莴苣花叶病毒北京分离物基因组3＇末端序列分析

莴苣花叶病毒北京分离物基因组3＇末端序列分析 莴苣花叶病毒北京分离物基因组3,末端序 列分析 ? 88- ChineseAgriculturalScienceBulletinVo1.23No.72007July http:Hwww.casb.org.cn 莴苣花叶病毒北京分离物基因组3末端序列分析 尚巧霞.-,向海英,韩成责,李大伟,于嘉林 (北京农学院植物科学技术系,北京102206;中国农业大学植物病理学系 农业生物技术国家重点实验室,北京100094) 摘要:笔者通过RT—PCR方法对LMV北京分离~(LMV—BJ)基因组 20nt的核苷酸片段进行了 3端16 克隆和序列分析(GenBank登录号为EF423619).所获片段含有NIb基因3端的574nt.编码NIbC一 端190个氨基酸;完整的CP基因,全长为834nt,编码一个由277个氨基酸组成的分子量约为30kDa 的结构蛋白;3非编码区含有209nt.通过序列分析软件将LMV—BJ与已经报道的法国分离物O (X97704),法国分离物E(X97705),美国分离物(X65652),巴西分离物 (AJ2788541和余杭分离物 fAJ306288)基因组3末端和CP基因的核苷酸序列与氨基酸序列分 别进行了比较. 关键词:莴苣花叶病毒;北京分离物:3端基因组片段;cDNA克隆和序 列分析 中图分类号:S432.1文献标识码:A SequenceAnalysisofthe3TerminalRegionoftheGenomeofLettucemosaicvirusBeijingIsolate ShangQiaoxia,XiangHaiying~,HanChenggui,LiDawei.,YuJialin (DepartmentofPlantScienceandTechnology,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206;2DepartmentofPlant PathologyandStateKeyLaboratoryforAgrabiotechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094) Abstract:The3terminalgenomic1620nucleotidesoftheLettucemosaicvirusBeijingisolate(LMV-BJ) fromChinawasdetermined(theGenBankaccessionnumberisEF423619).Thesequencestartedwithina singleopenreadingframewhichwasexpectedtoencodeapartoftheC-terminusoftheNIbproteinof190 aminoacidsby574nucleotides,completecapsidprotein(CP)of277aminoacidsencodedby834 nucleotidesandfollowedbya3untranslatedregion(UTR)of209nucleotides. Thenucleotideandamino acidsequenceidentityof3terminalregionsandcpgeneamongLMV—BJand otherfivepreviously reportedisolatesfromFranceO(X97704),FranceE(X97705),USA(X65652 ),Brazil(AJ278854),Yuhang (AJ306288)werecompared. Keywords:Lettucemosaicvirus,Beijingisolate,3terminalgenomicregion, Cloningandsequencing 莴苣花叶病毒fLettucemosaicvirus,LMV)属 马铃薯Y病毒科,马铃薯Y病毒属,可由蚜虫和种 子传播【?】.病毒粒子为弯曲线状,核酸为单分子正 义ssRNA.国外有关LMV的研究较早[21,目前美 国,巴西和法国等地分离物的全序列或3端的部分 序列已经被报道.中国自1984年夏俊强等报道了 LMV在中国山东省茎用莴苣上普遍发生后【,】,研究 人员相继报道了中国陕西省关中地区,江苏省南京 市和浙江省杭州市,余杭市等地分离到LMV,并陆 续开展了对LMV的生物学特性,血清学关系,抗病 性和分子生物学等方面的研究.目前对于中国北 京地区发生的LMV的研究还未见报道.笔者报道了 LMV北京分离物(LMV—BJ13末端的核酸序列,并 将其序列与其他LMV分离物进行比较分析. 基金项目:国家973 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 资助项(2006CB101903),北京农学院青年科学基金项I~I(06-ZD-ZK-02). 第一作者简介:尚巧霞,女,1975年出生,植物病理学专业,讲师,主要从事植物病害生物防治和植物病毒学研究.通信地址:102206北京市德胜门外 朱辛庄北京农学院植物科学技术系,E-mail:shangqiaoxia@bac.edu.ca. 通讯作者:韩成贵,教授,主要从事植物病毒学研究.Tel:010—62733336,E—mail:haIlchenggui@eau.edu.cn. 收稿日期:20o7—03—07,修回日期:2007—04—23. 中国蓉爹c墨搪第23卷第7期2007年7月 hllp://www?c踮b?.rg.cn. 89. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1毒源LMV毒源采自北京市郊菜地 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现花 叶,矮化症状的莴苣fLactucasativa1植株,取发病 叶片一20?保存备用. 1.1.2载体与菌株pMD18一T载体试剂盒购自 TaKaRa公司,大肠杆菌DH5ct由本实验室保存. i.I-3酶及试剂M—MLV反转录酶,RNase抑制剂 (HPRI)购自Promega公司;TaqDNA聚合酶购自上 海生工公司;AgaroseGelDNAPurificationKit购自 TaKaRa公司;其它化学试剂均为国产分析纯. 1.2方法 1.2.1植物总RNA提取取显症叶片0.5g加液氮研 磨成粉末,置于1.5ml的离心管中,于组织融化前 加入600~1酚/仿和600~1RNA抽提缓冲液,振荡 2min,4~C条件下,12000rpm离心5rain,取上清, 加入5001xl酚/仿抽提后,加入等体积的4mol/L的 LiC1,4~C沉淀4h以上,4~C条件下,12000rpm离心 15min,沉淀用70%的乙醇洗涤两次,真空抽干,溶 于20lDEPC处理灭菌水中,一20?保存备用. 1.2.2RT—PCR扩增目的片段在30l反应体 系中加入10lDEPC水,4pA5xbuffer,31xldNTPs (5mmol/1),lpAM—MLV反转录酶(200U/~1),1l RNase抑带0剂(40U/~1),2.0l(0.11)互补弓J物 HC511-18TR(5一GGATATCTGCAGGATCCAAGC(T) 18—3,共计39mersI并含有HindIII,BamHI, PstI和EcoRv酶切位点1,71xl病毒RNA提取液, 于37?反转录1.5h.在50lPCR扩增反应体系中 加入351xlddH20,51xl10xbuffer,71xldNTPs(5mmol/1), 1.OpATaqDNA聚合酶(5U/~1),1.0l~l(0.1lxg/ix1)正向引 物PYNB—F(5一GG(A/G/C)AA(T/C)AA(T/C)AG(T/C)GG (A/G/C1CA(A/G)CC一3,与马铃薯Y属病毒NIbC一端 保守区域相对应1,1.O~g(O.1ixg/ixL)反向引物HC511一 BHR(5一GGATATCTGCAGGATCCAAGC一39,2pA反转 录产物.扩增条件为:95?预变性4min,95?变性 30s,47?退火90s,72?延伸2rain,30个循环,最后 72?延伸10min.反应扩增产物经1%琼脂糖凝胶电 泳检测. 1.2.3PCR产物回收及克隆PCR产物经Tris饱和 酚/仿抽提纯化,将纯化的PCR产物连接到pMD18一 T载体上,转化大肠杆菌DH5ct,在含Amp/X—gal的 LB平板上随机挑取白色菌落接到含Amp的LB液体 培养基中,碱裂解法小量提取质粒,经PCR筛选得 阳性克隆. 1.2.4序列测定和分析比较挑取阳性克隆的菌种 接到2mLLB(含50g/mlAmp)液体培养基中,于 摇床中37oC150rpm振荡培养过夜.取1.5ml菌液送 交北京优博基因科技有限公司进行序列测定.利用 DNAMAN序列分析软件进行分析,并与国外已报 道序列进行序列比较.用于序列比较的LMV分离物 包括法国分离物fFrO,X97704;FrE,X97705),美 国分离物fUSA,X65652),巴西分离物fBr, AJ2788541和余杭分离物(YH,AJ306288).试验于 2006年9月一2007年1月在中国农业大学植物病理 学国家重点学科”211”实验室以及植物病毒分子生 物学实验室进行. 表1不同LMV分离物基因组3末端核苷酸(对角线下方)与氨基酸 序列同源性(对角线上方) 注:FrO,法国分离物0(X97704);FrE,法国分离物E(X97705);USA,美国 分离(X65652);Br,巴西分离(AJ278854);YH,余杭分离(AJ306288);BJ,北 京分离物(EF423619). 2结果与分析 2.1LMV3基因组片段的RT—PCR扩增与克隆 以提取的植物总RNA为模板进行RT—PCR扩 增,获得了约1.6kb目的片段.将纯化的RT—PCR 产物克隆到DMD18一T载体上,经PCR和酶切鉴定 证实为含有目的外源片段的阳性克隆(图略). 2.2序列测定及分析比较 通过对所克隆的cDNA进行序列分析结果表明, 获得了LMV—BJ3端1620核苷酸序列,包括部分 NIb基因,完整的cP基因序列和3非编码区序列. 所获片段含有NIb3端部分基因574nt,编码NIbC一 端190个氨基酸;CP基因全长834nt,编码一个由 ? 90? ChineseAgriculturalScienceBulletinVo1.23No.72007July 277个氨基酸组成的分子量约为30kDa的结构蛋白, 3非编码区含有209nt包括Poly.笔者测定的 LMV—BJ序列已经提交到GenBank(登录号为 EF423619). 比较不同LMV分离物基因组3末端核苷酸与氨 基酸序列(见表D,结果表明:LMV—BJ基因组3, 末端与法国分离物OfFrO,X977041,法国分离物E (FrE,X97705),美国分离物(USA,X65652),巴西 分离物(Br,AJ278854)和余杭分离物(YH, AJ3062881核苷酸序列同源性分别为97.8%, 94.1%,97.8%,96.7%和97.8%,氨基酸序列同源 性分别为97.2%,95.4%,89.5%,96.5%和97.0%, 其中LMV—BJ与LMV—FrE基因组3末端核苷酸序列 差异最大,而氨基酸序列与LMV—USA的差异最大. 比较不同LMV分离物CP基因的序列可知(见表 2),LMV—BJ与Fr(),FrE,USA,Br和YH核苷酸 序歹0同源性分别为98.1%,96.8%,98.1%,96.9% 和98.0%,氨基酸序列同源性分别为99_3%, 表2不同LMV分离物CP基因核苷酸(对角线下方)与氨基酸序列同 源性(对角线上方) 注:FrO,法国分离物0(X97704);FrE,法国分离物E(X97705);USA,美国 分离(X65652);Br,巴西分离(AJ278854);YH,余杭分离~(AJ306288):BJ, 北 京分离~(EF423619). 98.6%,99.3%,99.3%3199.6%.不同LMV分离物 CP基因氨基酸序列同源性均高于98%,说明这几 个分离物之间具有很近的亲缘关系. 3讨论 LMV属马铃薯Y病毒属,最早由美国在1921 年报道,目前已经分布于世界各地,自然寄主主要 有莴苣,豌豆等.莴苣是中国种植面积较大的蔬菜 之一,莴苣感染LMV后,最初表现明脉,斑驳花 叶,随后叶片上通常出现褐色坏死斑点,叶形皱缩, 整株矮化,造成严重危害【lo】.尽管笔者对中国不同 地区的莴苣花叶病毒进行了一定的研究,但对于不 同分离物是否存在致病性差异未见报道.为进一步 研究LMV的基因功能和致病分子机理,有必要在已 有研究基础上对中国不同地区LMV分离物的分子变 异和致病性分化等问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 进行深入研究. 参考文献 [1】Krause—SakateR,FakhhH,PeypelutM,eta1.Anaturallyoccur- ringrecombinantisolateofLettucemosaicvirus.Archivesofvirology, 2004,149:191-197. 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