分子生物学技术在酵母菌多相分类鉴定中的应用

分子生物学技术在酵母菌多相分类鉴定中的应用 分子生物学技术在酵母菌多相分类鉴定中 的应用 ? 16?s9ChinaBrewing 分子生物学技术在酵母菌多相分类鉴定中的应用 杨静静.',孟镇,钟其顶,熊正河,周韩玲,潘勤春,栾兴社 (1.中国食品发酵工业研究院,北京100027;2.山东建筑大学市政与环境工程学院, 山东济南250101) 摘要:随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用,许多新的分子生物学技术 被用来进行酵母菌的分类和鉴定.核酸杂交技术,限制 性酶切片段长度多态性分析(RFLP),随机扩增多态性DNA分析(RAPD),脉冲电泳 核型分析(PFGE),rDNA序列分析,单链构象多态性分析 (SSCP)等技术的应用为酵母菌的多相鉴定带来了突破性的进展,结合分子生物学 技术的多相鉴定体系将成为酵母菌分类鉴定的最有效 手段. 关键词:酵母菌;分子生物学技术;分类;鉴定 中图分类号:093—331文献标识码:A文章编号:0254—5071(2011)o4一oo16—04 Applicationofmolecularbiologytechnologyinpolyphasicclassificationandidentification ofyeast YANGJingjing,MENGZhen,ZHONGQiding,XIONGZhenghe,ZHOUHanling,PANQinchun,LUANXingshe (.(~inaNationalResearchlustituteofFood&FermentationIndustries,Beijing100027, China; 2.CollegeofMunicipalandEnvironmentalEngineering,ShandongUniversityBuilding,Jin an250101,China) Abstract:Withthedevelopmentofmolecularbiologyandthewideapplicationofnewtechnol ogies,manynewmolecularbiologytechniquesareappliedin theclassificationandidentifcationofyeasts.Theapplicationofnucleicacidhybridization,re strictionfragmentlengthpolymorphism(RFI)analysis,ran- doraamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)analysis,pulsedfieldgelelectrophoresis(PFGE) karyotype,rDNAsequenceanalysis,single—strandconfornla— tionpolymorphism(SSCP)analysisetc.,hasbroughtabreakthroughinthepolyphasicclassif icationandidentificationofyeasts.Combinedwithmolecular biologytechniques,polyphasicidentificationsystemwillbetheeffectivenleansofyeastclas sificationandidentification. Keywords:yeast;molecularbiologytechniques;classification;identification 酵母菌是一类单细胞真菌,在自然界分布广泛,主要生 长在偏酸性潮湿的含糖环境中,如水果,蔬菜,蜜饯的内部 和表面以及果园土壤中,目前已知的酵母菌有1000多 种'..酵母菌除了应用于食品生产(如酒精饮料,酱油,食 醋,馒头和面包的发酵等)中,其本身也具有很高的营养价 值.在发酵生产过程中,有些酵母菌可以改善食品的品质, 有些却会使食品败坏,因此有必要对食品生产,加工,保鲜 和贮藏过程中酵母菌株的种属进行鉴定,以确定食品中存 在的酵母菌哪些是有益的,哪些是有害的.另外,在纯种 发酵中,发酵过程的微生物学控制往往要求达到菌株水 平,为了确保发酵过程中酵母菌的菌种纯度,要对菌株 变化进行监控,区分不同的菌株,检测优势菌株. 传统的酵母菌鉴定一般要通过形态观察和生理生化试 验,根据试验结果判断菌株的种属,这种方式费时费力,且 重现性不好.另外由于受到环境影响,某些酵母菌在形态 学及生理生化特征方面差异极不显着,采用传统的鉴定方 法对其分类相当困难.因此,有必要用快速,简单和可靠的 鉴定方法确定酵母菌的种属. 近年来,随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛 应用,酵母菌分类鉴定工作有了飞速发展.酵母菌分类鉴 定涉及一般表型特征的鉴定和遗传型特性的鉴定.表型特 征包括形态,生理生化特性的分析等,属于传统研究范畴; 遗传型特性鉴定主要采用分子生物学方法,包括核酸杂交 技术,限制性酶切片段长度多态性分析(RestrictionFrag— mentLengthPolymorphism,RFLP),随机扩增多态性DNA 分析(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD),脉冲 电泳核型分析(PulsedFieldGelEleetrophoresis,PFGE),rD— NA序列分析(包括18SrDNA,26SrDNA的D1/D2,ITS,5.8 SrDNA),单链构象多态性分析(SSCP)等.分子生物学技 术给酵母菌分类鉴定带来了突破性的进展,使分类鉴定.二 作从一般表型特征的鉴定,深化为遗传型特性的鉴定.通 过分子生物学技术可以准确,快速的鉴定酵母菌种,分析发 酵液微生物多样性,筛选有利菌种,控制有害菌种,对发酵 过程进行有效控制,既可以提高产品质量,又能提高产量, 增加经济效益. 1核酸杂交技术 核酸杂交技术是采用一条示踪物标记的DNA分子与 另一条在适当条件下杂交,获得两者间的杂交百分率(DNA 同源性),2种生物间亲缘关系越近,同源百分率越高….,以 此可以判断2菌株是否属同一种. 核酸杂交技术包括DNA.DNA/rRNA杂交分析,核酸分 子杂交探针等.其中DNA.DNA杂交适于种一级水平的研 究.而DNA.rRNA杂交不仅能了解科以上各类菌群的 亲缘关系,而且能确定一些新属的分类地位.真菌核酸 分子杂交探针大致可分为2类:种特异性探针和多态性探 针.种特异性探针主要用于真菌的鉴定.多态性探针包括 来稿日期:2010—12—14 作者简介:杨静静(1985一),女,山东日照人,在读硕士研究生,研究方向为环境生物 技术;熊正河,教授级高级工程师,通讯作者. 专论与综述中国酿造2 22 第 9?总第期" 基因组DNA多态性探针,线粒体DNA(mtDNA)多态性探 针,rDNA多态性探针,小卫星序列(Minisateilite)和微卫星 序列(Microsatellite)或简单重复序列(SimpleSequenceRe— peats,SSR)DNA探针等.核酸分子杂交探针具有特异性, 实验结果很少受非特异性因素的干扰,在酵母的分类学研 究中有重要应用. 2限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP) 限制性酶切片段长度多态性分析(restrictionfragment lengthpolymorphism,RFLP)是SOLOMONE等在1980 年提出并最早发展的可以作为检测遗传多态性的一种方 法,并可以用于遗传作图分子标记技术.其原理是限制性 内切酶能识别DNA分子的特异序列,并在特异序列处切开 DNA分子产生限制性片段,由于不同个体的等位基因之间 碱基的替换,重排,缺失等变化导致限制性内切酶识别和酶 切位点发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差 异,对目的DNA片段进行PCR扩增,然后对扩增产物进行 限制性内切酶消化切割,通过凝胶电泳来分析样品的类型. RFLP是在种,种间及种群以上水平上进行分类研究的 有效手段.?.RFLP可以对大量的DNA样品进行有效的 分析.同时,对mtDNA分子的分析能使种内和种间的分类 更灵敏.此外,核糖体rRNA的分析也已应用于真菌种间 和种下的亲缘关系.2006年,HOSSEINM等用MspI 酶对C.albicans,C.glabrata,C.parapsilosis等假丝酵母属 RFLP试验,发现通过其酶切片段,能 的6个种进行了PCR— 够对各种进行区分.AGNOLUCCIM等用Rsal酶对 S.bayanus,S.pastorianus和S.cerevisiae菌株mtDNA进行 酶切分析时,发现其图谱间的相似性为20%, 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 mtDNA— RFLP标记法能够区分同种菌株.国外的一些酒厂通过利 用mtDNA—RFLP技术区分发酵过程中酿酒酵母的菌株,来 揭示发酵过程中酵母菌株的生态化和多样性.但是 RFLP的酶切图谱背景浓重,特征性酶切条带难以辨认,这也 限制了其的应用推广,目前此技术主要用于种及种下的分类. 3随机扩增多态性DNA分析(RAPD) 随机扩增多态性DNA分析(Randomlyamplifiedpoly— morphismDNA,RAPD)是WILLIAMSJG等于199o年同 时提出的一项在PCR技术的基础上发展起来的多态性分 析新技术.其基本原理是利用一系列长度约为10bp的随 机引物,在较低的退火温度时结合到与之同源的DNA序列 上,对所研究的基因组DNA进行PCR扩增,然后将扩增产 物进行聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳,经染色或放射自显 影来检测产物DNA片段的多态性.扩增DNA片段的多态 性能反映基因组相应区域DNA的多态性,显示出不同菌株 之间的差异,因此可以应用于酵母菌的分类分型. RAPD技术具有快速,简单,可以检测序列长度差异和 引物区碱基差异等优点,可以用于种与亚种的鉴别,也可比 较种属间的差异.徐勇等对6个属的21个酵母菌株的 基因组DNA的多态性进行了RAPD分析,研究表明,RAPD 能够检测出酵母种内微小的遗传差异,其特征谱带可作为 酵母菌种鉴定的特征标记.李东梅等对48株常见的致 病酵母菌属间,种间及种内基因组型的多态性进行了研究, RAPD带型清楚地显示了假丝酵母属(Candidasp.)及相关 酵母属间,种间及种内的差异,表明其在假丝酵母属菌种 ,由于RAPD技术本身 的分类鉴定中有一定的优势.但是 引物较短,复性温度较低等使得其重复性及特异性较低, 对反应中的许多因素的变化敏感,不能区分二倍体生物 的显性基因. 4脉冲电泳核型分析(PFGE) 脉冲电泳核型分析的原理是当脉冲电场改变方向时, DNA分子要想迁移,必需先进行重新定向,而DNA分子越 大,重新定向越难,因此,脉冲场凝胶电泳能有效区分分子 量大小不同的DNA.PFGE先后经历了5种类型,其中钳位 均匀电场电泳(CHEF)吸取了其他方法的优点,根据静电场 原理,将24个电极均匀排列在等六边形周边,从而在六边 形中央形成脉冲式匀强电场,其具有DNA带直,分辨率高, 可检测染色体上大片段的插入,缺失,重复和易位的优点, 可以推测出一种酵母菌所具有的染色体条数及每条染色体 的大小.随着脉冲电泳仪的改进以及完整染色体DNA 提取方法的发展,脉冲电泳技术越来越多的被应用于酵母 菌及其他真菌的分类学研究中.SCHWARTZDC等.弼 于1982年提出在交互改变的电场下可以分离大于50kb的 DNA样品,SCHWARTZDC等于1984年创立了脉冲电泳 技术(pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE)并成功分离了 酿酒酵母染色体DNA.2000年,BAIFY等通过脉冲电 泳核型分析,清楚地区分开了C.guilliermondii复合群中的 几个种;2008年,雷红等用脉冲电泳核型分析方法研究 了白色假丝酵母菌DNA核型,研究发现,分离的14株白色 假丝酵母菌有9种不同基因核型.这些都表明脉冲电泳核 型分析在酵母菌的分类学研究中具有重要的应用价值.但 是脉冲电泳核型分析对设备的要求比较高,操作比较复杂, 费时,同时受电泳条件影响较大,操作经验对结果的准确性 有一定的影响,目前多被用于种的鉴定与菌株分型. 5rDNA序列分析 rDNA是编码核糖体KNA的基因,通过PCR技术和荧 光染色技术结合可以准确定位基因位置,其测定序列常用 来鉴定物种同源性.现在rDNA与其转录间区(ITS)的序 列分析方法已被广泛应用于酵母菌的分类鉴定中,包括18S rDNA,26SrDNA的D1/D2,ITS,5.8SrDNA.这些序列大部 分己经公布于GenBank/EMBL/DDBJ等国际核酸序列数据 库中,为酵母菌的分类鉴定带来了极大的便利. 在rRNA中,26SrRNA是核糖体RNA的一个亚基,而 26SrDNA是编码该亚基的基因,26SrDNA在细胞内有数以 百计的拷贝,增加了扩增成功的可能性.26SrDNA的D1/ ? 18?s9ChinaBrewing D2区域位于大亚基的5'端,序列长度在600bp左右,GU. TELLRR研究表明,这段区域具有较高的变异率,可用于 亲缘关系较近的菌株间的分类研究.1991年,PETERSONS w等的研究显示,同种酵母菌的核糖体大亚基5'端可 变区D1/D2区域的碱基差异率一般小于1%,不同种菌株 的碱基差异率大于1%,为菌株鉴定提供了一种经验值参 考.目前,所有已描述的酵母菌种的大亚基rDNAD1/D2区 序列都可以在核酸序列数据库上查到,因此,通常仅根据其 D1/D2区序列就可将大部分菌株鉴定到种,而且大多情况 下,D1/D2区序列分析结果与 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 表型分析结果基本一致. ITS(internaltranscribedspacer)区域为转录间区,位于 l8SrDNA和26SrDNA之间,分为ITS1和ITS2片断,中间 包含一个5.8SrDNA.通常在分析ITS区域序列时,将 5.8SrDNA,起考虑进去,但5.8SrDNA比较保守,从中获 得的信息很少.ITS区域与rDNA转录区相比具有较高 的变异率,对于亲缘关系较近的菌株间的区分是比较有效 的.TAKASHIMAM等的研究表明ITS区域差异大于1%就可能代表不同的种,然而不同属的情况会有所不 同.ITS区序列常常与其他序列相结合,应用于酵母菌分类 系统学研究中. 真核生物核糖体的小亚基RNA由染色体基因编码称 为18SrDNA,是至今发现的DNA序列中最为保守的一类. 因此,利用18SrDNA研究高级分类阶元的分子进化和分子 系统学问题受到了普遍重视.酵母菌小亚基rRNA大约 有1800bp,含有不同变异率的区段,可以用于种,属或更高 等级分类群之间的系统关系研究.1996年,CAIJ等利 用18SrRNA全基因序列分析发现酵母菌Dekkera和Bretta— nomyces是一组稳定的,相对独立于其他酵母的类群. MOTOFUMISA等通过18SrDNA全序列分析,证实基于 辅酶Q-7分析的假丝酵母菌是多源的,这些假丝酵母菌被 分为3个种群,这3个种群与假丝酵母其他属种的种系关 系较远. DNA序列分析技术以能够直观展现基因一级结构,信 息容易分析,能实现自动化的优点被应用于属及种的鉴定, 但是此技术难以检测多拷贝基因中的低比例变异类型. 6单链构象多态性分析(SSCP) 单链构象多态性分析(singlestrandconformationpoly— morphism,SSCP)是一种基于DNA构象差别来检测点突变 的方法.ORITAM等于1989年最先提出了单链构象多 态性这一概念;同年,ORITAM等将SSCP用于检测PCR 扩增产物的基因突变,从而建立了PCR—SSCP技术.SSCP 技术的原理是在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成 一 定的空间构象,不仅长度不同的DNA能形成不同的构 象,而且长度相同碱基组成不同的DNA也会形成不同的空 间构象.空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺 凝胶中受排阻大小不同,单链DNA的非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳(PAGE)能有效的区分存在碱基差异的DNA.凶 此,SSCP能有效检测碱基替代,分辨率高.WANGQM 等对表型相似的酵母菌进行了rDNAPCR—SSCP指纹图 谱分析,研究表明PCR—SSCP在酵母菌种的区分中是一种 高效快速的分析手段.其不足在于SSCP所利用的信息位 点少,并且有时存在不可预测条带,目前多被用于种的鉴定 与菌株分型. 7酵母菌分类鉴定技术展望 酵母菌鉴定的发展趋势应该是向简单,快速,准确的方 向发展,但每种鉴定方法都有自身的适用范围,单一的鉴定 技术不能完全胜任酵母菌的分类鉴定,只有同其他方法结 合起来进行比较研究才能得到更为可靠的结果,如将传统 方法和分子生物学方法结合起来才可以避免由于单一方法 原理本身局限所引起的偏差,提供更加全面,准确的菌种信 息.2007年,夏青等结合传统鉴定方法与脉冲电泳核型 分析成功鉴定了8株国外引进的酿酒酵母.此外,利用同 一 分子生物技术鉴定不同的基因区,也可以达到较好的鉴 定效果.因此为了得到酵母菌菌种更为准确和完整的信 息,综合包括分子,生化,形态等多种鉴定技术建立一套能 够全面分析菌种特性,提供菌种多方位信息的多相鉴定技 术体系,并使之成为酵母菌鉴定的标准化操作规程是非常 必要的.此外,为了适应工业化生产需求,在葡萄酒酿造发 酵过程中利用构建的多相鉴定体系对野生菌株和生产菌株 的基因型进行快速,准确的鉴定,研究接入的优良菌种在发 酵过程中是否占主导地位,并防止杂菌污染,对保证生产稳 定和产品质量意义重大. 随着分子生物学和相关技术的发展,分子生物学技术 以其准确,快速,灵敏等优点逐渐成为微生物分类鉴定的重 要手段,并且已经取得了较好的效果,解决了大批传统方法 难以确定其分类学地位的酵母菌株分类鉴定问题.町以预 见,结合分子生物学技术的多相鉴定体系将成为酵母菌分 类鉴定的最有效手段. 参考文献: [1]吴柏春,熊元林.微生物学[M].武汉:华中师范大学出版社,2006. f2]周春艳,张秀玲,王冠蕾.酵母菌的5种鉴定方法[J]中国酿造,2006 (8):51—54. 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Keywords:bacterialcellulose;strainsbreeding;fermentation;application 细菌纤维素(bacterialcellulose,简称BC)是由诸如醋 酸杆菌属等细菌生产的一种新型高性能微生物合成材料. 与其他形式形成的纤维素相比,尽管具有相同的化学成分, 但其还具有特殊的物理,化学和生物学特性,特别是发酵过 程的可调控,发酵底物的多样性,微生物的多样性等;这些 特性使得BC在食品,生物医药学,组织工程支架材料,声学 器材以及造纸,化妆品,采油,膜过滤器等诸多领域获得较 高的关注,受到国内外学者青睐.国外对BC进行了广泛 深入的研究,并将其应用于食品工业,造纸和生物医学工程 中,取得了较好的研究成果.我国在微生物合成BC方面 的研究刚起步,研究主要集中在菌种选育,廉价培养基的选 择,发酵T艺改进上. 1细菌纤维素 纤维素是自然界最丰富的天然高分子材料,目前可以 通过2类途径获得纤维素:一类是天然合成纤维素,分为植 物的光合作用合成和微生物合成;另一类是人工合成纤维 素,分为在生物体外由纤维二糖的氟化物经酶催化合成纤 维素和新戊酰衍生物开环聚合生成葡萄糖后再化学合成纤 维素. 光合作用合成的纤维素主要是植物纤维素,在工业上 应用是最普遍的,但需经过分离纯化去除木质素和半纤维 素后才能使用;人工合成的纤维素聚合度较低,很难达到自 然界中高结晶度和高规则结构.光合作用合成法和人T合 成法在获得纤维素过程中为能获得高纯度的纤维素,都需 消耗大量的化学原料,同时产生出相应的环境污染问题. 由此启迪人们探索具有巨大发展潜力的微生物合成法,微 生物通过发酵途径获得的纤维素在结构和性质上有着独特 的优越性. 与植物纤维素相比,BC具有许多独特性质:(1)一种 "纯纤维素",具有高化学纯度和高结晶度;(2)具有很强的 持水能力;(3)具有较高的生物适应性,在自然界可直接降 解,不污染环境;(4)超精细网状结构,细菌纤维素纤维是由 收稿日期:2010—12—06 基金项目:陕西省科学院青年人才基金(2010k一29) 作者简介:王银存(1987一),男,在读硕士研究生,主要从事微生物发酵及应用方向工作;卢美欢,助理研究员,通讯作者. 42]CAIJ,ROBERTSIN,COLLINSMD.Phylogeneticrelationshipsamong membersoftheascomycetousyeastgeneraBrettanomyces,Deboryomyees,Dek— kera.andKluyveromycesdeducedbysmall—subunitrRNAgenesequences[J]. 1ntJSystBac~fiol,1996,46(2):542-549. 『431MOTOFUMISA,TAKASHIN.Phylogeneticstudyofubiquinone-7spe. 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