼠 1.3×107细胞。 不同预处理方案的小鼠haploidentical HSCT移植后供者植入的监测 取行haploidentical HSCT的C57BL/6小鼠32只，根据上述分组，每组8只，于移植后 7、 14、21和28天取不同预处理组的C57BL/6小鼠脾脏及骨髓，制备单细胞悬液，用FITC H 2Kd单克隆抗体(BD Phar Mingen公司产品)经流式细胞仪检测H 2d阳性细胞比例，确定受者C57BL/6鼠中供者F1鼠来源细胞的比例，对haploidentical HSCT移植后供者植入情况进行监测。以FITC IgG2α为同型对照，并取BALB/c和C57BL/6小鼠脾脏细胞分别作为阳性对照和阴性对照。 不同预处理方案的小鼠haploidentical HSCT移植后GVHD的观察 取行haploidentical HSCT的C57BL/6小鼠40只，根据上述分组，每组10只，于移植后每日测量小鼠体重，连续观察小鼠体重、体位、毛发、大小便及活动能力的改变。 以移植前1天体重为参照，计算体重变化百分数，根据体重降低情况对移植后GVHD进行评分: 0=正常，1=轻度，2=中度，3=重度。体重下降10%为轻度，10%-20,为中度，20%为重度。同时在移植后 7、 14、21和28天取各组小鼠的肝脏、小肠、肾脏及皮肤标本，以甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，观察是否存在GVHD的病理表现。 统计学分析 所有数据采用?SD表示，统计学分析利用SPSS 13.0软件包，定量资料的比较采用单因素方差分析和重复测量数据的统计分析，p0.05为有统计学意义。 结 果 供者NK细胞的富集 经试剂盒分选后的供者NK细胞经台盼蓝染色，细胞活率达95%以上，利用FITC NK 1.1标记细胞后经流式细胞仪检测，分选富集度可从(19.85?4.27)%上升到(74.63?5.49)%(图1)。 供者allo NK表型和异体反应性 与C57BL/6不同，F1来源供者NK细胞中除含有(34.80?2.52)%的Ly49C+细胞，还有(22.24?2.95)%的Ly49A+细胞(图2)。以富集的供者和受者NK细胞作为效应细胞，分别与NK细胞敏感的不同预处理条件下的清髓效果 以正常C57BL/6小鼠作为0d对照，预处理后 1、 2、 3、7和10天计数9 Gy TBI组、6.5 Gy TBI组、flu+cy组、flu+cy+allo NK组小鼠骨髓和脾脏有核细胞总数，绘制出如图3的曲线。结果显示，9 Gy TBI组可以实现完全清髓，在10天内骨髓和脾脏的有核细胞显着降低至几近于零，而其他3组均表现为可逆的非清髓性造血抑制，6.5 Gy TBI组的造血抑制轻微，而flu+cy组和flu+cy+allo NK组的早期造血抑制较明显(p0.01)，其骨髓和脾的有核细胞分别在预处理后3和4天降至最低，分别为(2.80?0.15)×10 6、(2.19?0.18)×106;(3.92?0.30)×10 6、(3.40?0.21)×106，但在7-10天骨髓和脾的有核细胞数可自行恢复至正常水平。