芽孢杆菌与光合细菌协同作用对养殖刺参的影响

芽孢杆菌与光合细菌协同作用对养殖刺参的影响 1111112李君华，刘佳亮，曹学彬，李 静，宋盛亮，曲玺昌，王得宾， 2高 滨 (1 山东东方海洋科技股份有限公司海参研究中心，烟台，264003;2山东东方海洋科技股份有限公司， 烟台，264003) 摘要:为研究芽孢杆菌和光合细菌协同作用对刺参养殖水质及其生长、消化和免疫的影响，测定了水体COD、氨氮(NH-N)和亚硝酸盐氮(NO-N)24h的变化量、肠道蛋白酶和淀粉酶42 的活性以及体腔液超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)和溶菌酶(LSZ)的活力。 5结果表明，混合菌组优于单一菌投喂组。在芽孢杆菌和光合细菌投喂浓度以1.86×10CFU/ml 4和1.75×10CFU/ml搭配时，该实验组协同作用效果最优，水体COD、NH-N和NO-N含量均42 ;刺参特定生长率最大(0.76%/d)，较对照组提高56.8%，成活显著低于对照组(p<0.05) 率亦最高(97.8%);蛋白酶和淀粉酶活性最高(分别为96.72 U/mgprot和98.72U/mgprot)，较对照组显著提高149%和44.82%;体腔液SOD活力最高(65.16U/ml)。而两种菌对刺参AKP和LSZ活力的影响较小。综上所述，芽孢杆菌和光合细菌搭配合理效果更佳，能够有效改善养殖环境，提高刺参消化酶活性和免疫力，促进刺参生长。 关键词:刺参;芽孢杆菌;光合细菌;水质;消化酶;免疫因子 刺参(Apstichopus japonicus)俗称海参，属棘皮动物门，是我国北方沿海重 [1]要的海水养殖品种。近几年，刺参养殖业得到飞速发展，仅山东地区2007年刺参增养殖产值已突破100亿元。随着海参养殖业的发展，海参疾病问题接踵而至，疾病的爆发已成为限制该产业健康稳定发展的瓶颈，抗生素药物的长期使用或滥用，引起细菌抗药性及药物残留等问题，废水污染问题亦日益凸现。 为了解决养殖病害和食品安全等诸多矛盾，微生态制剂用于养殖生产的研究越来越受到人们的关注。目前水产养殖生产上用得比较多的光合细菌、芽孢杆菌 [2,3]复合菌等，这两类菌的生长特性，作用机制都有较多研究报道。目前，芽孢 [4-8]杆菌与光合细菌的研究主要集中在淡水和海水养殖鱼虾类，而益生菌在刺参 [9-12]养殖中的研究还相对较少，芽孢杆菌与光合细菌协同作用对刺参养殖的影响尚未见系统报道，本文介绍了芽孢杆菌和光合细菌在海参养殖中的应用，较为全 基金项目:2011年山东省农业良种 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 ;海阳市科学技术发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目。 作者简介:李君华(1983-)，女，工程师，硕士，主要从事养殖刺参水质调控及营养饲料研究。E-mail: marinejh@yahoo.cn 面地分析了两者间的协同作用对刺参养殖水体及其生长消化和免疫的影响。 1 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1 材料 光合细菌(Photosynthetic bacteria简称PSB)，荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌种均来自于山东东方海洋科技股份有限公司微生物实验室，菌液由实验室自行培养， 8-19-1菌液浓度分别为10×10CFU?ml和3×10CFU?ml。 1.2 实验设计和日常管理 实验刺参选自山东东方海洋科技股份有限公司良种场刺参生产车间，体重2.60?0.08g。实验容器为60L的蓝色塑钢水箱，每个水箱放30头刺参，养殖用水盐度29?1PSU，水温在14.8-18.6?，并保持24h充氧，每天换水50%左右。换水时清理粪便和残饵，保持水箱内清洁。换水后，加入新鲜海水后投喂饲料，投喂量为刺参体重的5%(配合饲料与海泥以1:1投喂)，并根据刺参摄食情况作适当的调整。实验周期为75天，实验开始前暂养一周，并饥饿两天后开始实验。 5-14-1实验设对照组、芽孢杆菌组(1.86×10 CFU?ml)、光合细菌组(1.75×10 CFU?ml)和混合菌组5组处理，混合菌组分别为YG1(芽孢杆菌+光合细菌，比例1:1)、YG2(1:2)、YG3(1:3)、YG4(2:1)和YG5(3:1)，其菌液投喂浓度分别为: 54-154-154-11.86×10+1.75×10 CFU?ml、1.86×10+3.5×10 CFU?ml、1.86×10+5.25×10 CFU?ml、 54-154-13.72×10+1.75×10 CFU?ml和5.58×10+1.75×10 CFU?ml，各组设3个重复。每天换水投饵后将菌液泼洒于养殖水体中，混合菌液现用现配。 1.3 样品采集与分析 SGR)，其计算实验期间每月称重计数一次。刺参生长指标采用特定生长率( –1方法如下:SGR (% d) = 100 × [ln W2 – ln W1] / T(W1 :实验开始重量;W2 :实验结束重量;T:实验持续时间)。 在养殖实验的中期，测定24h水体COD、氨氮(NH-N)和亚硝酸盐氮(NO-N)42浓度变化情况，即每次换水后取水样并测定水质指标，经24h后，在同一时间点于换水前再次取水样测定。 取刺参肠道前停食72h，使其排空消化道内的食物残渣。每个水箱取5头刺参，用滤纸轻轻吸干体表水分，称重，置冰盘上，用1ml注射器从刺参肛门处插入体 腔内，小心抽取刺参体腔液置于离心管中，立即于4?，4000r/min离心10min，取上清液分装于0.5ml的离心管中，-20?保存，用于测定各项免疫指标。待刺参体腔液抽取完毕，于冰盘内注射0.35mol/l KCl溶液，诱导排脏，获得消化道，剔除与消化道末端相连的呼吸树，用预冷重蒸水配置的pH 7.0磷酸盐缓冲溶液(NaHPO-NaHPO)冲洗后，用滤纸轻轻吸干水分，称量肠道质量，-20?保存，2424 用于测定肠道消化酶活性。 消化道在冰浴中用玻璃研磨器匀浆10~15 min，按1 g样品10 ml缓冲溶液的比例分次加入pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。然后将匀浆液在高速冷冻离心机中以4?，5000 r/min冷冻离心30 min，其上清液即为粗酶提液，4?保存。此粗酶提液在24 [13]h内分析完毕。 1.3.1 水质理化指标的测定 化学需氧量(COD):碱性高锰酸钾法 氨态氮(NH3-N):纳氏试剂法 亚硝态氮(NO2-N):萘乙二胺分光光度法 COD浓度24h变化量计算 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 如下:COD浓度变化量(mg/l)=24h后水样COD浓度(mg/l)—24h前水样COD浓度(mg/l);氨氮和亚硝态氮浓度变化量计算同COD。 1..3.2 消化酶活性的测定 蛋白酶活性测定依福林一酚试剂法，略加修改;淀粉酶活性测定参照淀粉一 [13]碘显色法，略加修改。具体操作详见文献。蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝G-250法测定。蛋白酶活力均以比活力表示，即每毫克蛋白质所显示的活力(活力单位/mg蛋白)。蛋白酶活力单位定义:在pH 7.2和40?下保温20 min，1 g仿刺参消化道1 min水解0.5,的酪蛋白产生1 g酪氨酸即为1个蛋白酶活力单位;淀粉酶活力单位定义:40?，30 min内，100 ml酶液中的淀粉酶完全水解淀粉l0 mg为1个淀粉酶活力单位。 1.3.3 免疫因子的测定 刺参体腔液的SOD、AKP和LSZ的活力均使用南京建成试剂盒测定。其中SOD活力按照血清中总超氧化物歧化酶活力法测定;AKP活力按照血清中AKP检测方法测定;LSZ活力按照空白对照法测定，其测定原理和操作详见试剂盒说明。 1.4 数据分析 数据用SPSS17.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)并进行多重比较，试验结果用平均数? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 误差表示，当p<0.05时表示差异显著。 2 结果 2.1 芽孢杆菌与光合细菌对刺参养殖水质的影响 由图1可见，投喂适量的芽孢杆菌和光合细菌可以显著降低刺参养殖水体的COD、NH-N和NO-N(p<0.05)，其中，水体COD含量以YG1和YG3组最低，42 YG1、YG2和YG3三组间差异不显著(p>0.05);NH-N和NO-N含量均以YG1组42最低，较对照组显著降低分别为48%和60%;单一菌投喂组Y组水体NO-N含量2低于G组，而COD、NH-N含量高于G组。YG4和YG5组芽孢杆菌投喂量较大，4 影响了刺参摄食，其水体的COD、NH-N和NO-N均显著高于对照组(p<0.05)。 42 1.40COD浓度24h变化量 1.20dd 1.00c 0.80 b0.60COD/(mg/l)ababab0.40a 0.20 0.00CKYGYG1YG2YG3YG4YG5 0.2氨氮浓度24h的变化量e0.18 0.16 0.14d 0.12c 0.1bcbc氨氮/(mg/l)0.08aba0.06a 0.04 0.02 0CKYGYG1YG2YG3YG4YG5 0.012d亚硝酸盐氮24h变化量 0.01 c0.008 b0.006 亚硝酸盐氮/(mg/l)0.004aaaaa0.002 0CKYGYG1YG2YG3YG4YG5 图1 芽孢杆菌与光合细菌投喂对刺参养殖水质COD、氨氮和亚硝酸盐氮浓度的 影响 注:含有不同字母的数值间存在显著差异(p<0.05)，以下各图均如此。 Fig.1 Effects of Bacillus sp. and PSB on COD,NH-N and NO-N in culture water 42 Note:The difference is significant with different letters (n=3，p<0.05) 2.2 芽孢杆菌与光合细菌对刺参生长指标的影响 实验各组刺参成活率均在90%以上，实验添加组与对照组间无显著性差异，以YG1组成活率最高(97.8%)。由图2可见，投喂芽孢杆菌和光合细菌可提高刺参特定生长率，其中混合菌投喂组(YG1、YG2和YG3)较单一投喂组(Y和G组)作用明显，以YG1组特定生长率最大(0.76%/d)，较对照组、Y对照组和G对照组显著提高分别56.8%、43.8%和38.1%(p<0.05)。芽孢杆菌投喂浓度较大组(YG4和YG5组)刺参特定生长率提高不显著(p>0.05)，甚至有所下降。 0.85 0.8 e0.75 0.7 0.65 d0.6cd 特定生长率0.55bcbcSGR/(%/d) bc0.5ab0.45a 0.4CKYGYG1YG2YG3YG4YG5 图2 芽孢杆菌与光合细菌投喂对刺参2个月特定生长率的影响 Fig.2 Effects of on Bacillus sp. and PSB on specific growth rates of A.japonicus 2.3 芽孢杆菌与光合细菌对刺参消化酶的影响 120 110蛋白酶c淀粉酶100 90db80ababababab70ac60c酶活力()/U/mgprot50bab40abab30a 20CKYGYG1YG2YG3YG4YG5 图4 芽孢杆菌与光合细菌投喂对刺参消化酶活性的影响 Fig.4 Effects of Ballicus and PSB on digestive enzymes activities of A.japonicus图3 芽孢杆菌与光合细菌投喂对刺参消化酶活力的影响 Fig.3 Effects of on Bacillus sp. and PSB on digestive enzymes activities of A.japonicus 由图3可见，投喂芽孢杆菌和光合细菌可提高刺参消化酶蛋白酶和淀粉酶活力。其中，YG1、YG2和YG3组刺参蛋白酶活力显著高于其他实验组(p<0.05)，以YG1组最高(96.72U/mgprot)，较对照组提高149%;YG1组刺参淀粉酶显著高于其他实验组(p<0.05)，其余各组与对照组间差异不显著(p>0.05)。 2.4 芽孢杆菌与光合细菌对刺参体腔液免疫因子的影响 由图4可见，芽孢杆菌和光合细菌混合投喂组可显著提高刺参SOD活力(p<0.05)，其中以YG1组刺参SOD活力最高(65.16U/ml)，较对照组提高37%，但单一菌投喂组(Y和G组)与对照组差异不显著(p>0.05)。 由图5可见，单一菌投喂组(Y和G组)、较低浓度混合菌组(YG1)和过量芽孢杆菌混合组(YG5)对刺参AKP活力影响较小(p>0.05)，YG2、YG3和YG4组刺参AKP活力显著高于对照组(p<0.05)。 由图6可见，所有实验组刺参LSZ活力均不存在显著性差异(p>0.05)，混合菌投喂组YG1、YG2、YG4和YG5组刺参LSZ活力较对照组均有所提高，单一菌投喂组与对照组接近。 70bcbc65cbbc60 a55aa50 45活力SOD/(U/ml)40 35 30CKYGYG1YG2YG3YG4YG5 图5 芽孢菌和光合细菌投喂对刺参SOD活力的影响图4 芽孢杆菌与光合细菌投喂对刺参SOD活力的影响 Fig.5 Effect of Ballicus and PSB on activity of SOD of A.japonicusFig.4 Effects of on Bacillus sp. and PSB on activity of SOD of A.japonicus 0.3 d0.25 0.2 cabcbc0.15aaaba0.1 活力金氏单位0.05AKP/(/100ml) 0CKYGYG1YG2YG3YG4YG5 图6 芽孢菌与光合细菌投喂对刺参AKP活力的影响 图5 芽孢杆菌与光合细菌投喂对刺参AKP活力的影响 Fig.6 Effect of Ballicus and PSB on activity of AKP of A.japonicusFig.5 Effects of on Bacillus sp. and PSB on activity of AKP of A.japonicus 25bb20babababab15a 10活力LSZ/(U/ml) 5 0CKYGYG1YG2YG3YG4YG5 图7 芽孢杆菌和光合细菌投喂对刺参LSZ活力的影响Fig.7 Effect of Ballicus and PSB on activity of LSZ of A.japonicus图6 芽孢杆菌与光合细菌投喂对刺参LSZ活力的影响 Fig.6 Effects of on Bacillus sp. and PSB on activity of LSZ of A.japonicus 3 讨论 3.1 芽孢杆菌与光合细菌对刺参养殖环境的水质调控 芽孢杆菌和光合细菌同属于有益微生物细菌种类，光合细菌和芽孢杆菌均可 [6-9,14-19]对养殖水体净化起到很好的效果，净化水质的原理是通过利用水体中的有机物(粪便、腐败物等)获得能量来促进自身繁殖，从而转移降解有机物达到降低氨氮、硫化氢、亚硝酸盐等的含量。在正常条件下，光合细菌能够消除污染、净化水体的作用，但在高密度养殖条件下，光合细菌的数量不足以能完全消除转化残饵及排泄物，芽孢杆菌可以与养殖环境中的有害藻类及水产致病菌竞争，形 [14,15]成优势种，抑制有害藻类及水产致病菌。陆家昌等研究发现，光合细菌可降低水体中氨氮和COD含量，可抑制水体中亚硝酸盐氮的产生，但不能降解已经 [8]产生的亚硝酸盐氮。赵亮等的研究结果显示，施用光合细菌比对照组氨氮和亚 [16]硝酸盐氮分别降低了41.5%和41.4%。刘慧玲等研究了不同浓度枯草芽孢杆菌 [6]在罗非鱼养殖中的应用，水体中NH-N和NO-N和COD都有不同程度地降低。42 李卫芬等在草鱼养殖水体和饲料中均加入芽孢杆菌，发现水体中氨氮和总无机氮 [17]除去效果更佳，但是提高了NO-N含量。罗勇胜等研究揭示了光合细菌与芽孢2 [18]杆菌协同净化作用明显。姜海明等研究了芽孢杆菌与光合细菌对乌鳢养殖水的净化作用研究，研究发现在芽孢杆菌和光合细菌使用比例为1:3时，对乌鳢养 [7]殖水的氨氮去除率和COD去除率最优。两者均推荐芽孢杆菌与光合细菌的最佳 5 4[19]配比用量为1.8×10CFU/ml和1.75×10CFU/ml，这与王彦波等推荐的2:1略有不同，但三者均认为芽孢杆菌和光合细菌混合添加优于单独使用。本实验表明，芽孢杆菌和光合细菌协同作用明显，显著降低了刺参养殖水体中COD、NH-N和4NO-N，混合菌使用优于单一菌使用，当芽孢杆菌投喂量较大时，影响了刺参摄2 5 食，水体COD、NH-N和NO-N含量均较高。两者的最佳添加量为1:1(1.86×1042 4CFU/ml和1.75×10CFU/ml)，与罗勇胜和姜海明等的结果接近。 3.2 芽孢杆菌与光合细菌对养殖刺参的影响 微生态制剂不仅能够降低养殖环境中氨氮、亚硝酸盐等有害物质的含量，减少养殖生产对水域环境造成的污染，而且还能改善养殖动物肠道微生物群落环境，增强消化酶活力，促进养殖动物生长，降低疾病发生率等。袁成玉等研究表 [11]明，益生菌制剂可以提高幼刺参的消化酶活性和成活率，并能促进生长。丁贤等认为外源添加的芽孢杆菌制剂对消化酶活性的提高有一定限度，消化酶活性随 [4]菌量的增加上升到一定程度时便不再增加，甚至会出现下降。本实验结果，发现刺参养殖水体中投喂芽孢杆菌和光合细菌能够促进刺参生长、提高消化酶活 性，刺参特定生长率和消化酶活性间变化趋势相同说明酶活性的提高可以促进刺 [11]参对饵料的营养成分的吸收，从而加快生长，这一结论与袁成玉等的结果相同;但是刺参生长、消化酶活性等的提高并不是随着菌量的增加而上升了，添加过量 [4]反而不利于刺参生长，两者适宜的搭配比例为1:1，该结果与丁贤等的结果相似。Saeed等认为在印度对虾(Fenneropenaeus indicus)的幼体培育和池塘养殖过程中全程使用芽孢杆菌，维持数量优势，能显著提高了对虾特定增长率，降低了饵料 [5]系数，且提高了对虾的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。 微生态制剂影响养殖动物免疫力方面也有较多的报道。朱学芝等认为，芽孢杆菌进入肠道后，其表面抗原或代谢物担当免疫原不断刺激机体的免疫防御系 [20]统，从而增强机体的非特异性免疫力。胡毅等用单一和复合芽孢杆菌制剂投喂凡纳滨对虾，均不同程度提高了对虾血清PO、LSZ等活力，其中添加复合益生 [21]菌组较对照组显著提高。骆艺文投喂复合菌剂刺参体腔液ACP和AKP活性均显 [22]著提高，SOD变化不显著。王亚敏的研究表明芽孢杆菌能一定程度提高体腔 [12]液中磷酸酶活力，而SOD活力不能被诱导。光合细菌富含B族维生素和辅酶Q [23]等生理活性物质能促进鱼类等水生生物的生长，提高免疫力。林黑着等将光合细菌用于尖吻鲈养殖中，发现光合细菌对其血清AKP、POD及SOD均没有显著 [24]性影响。笔者认为，投喂芽孢杆菌和光合细菌的的混合菌组刺参体腔液SOD、AKP和LSZ活力均有不同程度的提高，而单一菌组与对照组间无显著性差异，这一结果与胡毅和王亚敏等的研究结果相似。 参考文献: [1] CHEN J X(Brief introduction to mariculture of five selected species in China(UNDP/FAO Regional Seafarming Development and Demonstration Project[J](National Inland Fisheries Institute Kasetsart University Campus，Bangkok，Thailand，1990，16( [2] 杨莺莺，李卓佳，贾晓平(水质净化作用菌光合细菌PS2的生物学特性及环境因子对其 生长的影响[J](上海水产大学学报，2003，12(4):293-297( [3] 李卓佳，郭志勋，张汉华，等(班节对虾养殖池塘菌一藻关系初探[J](中国水产科学， 2003，10(3):262-264( [4] 丁 贤，李卓佳，陈永青，等(芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长和消化酶活性的影响[J](中 国水产科学，2004，6(11):580-584( [5] SAEED Z N，MEHRAN H R，GHOBAD A T，et a1(The effect of Bacillus spp bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity，survival and growth in the Indian white shrimp ，252:516-524( Fenneropenaeus indicus[J](Aquaculture，2006 [6] 刘慧玲，张战锋，李长玲，等(光合细菌对罗非鱼育苗养殖水质及抗病力的影响[J](渔 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Japonicus, the related wather quality, digestive enzymes and immune parameters. The result showed that the concentration of COD, ammonia-N and NO-N of the experiment group that 2 5 4 introduced Bacillus sp. and PSB at the concentations of 1.86×10CFU/ml and 1.75×10CFU/ml respectively, were minimum and significantly lower than those of the control group (p<0.05) . At the end of the whole experiment, the survival and specific growth rates of,. Japonicus of this group were the highest; the activities of protease and amylase were significantly higher than those of the control group(p<0.05), increased respectively by 149% and 44.82%. The bacteria at suitable concentration can enhance body immunity, however the activities of alkaline phosphatase and lysozyme in all groups were not significant(p>0.05). Key words:,pstichopus japonicus;Bacillus subtilis;photosynthetic bacteria;water quality; digestive enzymes; immune parameters